m BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHẠM NGỌC QUẾ NGHIÊN CỨU MỘT s ố TÁC DỤNG Dược LÝ CỦA HỖN HỢP COUMARIN TOÀN PHẦN CHIẾT TÁCH TỪ KHƯƠNG HOẠT (NOTOPTERYGIUMINCISƯM TING EX H. T. CHANG HỌ HOA TÁN APIACEAE) ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1998- 2003 ) Người hướng dẫn : PGS.TS. Mai Tất Tô TS. Vũ Thị Trâm Nơi thực : Bộ môn Dược Lý Bộ môn Dược Liệu Thời gian thực hiện: 2/20003 - 5/2003. LỜI CAM ƠN Trong trình thực khoá luận tốt nghiệp, dã nhận dược hướng dẫn giúp đõ tận tình : PCS.TS. Mai Tất Tố. PGS.TS. D ế Thị Thuấn. TS. Vũ Thị Trầm. DS. Nguỵễũ Quỷnh Chi. Tôi xin b ả / tổ lòng biết ơn sâu sắc tói thẩỵ cô hướng dẫn tập th ể thổ/ cô giáo kỹ thuật viên ổ hai môn Dược lực Dược liệu. Dồng thời xin cảm ơn ban giấm hiệu cốc phòng chức nầng trường đại học Dược Hà Nội dã tạo diều kiện cho hoàn thành khoá luận nả/. Cuối cùng, xin dược gửi lời cảm ơn đến gia đỉnh, bạn b è khu/êh khích, dộng viên suốt thờigian vừa qua. Hà Nội tháng năm 2003 Sinh viên PUfK ẠíỷOù Q aí MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỂ 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. Vị thuốc khương hoạt 1.1.1. Đặc điểm thực vật 1.1.2. Đặc điểm vị thuốc 1.1.3. Thu hái, chế biến 1.1.4. Thành phần hoá học 1.1.5. Tác dụng, công dụng 1.2. Sơ coumarin tác dụng dược lý chúng 1.2.1. Sơ vê coumarin 1.2.2. Tác dụng dược lý nhóm chất coumarin 1.2.3. Coumarỉn có khương hoạt tác dụng dược lý nghiên cứu 2. PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 11 2.1. Nguyên vật liệu, động vật thí nghiệm phương pháp nghiên 11 V cứu 2.1.1. Nguyên vật liệu. 11 2.1.2. Động vật thí nghiệm. 11 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 11 2.1.3.1. Chiết tách hỗn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương 11 hoạt 2.1.3.2. Thử số tác dụng sinh hoc hổn hợp coumarin toàn phần 12 chiết tách 2.2. Thực nghiệm, kết nhận xét. 13 2.2.1. Chiết tách hổn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương 13 hoạt 2.2.1.1. Chiết tách 13 2.2.1.2. Các phản ứng định tính sắ kỷ lớp mỏng 15 2.2.2. Thử sơ số tác dụng dược lý hỗn hợp coumarin toàn 17 phần chiết tách từ khương hoạt 22.2.1 .Tác dụng chống loạn nhịp tim 17 2.2.2.2. Tác dụng chống viêm cấp 21 2.2.2.3. Tác dụng chống viêm mạn 26 2.2.2.4.Tác dụng giảm đau 29 3. PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 36 3.1. Kết luận 36 3.2. Đê nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỂ Những sản phẩm làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên đa dạng phong phú. Gắn liền với lịch sử phát triển loài người nguồn gốc tự nhiên sản phẩm làm thuốc mở rộng từ thực vật, động vật, khoáng vật đến vi nấm, vi khuẩn, mà sử dụng ngày tinh chất hơn. Nhiều thuốc phát dựa thuốc hay vị thuốc cổ truyền khẳng định tính ưu việt tác dụng điều trị qua thời gian tồn morphin, quinine, artemisinin, ephedrin. Phát huy y học cổ truyền kinh nghiệm dùng thuốc dân gian, việc nghiên cứu sàng lọc sâu nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên nhằm làm sáng tỏ tác dụng hoạt chất, tiến tới việc nghiên cứu để tạo chế phẩm hướng dần khẳng định. Khương hoạt vị thuốc sử dụng y học cổ truyền để điều trị bệnh cảm lạnh, đau đầu, đặc biệt điều trị phong tê thấp. Nhiều công trình nghiên cứu khẳng định làm sáng tỏ số tác dụng điều trị vị thuốc tác dụng giảm đau, tác dụng chống viêm, tác dụng chống ung thư. Ngoài theo nhóm tác giả Trung Quốc nước sắc khương hoạt có tác dụng chống loạn nhịp tim. Để góp phần tìm hiểu hoạt chất khương hoạt tiến tới sử dụng dược liệu ngày tốt tiến hành đề tài: “Nghiên cứu số tác dụng dược lý hỗn hợp coumarin toàn phần chiết tách từ khương hoạt (Notopterygium incisum Ting ex H.T. Chang)” với mục tiêu sau: - Chiết tách hỗn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương hoạt - Thử sơ số tác dụng dược lý hỗn hợp coumarin toàn phần: Tác dụng chống viêm cấp, tác dụng chống viêm mạn, tác dụng giảm đau tác dụng chống loạn nhịp tim. PHẦN : TỔNG QUAN 1.1. VỊ thuốc khương hoạt 1.1.1. Đặc điểm thực vật Vị thuốc khương hoạt chế biến từ rễ thân rễ phơi khô hai loài: Notopterygium incisum Ting ex H.T. Chang (Khương hoạt) Notopterygium forbesii Boiss (Khương hoạt rộng) Họ hoa tán Apiaceae [4] Khương hoạt lưu hành thị trường Việt Nam chế biến từ rễ thân rễ phơi khô khương hoạt (N. insisum) [7]. Theo Đỗ Tất Lợi [5] khương hoạt sống lâu năm, toàn có mùi thơm đặc biệt, thân rễ to khô, có đốt. Thân cao từ 0,5 - lm không phân nhánh, thân phía có màu tím. Lá mọc so le, kép lông chim, phiến chia thuỳ, mép có cưa tù, mặt màu tím nhạt, mặt màu xanh nhạt, phía cuống phát triển thành bẹ ôm lấy thân. Hoa nhỏ, màu trắng, lập thành hình tán kép. Quả bế đôi hình thoi dẹp, màu nâu đen, hai mép lưng phát triển thành dìa. 1.1.2. Đặc điểm vị thuốc Dược điển Việt Nam III [4] mô tả hình thái vị thuốc khương hoạt: Thân rễ hình trụ, cong queo, dài - 13 cm, đường kích 0,6 - 2,5 cm, đầu rễ có sẹo gốc thân cây. Mặt màu nâu đến nâu đen. Nơi bị tróc vỏ màu vàng, khoảng đốt ngắn, có vòng mấu nhỏ gần liền tựa hình tằm (quen gọi Tàm khương), khoảng đốt kéo dài dạng đốt tre (quen gọi Trúc tiết khương). Trên đốt có nhiều sẹo rễ dạng điểm dạng bướu vẩy màu nâu. Thể nhẹ, chất giòn xốp, dễ bẻ gẫy. Mặt bẻ không phẳng, có nhiều kẽ nứt. vỏ màu từ vàng nâu đến nâu tối, có chất dầu, có điểm chấm dầu màu nâu. Gỗ màu trắng vàng, tia ruột xếp theo hướng xuyên tâm rõ. Lõi (ruột) màu vàng đến vàng nâu. Mùi thơm, vị đắng cay. ẢNH 1:VỊ thuốc khương hoạt (Notopterygium incỉsum Ting ex H.T. Chang) 1.1.3. Thu hái, chế biến Trồng hai đến ba năm thu hoạch. Thường thu hoạch vào mùa thu, đào về, rửa sạch, làm mềm, cắt thành miếng dày, phơi sấy khô. 1.1.4. Thành phần hoá học Một số nghiên cứu cho thấy khương hoạt có tinh dầu, coumarin phytosterol, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, acid amin số thành phần khác falcarindiol, ferulat, methylcafeic este, pregnenolone [7, 25]. 1.1.5. Tác dụng, công dụng Theo y học cổ truyền [3] khương hoạt xếp vào nhóm thuốc tân ôn giải biểu: Vị cay, tính ấm, quy kinh bàng quang, can, thận có tác dụng tán hàn giải biểu dùng cảm mạo, phong hàn, sốt mồ hôi, đau đầu, toàn thân đau mỏi, có tác dụng trừ thấp, thống để điều trị bệnh phong thấp. Đặc biệt khương hoạt có tác dụng tốt chứng đau nhức xương cốt, thần kinh từ lưng trở lên. Theo số tác giả Trung Quốc [34] nước sắc khương hoạt có tác dụng chống loạn nhịp tim. Các tác giả Nhật Bản [32] cho biết dịch chiết methanol thân rễ khương hoạt có tác dụng ngăn cản hình thành sản phẩm ôxy hóa. 1.2. Sơ vê coumarỉn tác dụng dược lý chúng 1.2.1. Sơ coumarin Benzo a-pyron chất coumarin đơn giản tồn thực vật biết đến từ năm 1820 Dipteryx odoreta Willd thuộc họ Đậu (Fabaceae) [1]. Cây mọc Brazil, có trồng Venezuela có tên địa phương "Coumarou" nhóm chất có tên coumarin. Các chất coumarin tan tốt cồn 90° dung môi hữu ethylacetat, tan nước nóng, không tan nước lạnh . Cho đến người ta phát khoảng 200 chất coumarin khác nhau, phân thành nhóm chính: Nhóm 1: Coumarin đơn giản coumarin có nhân Benzo apyron gắn với nhóm khác nhóm hydroxy, alkoxy, alkyl . Nhóm 2: Nhóm furanocoumarin coumarin có vòng furan liên kết với nhân Benzo- a- pyron vị trí 6, vị trí 7, 8. Nhóm 3: Nhóm pyranocoumarin coumarin có vòng pyran liên kết với nhân Benzo- a-pyron vị trí 5, 6, vị trí 6, vị trí 7, 8. 1.2.2. Tác dụng dược lý nhóm chất coumarin Nhóm chất coumarin có nhiều tác dụng dược lý : Tác dụng giảm đau, hạ nhiệt, tác dụng chống viêm, tác dụng chống đông máu, tác dụng chữa bệnh vẩy nến, tác dụng kháng khuẩn, tác dụng chống ung thư . [8, 14, 20, 22, 23, 25, 26]. Dưới số tác dụng dược lý nhóm chất coumarin biết đến: I.22.1. Tác dụng chống đông máu Đây tác dụng kinh điển dẫn chất coumarin acenocoumarol, dicoumarol, ethylbicoumacetat, warfarin. Tác dụng biết đến từ năm 1941, sau Link tìm chất dicoumarol. Các dẫn chất coumarin chống đông máu tác dụng theo chế kháng vitamin K, chúng ức chế tổng hợp số yếu tố đông máu quan trọng yếu tố II (prothrombin), (proconvertin), IX (PTC), X (Stuart) gan nên cản trở trình đông máu. Sau dùng chất chống đông kể trên, nồng độ yếu tố II, VII, IX, X huyết tương giảm hẳn trình đông máu bị kéo dài. 1.2.2.2. Tác dụng chống viêm Quá trình viêm phản ứng chỗ mang tính bảo vệ với huy động yếu tố tế bào, thể dịch nhằm loại trừ khu trú ổ viêm. Phản ứng viêm nhận biết bốn triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau [6] Rất nhiều chất coumarin ghi nhận có tác dụng chống viêm mô hình thử nghiệm gây viêm carrageenin. Carrageenin tác nhân gây viêm theo chế kích thích giải phóng số yếu tố trung gian hoá học trình viêm histamin, serotonin bradykinin prostaglandin. Trong thí nghiệm khác người ta phát tác dụng chống viêm coumarin umbelliferone theo chế giống thuốc chống viêm phi steroid với chất gây viêm carrageenin tác dụng kéo dài sau giờ, thời gian mà carrageenin có tác dụng mạnh [22]. Coumarin có tác dụng chống phù nề thử nghiệm gây phù chân chuột dextran. Theo Garcia-Argaez [14] coumarin có tác dụng tác nhân gây viêm: Liều thấp psoralen imperatorin có tác dụng chống viêm liền cao chúng lại có tác dụng gây viêm . 1.2.2.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm nhóm chất coumarin nhiều tác giả ghi nhận. Điển hình công trình nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dịch chiết Pealargonium sidoides Pealargonium reniforme hai tác giả người Đức Kayser Kolodziej [17]. Bằng phương pháp thạch pha loãng hai tác giả cho thấy số thành phần coumarin dịch chiết có tác dụng kìm khuẩn. Kết tóm tắt bảng Bảng : Tác dụng kháng khuẩn coumarỉn Coumarin Tên vi khuẩn Staphylococus aureus Streptococus pneumoniae 6,8-dihydroxy-5,7dimethoxycoumarin Scopoletin Umekalin 6,8 -dihydroxy-5,7dimethoxy coumarin 5,6,7-trimethoxy coumarin Umekalin Escherichia coli Scopoletin Haemophilus influenzae 5,6,7-trimethoxy coumarin Klebsiella pneumoniae Scopoletin Proteus mirabilis Scopoletin Pseudomonas aeruginosa Scopoletin [...]... coumarin toàn phần có trong khương ho t 16 2.2.2 Thử sơ bộ m t số t c dụng dược lý của h n h p coumarin toàn phần chi t t ch t khương ho t 2.22.1 T c dụng chống loạn nhịp tim Để đánh giá t c dụng chống loạn nhịp tim của h n h p coumarin toàn phần, chúng t i tiến h nh thí nghiệm đo điện tim thỏ bằng máy Cardiofax của Nh t Bản Thỏ thí nghiệm cả hai giống đực và cái khoẻ mạnh, cân nặng t 1,8 đến 2,3 kg chia... t nh coumarin k t h p với sắc ký lớp mỏng để chứng minh sản phẩm chi t t ch được là h n h p coumarin toàn phần 2.1.3.2 Thử m t số t c dụng dược lý của h n h p coumarin toàn phần chi t t ch được 2.1.3.2.1 T c dụng chống loạn nhịp tim Tiến h nh thí nghiệm trên 2 lô thỏ : M t giờ sau khi cho thỏ uống thuốc, gây loạn nhịp bằng dung dịch BaCl2 2% tiêm t nh mạch vành tai Theo dõi điện tim của thỏ trên ba chuyển... nhóm ch t coumarin được chi t t khương ho t Notopterygium incisum còn có t c dụng chống ung thư Công trình nghiên cứu này đã chi t xu t, phân lập các ch t coumarin t khương ho t và thử ho t lực chống ung thư của t ng ch t, có so sánh với m t số ch t như 5 Fluorouracil, Etoposide, Adriamycin cụ thể k t quả đã được t c giả ghi nhận ở bảng 3 9 Bảng 3 : T c dụng chông ung thư của coumarin chi t t ch t . .. được tiến h nh trên chu t nh t trắng, gây quặn đau bằng acid acetic 1% Theo dõi và ghi số lần quặn đau của chu t trong t ng 5 ph t m t đến ph t thứ 30 - Phương pháp mâm nóng: Thí nghiệm được tiến h nh trên chu t nh t trắng, theo dõi thời gian chu t phản ứng với nhi t độ trước và sau khi uống thuốc 2.2 Thực nghiệm, k t quả và nhận x t 2.2.1 Chi t t ch h n h p coumari t toàn phần t vị thuốc khương ho t. .. lọc (và bình gạn, lắc nhiều lần với ethylacetat cho đến khi lớp nước không còn màu với thuốc thử diazo Gộp dịch chi t ethylacetat, rửa lại bằng nước c t, c t thu h i dung môi thu được 5,8 (g) h n h p coumarin toàn phần Vậy t lệ phần trăm h n h p coumarin toàn phần thu được t dược liệu khô, theo phương pháp chi t t ch của chúng t i là: 5,80/500 X 100% = 1,16% 13 H nh 1: Sơ đồ quy trình chi t t ch h n... 30 Thời gian (ph t) Biểu đồ 3: Sô'lần quặn đau trung bình của chu t nh t trong 5 ph t m t Ghi chú: Lô 1: Lô chứng uống nước muối sinh lý 0,9% Lô 2 : Lô thử uống h n dịch coumarin toàn phần 0,2% pha trong nước muối sinh lý 0,9% Nhân x t: H n dịch coumarin toàn phần chi t t ch t khương ho t có t c dụng giảm đau trên chu t nh t với liều 46mg/kg/ngày t ơng đương với liều khương ho t 4g/kg/ngày 31 * Phương... chiếu với dịch chi t EA đối chiếu với dịch chi t cồn ở bước sóng dịch chi t cồn ở bước sóng ( = 254 nm) ( Ả = 366 nm) Nhân x t: K t quả sắc ký lớp mỏng cho thấy số v t ch t có trong dịch chi t ethylacetat hoàn toàn t ơng ứng với số v t ch t có trong dịch chi t cồn ban đầu cả về màu sắc lẫn giá trị Rf, k t h p với k t quả của các phản ứng định t nh đã khẳng định sản phẩm chi t t ch được là h n h p coumarin. .. ch t coumarin [28] Bảng2 : M t sô t c dụng dược lý của coumarin đã được ghi nhận T c giả T c dụng dược lý ị T c dụng chống viêm irivitro và inịivo T c dụng ức chế 5-lipoxygenase inịvitro T c dụng giảm đau T c dụng chống loạn nhịp tim T c dụng chống đông máu T c dụng kháng khuẩn T c dụng kháng nấm T c dụng chống ung thư inỊdtro T c dung chống ký sinh trùng s t r t inỵivo và inyitro T c dụng chống virut... khoẻ mạnh, có trọng lượng 130-150 (g) do Viện vệ sinh dịch t cung cấp - Chu t nh t trắng chủng Swiss trọng lượng t 20 - 22 (g) do Viện vệ sinh dịch t cung cấp 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 2.1.3.1 Chi t t ch h n h p coumarin toàn phần t vị thuốc khương ho t Chúng t i đã sử dụng phương pháp chi t nóng bằng cồn 90° sau đó t ch bằng dung môi ethylacetat [7, 25] 11 Sau đó dùng các phản ứng định t nh... định đây là m t trong số những thành phần có t c dụng chống viêm của khương ho t Theo m t số t c giả người Đức [23] thì notopterol, isoimperatorin, và phellopterin là 3 thành phần coumarin có t c dụng ức chế 5- Lipoxygenase (5 LOX) và cyclooxygenase (COX) là các enzym xúc t c quá trình chuyển acid arachidonic thành prostaglandin và leucotrien (các ch t trung gian hoá h c gây viêm và đau) Theo Nguyễn H i . Y T TRƯỜNG ĐẠI H C Dược H NỘI PHẠM NGỌC QUẾ NGHIÊN CỨU M T s ố T C DỤNG Dược LÝ CỦA H N H P COUMARIN TOÀN PHẦN CHI T TÁCH T KHƯƠNG HO T (NOTOPTERYGIUMINCISƯM TING EX H. T. CHANG H HOA T N. dụng dược liệu này ngày m t t t h n chúng t i tiến h nh đề t i: Nghiên cứu m t số t c dụng dược lý của h n h p coumarin toàn phần chi t t ch t khương ho t (Notopterygium incisum Ting ex H. T. . H. T. Chang) ” với các mục tiêu sau: - Chi t t ch h n h p coumarin toàn phần t vị thuốc khương ho t - Thử sơ bộ m t số t c dụng dược lý của h n h p coumarin toàn phần: T c dụng chống viêm cấp, t c