BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY SÀI ĐẤT (WEDELIA CHINENSIS M.) TRỒNG Ở TỈNH VĨNH LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP GIANG MINH TÚ MSSV: 3104000 LỚP: VSVH - K36 Cần Thơ, Tháng 11 / 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY SÀI ĐẤT (WEDELIA CHINENSIS M.) TRỒNG Ở TỈNH VĨNH LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP GIANG MINH TÚ MSSV: 3104000 LỚP: VSVH - K36 Cần Thơ, Tháng 11 / 2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Giang Minh Tú DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày …… tháng …… năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại học này, cố gắng thân, nhận hướng dẫn, ủng hộ, giúp đỡ nhiều người. Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - trường Đại học Cần Thơ, tất quý thầy cô Viện NC&PT Công nghệ Sinh học tất quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức chuyên môn cho suốt trình học tập trường. PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp – phó trưởng môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức tạo điều kiện cho suốt thời gian thực đề tài. Cán phòng thí nghiệm Vi sinh vật – Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, cán phòng thí nghiệm Thực vật – Bộ môn Sinh học – Khoa Sư Phạm – Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài. Xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, khuyến khích, hỗ trợ cho suốt trình học tập thực đề tài . Tôi xin kính chúc quý thầy cô bạn sinh viên dồi sức khoẻ công tác tốt. Cần Thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2013 Giang Minh Tú Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Sài đất tên khoa học Wedelia chinensis (Osbeck) Merr,thuộc họ Cúc (Asteraceae) biết đến loại dược liệu, thường sử dụng vị thuốc nam. Từ mẫu Sài đất trồng tỉnh Vĩnh Long phân lập 24 dòng vi khuẩn môi trường PDA đặc. Các dòng vi khuẩn phân lập có dạng que ngắn, que dài, cầu đôi cầu, tất dòng có khả chuyển động đa số vi khuẩn Gram âm. Tất dòng vi khuẩn có khả tổng hợp NH4+ IAA sau ngày tăng sinh môi trường Nfb. Mười dòng vi khuẩn có khả hòa tan lân khó tan. Khảo sát khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn phân lập dòng vi khuẩn Escherichia coli Aeromonas hydrophila, có 7/24 dòng vi khuẩn có khả kháng hiệu Escherichia coli 6/24 dòng có khả kháng Aeromonas hydrophila. Tuyển chọn dòng vi khuẩn có hiệu kháng khuẩn tốt tiến hành định danh, theo kết giải trình tự dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis Klebsiella pseumoniae. Từ khóa: sài đất, kháng khuẩn, tổng hợp amonium - IAA, vi khuẩn nội sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT . LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i MỤC LỤC .ii DANH SÁCH BẢNG . vi DANH SÁCH HÌNH .vii TỪ VIẾT TẮT . ix CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề . 1.2 Mục tiêu đề tài CHƢƠNG II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU . Tổng quan tỉnh Vĩnh Long . 2.1 2.1.1 Vị trí địa lý . 2.1.2 Điều kiện tự nhiên Địa hình . a. b. Thủy văn Cơ cấu đất c. 2.2 Giới thiệu Sài đất . 2.3 Công dụng Sài đất y học . 2.3.1 Bảo vệ gan 2.3.2 Kháng khuẩn – kháng nấm . 2.3.3 Giảm căng thẳng 2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh 2.5 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp . 10 2.5.1 Vi khuẩn Bacillus . 10 2.5.2 Vi khuẩn Pseudomonas 13 2.5.3 Vi khuẩn Azospirillum 15 2.5.4 Vi khuẩn Klebsiella 15 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.5.5 Vi khuẩn Azotobacter . 15 2.5.6 Vi khuẩn Enterobacter . 16 2.5.7 Vi khuẩn Burkholderia . 16 2.6 Một số vi khuẩn gây bệnh 17 2.6.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) 17 2.6.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophyla (A .hydrophila) . 19 Tình hình nghiên cứu Sài đất nước . 21 2.7 2.7.1 Trong nước . 21 2.7.2 Ngoài nước . 22 CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 Phương tiện nghiên cứu 23 3.1 3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực . 23 3.1.2 Dụng cụ - thiết bị 23 3.1.3 Vật liệu . 25 3.1.4 Hóa chất . 25 Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh . 25 a. b. Môi trường khảo sát khả hòa tan lân 25 Môi trường khảo sát khả tổng hợp NH4+ 26 c. d. Môi trường khảo sát khả kháng khuẩn . 26 e. Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn 27 f. Hóa chất trích Deoxyribo Nucleic Acid 27 g. Hóa chất thực phản ứng Polymerase Chain Reaction . 28 Phương pháp nghiên cứu 29 3.2 3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh 29 3.2.2 Quan sát hình dạng, kích thước khả chuyển động vi khuẩn 30 3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh . 31 3.2.4 Xác định khả tổng hợp NH4+ . 32 a. Nguyên tắc . 32 b. Tiến hành thí nghiệm: 33 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Định lượng đạm vi khuẩn sinh ngày 2, 4, 6, (sau chủng) 33 c. 3.2.5 Xác định khả hòa tan lân 34 3.2.6 Xác định khả tổng hợp Indole–3–Acetic Acid . 34 a. Chuẩn bị . 34 b. Hóa chất . 34 Phương pháp 35 c. 3.2.7 Thử nghiệm khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn 35 3.2.8 Nhận diện số dòng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu . 35 3.2.9 Xử lý số liệu 35 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 38 4.1 Phân lập vi khuẩn 38 4.2 Đặc điểm khuẩn lạc 24 dòng vi khuẩn 40 4.3 Hình dạng khả chuyển động vi khuẩn. . 43 4.4 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh . 44 4.5 Kết khả tổng hợp NH4+ 46 4.6 Kết khả hòa tan lân. 51 4.7 Kết khả tổng hợp Indole–3–Acetic Acid . 53 4.8 Kết khảo sát khả kháng khuẩn. 57 4.8.1 Kháng Escherichia coli 57 4.8.2 Kháng Aeromonas hydrophila . 59 4.9 Kết nhận diện dòng vi khuẩn . 61 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 5.1 Kết luận . 64 5.2 Đề nghị . 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 77 Phụ lục Kết hàm lượng NH4+ dòng vi khuẩn Phụ lục Đường chuẩn NH4+ ngày đo . Phụ lục Kết thống kê hàm lượng NH4+ dòng vi khuẩn phân lập từ rễ Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Phụ lục Kết thống kê hàm lượng NH4+ dòng vi khuẩn phân lập từ thân . Phụ lục Kết thống kê hàm lượng NH4+ dòng vi khuẩn phân lập từ . Phụ lục Kết hàm lượng IAA dòng vi khuẩn Phụ lục Đường chuẩn IAA ngày đo Phụ lục Kết thống kê hàm lượng IAA theo trường hợp . Phụ lục Đường kính khuẩn lạc đường kính vòng sáng khảo sát khả kháng Escherichia coli dòng vi khuẩn phân lập . Phụ lục 10 Phân tích thống kê đường kính vòng vô khuẩn khảo sát khả kháng Escherichia coli dòng vi khuẩn . Phụ lục 11 Đường kính khuẩn lạc đường kính vòng sáng khảo sát khả kháng Aeromonas hydropila dòng vi khuẩn phân lập Phụ lục 12 Đường kính vòng vô khuẩn khảo sát khả kháng Aeromonas hydrophila dòng vi khuẩn. . Phụ lục 13 Phân tích thống kê đường kính vòng vô khuẩn khảo sát khả kháng A. hydrophila dòng vi khuẩn . Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Môi trường PDA. 25 Bảng 2: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999). 25 Bảng 3: Môi trường NFb (g/l) (Kirchhof ctv, 1997). 26 Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lượng 26 Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin . 27 Bảng 6: Môi trường LB (Lauria Betani) 27 Bảng 7: Thành phần chất phản ứng PCR 28 Bảng 8: Kết phân lập dòng vi khuẩn Sài đất . 39 Bảng 9: Kết đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập . 40 Bảng 10: Tỷ lệ phần trăm (%) đặc điểm khuẩn lạc. . 41 Bảng 11: Kết đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập 43 Bảng 12: Kết nhuộm Gram dòng vi khuẩn phân lập 44 Bảng 13: Kết khả hòa tan lân dòng vi khuẩn phân lập . 51 Bảng 14: Khả kháng E. coli dòng vi khuẩn phân lập được. . 57 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Level R1 R3 R5 R6 T1 T10 T2 N 3 3 3 Mean 11.762 9.381 7.857 8.905 10.000 9.476 9.571 Trường Đại học Cần Thơ Pooled StDev --------+---------+---------+---------+(--*--) (--*---) (--*---) (--*---) (--*---) (--*--) (---*--) --------+---------+---------+---------+8.4 9.6 10.8 12.0 StDev 0.459 0.218 0.378 0.330 0.286 0.297 0.247 Pooled StDev = 0.325 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R1 T1 T2 T10 R3 R6 R5 N 3 3 3 Mean 11.7619 10.0000 9.5714 9.4762 9.3810 8.9048 7.8571 Grouping A B B C B C C D D E Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.5885 Level R1 R3 R5 R6 T1 T10 T2 DF 14 20 SS 54.584 4.848 59.432 MS 9.097 0.346 N 3 3 3 R-Sq = 91.84% Mean 9.852 9.111 6.935 8.880 5.685 5.778 6.241 StDev 0.814 0.867 0.350 0.626 0.350 0.241 0.561 F 26.27 P 0.000 R-Sq(adj) = 88.35% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -------+---------+---------+---------+-(----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*---) (----*---) -------+---------+---------+---------+-6.0 7.5 9.0 10.5 Pooled StDev = 0.588 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R1 R3 R6 N 3 Mean 9.8519 9.1111 8.8796 Grouping A A A Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 R5 T2 T10 T1 3 3 6.9352 6.2407 5.7778 5.6852 Trường Đại học Cần Thơ B B C C C Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.3088 Level R1 R3 R5 R6 T1 T10 T2 N 3 3 3 DF 14 20 SS 51.7164 1.3353 53.0516 MS 8.6194 0.0954 R-Sq = 97.48% Mean 8.2743 4.5190 5.7848 7.9367 4.3924 4.0970 6.0380 StDev 0.3186 0.2532 0.2532 0.3797 0.2532 0.1934 0.4385 F 90.37 P 0.000 R-Sq(adj) = 96.40% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -----+---------+---------+---------+---(-*--) (-*--) (--*-) (--*-) (-*--) (-*--) (-*--) -----+---------+---------+---------+---4.5 6.0 7.5 9.0 Pooled StDev = 0.3088 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R1 R6 T2 R5 R3 T1 T10 N 3 3 3 Mean 8.2743 7.9367 6.0380 5.7848 4.5190 4.3924 4.0970 Grouping A A B B C C C Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Trƣờng hợp Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.5919 Level L1 L2 L3 R2 R4 R7 R8 T5 T6 DF 18 26 SS 115.524 6.306 121.830 MS 14.440 0.350 N 3 3 3 3 R-Sq = 94.82% Mean 2.6624 3.0476 4.6190 8.3889 8.9048 5.2381 6.6667 5.3333 7.2381 F 41.22 P 0.000 R-Sq(adj) = 92.52% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------(--*---) (--*---) (--*---) (---*---) (---*--) (--*---) (--*---) (---*--) (--*---) +---------+---------+---------+--------2.0 4.0 6.0 8.0 StDev 0.1934 0.2974 0.8611 1.1097 0.7331 0.3595 0.2974 0.2182 0.5017 Pooled StDev = 0.5919 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R4 R2 T6 R8 T5 R7 L3 L2 L1 N 3 3 3 3 Mean 8.9048 8.3889 7.2381 6.6667 5.3333 5.2381 4.6190 3.0476 2.6624 Grouping A A B B C C C D D Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.4757 Level N DF 18 26 SS 67.564 4.074 71.638 R-Sq = 94.31% Mean StDev Chuyên ngành Vi sinh vật học MS 8.446 0.226 F 37.32 P 0.000 R-Sq(adj) = 91.79% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ------+---------+---------+---------+--Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 L1 L2 L3 R2 R4 R7 R8 T5 T6 3 3 3 3 4.852 4.435 6.287 8.571 9.574 6.333 7.722 6.056 7.444 0.488 0.289 0.424 0.892 0.350 0.417 0.367 0.481 0.278 Trường Đại học Cần Thơ (--*---) (---*--) (--*---) (---*--) (---*--) (---*--) (--*---) (---*--) (---*--) ------+---------+---------+---------+--4.8 6.4 8.0 9.6 Pooled StDev = 0.476 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R4 R2 R8 T6 R7 L3 T5 L1 L2 N 3 3 3 3 Mean 9.5741 8.5714 7.7222 7.4444 6.3333 6.2870 6.0556 4.8519 4.4352 Grouping A B C C D D D E E Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.3913 Level L1 L2 L3 R2 R4 R7 R8 T5 T6 N 3 3 3 3 DF 18 26 SS 19.539 2.755 22.295 MS 2.442 0.153 R-Sq = 87.64% Mean 8.944 9.444 10.167 9.481 9.611 11.228 10.556 11.397 11.143 StDev 0.255 0.509 0.289 0.561 0.509 0.253 0.255 0.445 0.264 F 15.96 P 0.000 R-Sq(adj) = 82.15% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -----+---------+---------+---------+---(---*----) (---*----) (----*---) (----*----) (----*----) (---*----) (----*---) (----*----) (---*----) -----+---------+---------+---------+---9.0 10.0 11.0 12.0 Pooled StDev = 0.391 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 khuẩn T5 R7 T6 R8 L3 R4 R2 L2 L1 N 3 3 3 3 Mean 11.3966 11.2278 11.1435 10.5556 10.1667 9.6111 9.4815 9.4444 8.9444 Trường Đại học Cần Thơ Grouping A A A B B C C D D E E E E Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.5457 Level L1 L2 L3 R2 R4 R7 R8 T5 T6 DF 18 26 SS 123.296 5.360 128.656 N 3 3 3 3 R-Sq = 95.83% Mean 3.905 8.316 6.502 9.287 7.557 8.667 10.511 10.389 11.111 StDev 0.436 0.335 0.073 0.720 0.219 0.289 0.193 1.295 0.096 MS 15.412 0.298 F 51.76 P 0.000 R-Sq(adj) = 93.98% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -------+---------+---------+---------+-(--*-) (-*--) (--*--) (-*--) (-*--) (--*-) (--*--) (--*-) (-*--) -------+---------+---------+---------+-5.0 7.5 10.0 12.5 Pooled StDev = 0.546 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn T6 R8 T5 R2 R7 L2 R4 L3 L1 N 3 3 3 3 Mean 11.1111 10.5105 10.3889 9.2869 8.6667 8.3165 7.5570 6.5021 3.9048 Grouping A A A B B C C D D E F Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Trƣờng hợp Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.6419 Level L4 L5 L6 T3 T4 T7 T8 T9 DF 16 23 SS 49.323 6.592 55.915 MS 7.046 0.412 N 3 3 3 3 R-Sq = 88.21% Mean 7.000 8.905 8.738 8.714 9.762 5.476 7.619 5.905 StDev 1.030 0.360 0.193 0.286 0.297 0.675 1.164 0.297 F 17.10 P 0.000 R-Sq(adj) = 83.05% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ---------+---------+---------+---------+ (-----*----) (----*-----) (----*----) (----*----) (----*----) (-----*----) (----*----) (----*-----) ---------+---------+---------+---------+ 6.0 7.5 9.0 10.5 Pooled StDev = 0.642 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn T4 L5 L6 T3 T8 L4 T9 T7 N 3 3 3 3 Mean 9.7619 8.9048 8.7384 8.7143 7.6190 7.0000 5.9048 5.4762 Grouping A A A A B B C C D D E E Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.5171 Level L4 N DF 16 23 SS 41.315 4.278 45.593 MS 5.902 0.267 R-Sq = 90.62% Mean 7.889 StDev 0.419 Chuyên ngành Vi sinh vật học F 22.08 P 0.000 R-Sq(adj) = 86.51% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev --------+---------+---------+---------+(----*---) Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 L5 L6 T3 T4 T7 T8 T9 3 3 3 10.389 8.778 8.889 10.889 7.000 8.833 7.111 0.419 0.347 0.631 0.419 0.289 0.866 0.509 Trường Đại học Cần Thơ (---*---) (----*---) (---*---) (----*---) (----*---) (---*---) (---*----) --------+---------+---------+---------+7.5 9.0 10.5 12.0 Pooled StDev = 0.517 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn T4 L5 T3 T8 L6 L4 T9 T7 N 3 3 3 3 Mean 10.8889 10.3889 8.8889 8.8333 8.7778 7.8889 7.1111 7.0000 Grouping A A B B B C C D D D Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.3700 Level L4 L5 L6 T3 T4 T7 T8 T9 N 3 3 3 3 DF 16 23 SS 23.922 2.190 26.112 MS 3.417 0.137 R-Sq = 91.61% Mean 7.4907 5.8692 8.1429 8.1477 5.8692 6.4259 8.3241 6.2870 StDev 0.4243 0.2923 0.2474 0.4792 0.3654 0.4465 0.4465 0.0802 F 24.97 P 0.000 R-Sq(adj) = 87.94% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ------+---------+---------+---------+--(----*---) (----*---) (---*----) (---*----) (----*---) (---*----) (---*----) (----*---) ------+---------+---------+---------+--6.0 7.0 8.0 9.0 Pooled StDev = 0.3700 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn T8 T3 L6 N 3 Mean 8.3241 8.1477 8.1429 Grouping A A A Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 L4 T7 T9 T4 L5 3 3 7.4907 6.4259 6.2870 5.8692 5.8692 Trường Đại học Cần Thơ B C C C C Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.2677 Level L4 L5 L6 T3 T4 T7 T8 T9 DF 16 23 SS 29.3932 1.1464 30.5397 N 3 3 3 3 R-Sq = 96.25% Mean 4.0549 4.4352 6.5185 6.2407 4.7130 3.9705 5.9536 3.3376 StDev 0.1934 0.3495 0.2122 0.0802 0.1604 0.3867 0.1934 0.3867 MS 4.1990 0.0717 F 58.60 P 0.000 R-Sq(adj) = 94.60% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------(---*--) (--*---) (--*--) (--*---) (--*--) (---*--) (---*--) (--*---) +---------+---------+---------+--------3.0 4.0 5.0 6.0 Pooled StDev = 0.2677 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn L6 T3 T8 T4 L5 L4 T7 T9 N 3 3 3 3 Mean 6.5185 6.2407 5.9536 4.7130 4.4352 4.0549 3.9705 3.3376 Grouping A A B B C C D D E E F Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC ĐƢỜNG KÍNH KHUẨN LẠC VÀ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG SÁNG TRONG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG ESCHERICHIA COLI CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƢỢC Ngày STT Dòng vi khuẩn R6 Ngày Ngày ĐK khuẩn lạc (mm) ĐK vòng sáng (mm) ĐK khuẩn lạc (mm) ĐK vòng sáng (mm) ĐK khuẩn lạc (mm) ĐK vòng sáng (mm) 6,0 7,0 6,0 7,5 6,0 8,0 6,0 7,5 6,0 8,0 6,5 8,5 7,0 x 6,0 - 8,0 x 6,0 10 x 7,0 10 x 6,0 15 x 9,0 7,5 x 6,0 - 7,5 x 6,0 9,0 x 7,0 8,0 x 6,5 13,5 x 10 7,0 8,0 7,0 8,0 7,0 - 7,0 7,5 7,5 8,0 7,5 - 6,0 7,0 6,0 7,5 6,0 - 6,0 6,5 6,0 7,0 6,0 - 6,0 7,0 6,5 7,5 6,5 - 6,0 7,0 6,0 7,0 6,0 - 6,0 6,5 6,0 6,5 6,0 - 6,0 6,5 6,0 6,5 6,0 - 7,0 - 7,0 8,0 8,0 9,0 7,5 - 8,0 9,0 8,5 10 R8 L2 T7 T8 T9 T10 Ghi (-): không tạo vòng sáng. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 10 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG VÔ KHUẨN TRONG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E.COLI CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.2315 Level L2 R6 R8 T10 T7 T8 T9 N 2 2 2 DF 13 SS 2.7143 0.3750 3.0893 MS 0.4524 0.0536 R-Sq = 87.86% Mean 0.7500 1.2500 0.0000 0.0000 0.7500 1.0000 0.5000 StDev 0.3536 0.3536 0.0000 0.0000 0.3536 0.0000 0.0000 F 8.44 P 0.006 R-Sq(adj) = 77.46% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ------+---------+---------+---------+--(------*-----) (------*-----) (-----*-----) (-----*-----) (------*-----) (------*-----) (-----*------) ------+---------+---------+---------+--0.00 0.60 1.20 1.80 Pooled StDev = 0.2315 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R6 T8 L2 T7 T9 T10 R8 N 2 2 2 Mean 1.2500 1.0000 0.7500 0.7500 0.5000 0.0000 0.0000 Grouping A A B A B A B C C C Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.2409 Level L2 R6 R8 T10 T7 T8 T9 DF 13 SS 2.0446 0.4063 2.4509 MS 0.3408 0.0580 N 2 2 2 R-Sq = 83.42% Mean 0.7500 1.7500 1.3750 1.0000 1.2500 1.0000 0.5000 StDev 0.3536 0.3536 0.1768 0.0000 0.3536 0.0000 0.0000 F 5.87 P 0.017 R-Sq(adj) = 69.22% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev --------+---------+---------+---------+(------*-----) (------*------) (------*------) (------*-----) (------*------) (------*-----) (-----*------) --------+---------+---------+---------+0.60 1.20 1.80 2.40 Pooled StDev = 0.2409 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R6 R8 T7 T10 T8 L2 T9 N 2 2 2 Mean 1.7500 1.3750 1.2500 1.0000 1.0000 0.7500 0.5000 Grouping A A B A B C B C D B C D C D D Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.1890 Level L2 R6 R8 T10 T7 T8 T9 N 2 2 2 DF 13 SS 31.1786 0.2500 31.4286 MS 5.1964 0.0357 R-Sq = 99.20% Mean 0.0000 2.0000 4.2500 1.2500 0.0000 0.0000 0.0000 StDev 0.0000 0.0000 0.3536 0.3536 0.0000 0.0000 0.0000 F 145.50 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.52% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev --+---------+---------+---------+------(-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) --+---------+---------+---------+------0.0 1.5 3.0 4.5 Pooled StDev = 0.1890 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R8 R6 T10 T9 T8 T7 L2 N 2 2 2 Mean 4.2500 2.0000 1.2500 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 Grouping A B C D D D D Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 11 ĐƢỜNG KÍNH KHUẨN LẠC VÀ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG SÁNG TRONG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AEROMONAS HYDROPILLA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƢỢC Ngày STT Dòng vi khuẩn R4 Ngày Ngày ĐK khuẩn lạc (mm) ĐK vòng sáng (mm) ĐK khuẩn lạc (mm) ĐK vòng sáng (mm) ĐK khuẩn lạc (mm) ĐK vòng sáng (mm) 6,5 8,0 x 7,0 7,0 8,0 x 9,0 7,0 x 6,0 8,0 x 7,0 8,0 x 7,5 10 x 8,0 8,0 10 x 9,0 7,0 8,5 6,5 7,0 6,5 7,0 7,0 9,5 6,5 7,5 6,5 x 7,0 8,0 7,0 x 9,0 11 8,5 x 9,5 9,5 x 10 9,0 x 10 10 x 11,5 10 x 11 10,5 x 11,5 10,5 x 7,5 11 x 8,0 11 x 7,5 12 x 9,0 11 x 8,0 12 x 9,0 7,0 x 6,0 7,0 7,0 8,0 7,0 x 8,0 8,0 x 9,0 6,0 6,5 6,0 6,5 x 7,0 6,0 8,0 x 9,0 9,0 x 7,0 12 x 11 9,0 x 8,0 12 8,0 x 7,0 13 x 12 7,5 x 7,0 12 x 11 8,0 x 7,0 12 x 11 9,0 x 8,0 14 x 13 7,0 x 10 11 7,0 x 10 11,5 8,0 x 7,0 10 6,5 x 7,0 8,0 x 9,0 6,5 x 7,5 9,0 7,0 x 10 11 x 12 R6 R8 T6 T9 L1 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 12 ĐƢỜNG KÍNH VÒNG VÔ KHUẨN TRONG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AEROMONAS HYDROPHILA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN. Đƣờng kính vòng vô khuẩn STT Dòng vi khuẩn Ngày Ngày Ngày R4 1,125c 1,5bc 1,25c R6 0,75c 0,875c 2,75b R8 0,85c 1,25c 0,75c T6 0,5c 0,875c 1,75bc T9 3,875a 4,5a 5a L1 2,125b 2,5b 2,75b 2,2% 2,4% 3,5% CV (%) Ghi chú: trị trung bình cột có chữ theo sau giống khác biệt không ý nghĩa mức 5%. PHỤ LỤC 13 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG VÔ KHUẨN TRONG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG A. HYDROPHILA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.3509 Level L1 R4 R6 R8 T6 T9 N 2 2 2 DF 11 SS 16.297 0.739 17.036 R-Sq = 95.66% Mean 2.1250 1.1250 0.7500 0.8500 0.5000 3.8750 StDev 0.5303 0.1768 0.3536 0.1414 0.0000 0.5303 Chuyên ngành Vi sinh vật học MS 3.259 0.123 F 26.47 P 0.001 R-Sq(adj) = 92.05% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+---------+---------+---------+-------(----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*----) -+---------+---------+---------+-------- Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 0.0 Trường Đại học Cần Thơ 1.2 2.4 3.6 Pooled StDev = 0.3509 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn T9 L1 R4 R8 R6 T6 N 2 2 2 Mean 3.8750 2.1250 1.1250 0.8500 0.7500 0.5000 Grouping A B C C C C Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.4677 Level L1 R4 R6 R8 T6 T9 DF 11 SS 19.604 1.313 20.917 MS 3.921 0.219 N 2 2 2 R-Sq = 93.73% Mean 2.5000 1.5000 0.8750 1.2500 0.8750 4.5000 StDev 0.7071 0.0000 0.5303 0.0000 0.1768 0.7071 F 17.92 P 0.002 R-Sq(adj) = 88.50% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------(-----*----) (----*----) (-----*----) (----*-----) (-----*----) (----*----) +---------+---------+---------+--------0.0 1.5 3.0 4.5 Pooled StDev = 0.4677 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn T9 L1 R4 R8 T6 R6 N 2 2 2 Mean 4.5000 2.5000 1.5000 1.2500 0.8750 0.8750 Grouping A B B C C C C Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.5204 Level L1 R4 R6 R8 T6 T9 DF 11 SS 22.937 1.625 24.562 MS 4.587 0.271 N 2 2 2 R-Sq = 93.38% Mean 2.7500 1.2500 2.7500 0.7500 1.7500 5.0000 StDev 0.3536 0.3536 0.3536 0.3536 1.0607 0.0000 F 16.94 P 0.002 R-Sq(adj) = 87.87% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+---------+---------+---------+-------(----*-----) (-----*----) (----*-----) (-----*----) (-----*-----) (----*-----) -+---------+---------+---------+-------0.0 1.6 3.2 4.8 Pooled StDev = 0.5204 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn T9 R6 L1 T6 R4 R8 N 2 2 2 Mean 5.0000 2.7500 2.7500 1.7500 1.2500 0.7500 Grouping A B B B C C C Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E coli (Đỗ Tất Lợi, 2006; Shu-Chen et al., 2008) 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Sài đất (Wedelia chinensis) trồng ở tỉnh Vĩnh Long có khả năng tổng hợp ammonium, IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh. .. đạm sinh học cho cây 2.5 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thƣờng gặp Theo nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học Trung Quốc, hiện nay người ta đã phân lập được trên dưới 200 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá như Azospirillum, Klebsiella…nhưng trong đó phải kể đến 2 chi có khả năng kháng khuẩn đó là Bacillus và Pseudomonas 2.5.1 Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội. .. tổng diện tích đất tự nhiên của tỉnh Vĩnh Long là 147.900ha Đất ở Vĩnh Long được chia thành 3 nhóm chính: nhóm đất phù sa, nhóm đất nhiễm phèn và nhóm đất cát giồng Nhóm đất phù sa chiếm 30,29% diện tích đất tự nhiên của tỉnh, phân bố chủ yếu ở vùng đất cao ven sông Tiền và sông Hậu, thuộc địa bàn các huyện: Trà Ôn, Vũng Liêm, Bình Minh, Long Hồ, Tam Bình và thành phố Vĩnh Long Đây là nhóm đất tốt, thành... Bản đồ tỉnh Vĩnh Long 3 Hình 2: Sài đất (Wedelia chinensis) 6 Hình 3: Hoa Sài đất (Wedelia chinensis) 6 Hình 4: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 14 Hình 5: Vi khuẩn Escherichia coli 18 Hình 6: Bệnh xuất huyết trên cá 19 Hình 7: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 20 Hình 8: Tủ cấy Vi sinh vật 24 Hình 9: Tủ ủ Vi sinh vật... hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm vào cả cây hòa bản... của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân theo thời gian 48 Hình 20: Hàm lượng NH4+ trung bình của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá theo thời gian 49 Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 21: Hàm lượng NH4+ trung bình qua ngày 2, 4, 6, 8 của 24 dòng vi khuẩn phân lập được ... xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002) Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các... cứu Sài đất trong và ngoài nƣớc 2.7.1 Trong nước Đến nay, Vi t nam đã có nhiều công trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây dược liệu đặc biệt là Sài đất thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng Khi canh tác cây dược liệu đa phần sử dụng phân bón hóa học hay phân bón hữu cơ Tuy nhiên, vi c nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội. .. (2012) khi nghiên cứu trên cây Phyllodium pulchellum, vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sống nội sinh có khả năng diệt E coli, Pseudomonas aeruginosa Theo nghiên cứu của Sheng Qin et al.,(2009) Đã phân lập được một số dòng vi khuẩn nội sinh như: Streptomyces specialis trong rễ cây Sedum sp., Pseudomonas alni trong lá cây Hoa môi (Callicarpa longifolia) cũng có khả năng kháng khuẩn Theo nghiên cứu của... hợp với loại vi khuẩn này Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược 2.5.2 Vi khuẩn Pseudomonas Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Trong số những . THẢO LUẬN 38 4. 1 Phân lập vi khuẩn 38 4. 2 Đặc điểm khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn 40 4. 3 Hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn. 43 4. 4 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh 44 4. 5 Kết quả. hợp NH 4 + 46 4. 6 Kết quả khả năng hòa tan lân. 51 4. 7 Kết quả khả năng tổng hợp Indole–3–Acetic Acid 53 4. 8 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn. 57 4. 8.1 Kháng Escherichia coli 57 4. 8.2. sinh vật 24 Hình 9: Tủ ủ Vi sinh vật 24 Hình 10: pH kế 24 Hình 11: Máy lắc 24 Hình 12: Kính hiển vi điện tử 24 Hình 13: Trắc vi thị kính 24 Hình 14: Sự tạo vòng pellicle của vi khuẩn nội