BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA T.) TRỒNG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN THỊ THANH TRÚC MSSV: 3103997 LỚP: VSV K36 Cần Thơ, Tháng 11 / 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA T.) TRỒNG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN THỊ THANH TRÚC MSSV: 3103997 LỚP: VSV K36 Cần Thơ, Tháng 11 / 2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp (ký tên) Nguyễn Thị Thanh Trúc DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày …… tháng …… năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ  Sau bốn năm học tập, rèn luyện Trƣờng Đại Học Cần Thơ đƣợc thực đề tài tốt nghiệp, với hƣớng dẫn tận tình quý Thầy, Cô giúp đỡ bạn bè, đến hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Vi Sinh Vật Học, dù gặp phải nhiều khó khăn trở ngại. Tôi xin trân trọng cảm ơn: Quý Thầy Cô Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Cần Thơ truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn. Thầy PGS. TS Nguyễn Hữu Hiệp, Trƣởng môn Vi Sinh Vật, Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Cần Thơ tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp. Các cán tất phòng thí nghiệm đặc biệt anh chị phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, thuộc Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học ủng hộ giúp đỡ hoàn thành đề tài. Gia đình, đồng nghiệp bạn bè giúp đỡ, động viên chia sẻ khó khăn giúp hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến gia đình, quý thầy cô tất bạn bè tôi. Cần Thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2013 Nguyễn Thị Thanh Trúc Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƢỢC Hai mươi dòng vi khuẩn phân lập từ Diếp Cá trồng Thành Phố Cần Thơ. Chúng có hình dạng que ngắn, que dài cầu đôi . Và đa số vi khuẩn thuộc gram âm. Tất dòng vi khuẩn có khả tổng hợp NH4+ IAA sau ngày tăng sinh môi trường Nfb. Chín dòng vi khuẩn có khả hòa tan lân khó tan. Khảo sát khả kháng khuẩn 20 dòng vi khuẩn phân lập dòng vi khuẩn Escherichia coli Aeromonas hydrophila, kết cho thấy 12/24 dòng vi khuẩn có khả kháng tốt Escherichia coli 10/24 dòng có khả kháng Aeromonas hydrophila. Tuyển chọn dòng vi khuẩn R1, R2, T4 L3 có hiệu kháng khuẩn tốt để giải trình tự. Khi so sánh kết với liệu ngân hàng gen dòng vi khuẩn R1, R2, T4 L3 theo thứ tự nhận diện Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus aryabhattai Bacillus flexus, Từ khóa: Diếp Cá, kháng khuẩn, PCR, tổng hợp NH4+ - IAA, vi khuẩn nội sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ . TÓM TẮT . i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii TỪ VIẾT TẮT ix CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU . 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƢƠNG II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU Tổng quan Thành Phố Cần Thơ 2.1 2.1.1 Vị trí địa lý . 2.1.2 Điều kiện tự nhiên Địa hình . a. b. Khí hậu . c. Thủy văn 2.2 Giới thiệu Diếp Cá 2.3 Tác dụng Diếp Cá y học 2.3.1 Tác dụng kháng khuẩn . 2.3.2 Tác dụng kháng viêm . 2.3.3 Tác dụng hệ miễn nhiễm . 2.3.4 Tác dụng lợi tiểu . 2.3.5 Tác dụng hệ hô hấp . 2.3.6 Tác dụng chống oxy hóa 2.3.7 Tác dụng chống ung thƣ . 2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh . 2.5 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp . 2.5.1 Vi khuẩn Bacillus . 10 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 a. Trường Đại học Cần Thơ Bacillus amyloliquefaciens 10 b. Bacillus cereus . 10 c. Bacillus polymyxa 11 d. Bacillus subtilis 11 e. Bacillus megaterium 12 2.5.2 Vi khuẩn Pseudomonas 13 2.5.3 Vi khuẩn Azospirillum 14 2.5.4 Vi khuẩn Klebsiella 15 2.5.5 Vi khuẩn Azotobacter . 15 2.5.6 Vi khuẩn Enterobacter . 16 2.5.7 Vi khuẩn Burkholderia . 16 Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp. 17 2.6 2.6.1 Vi khuẩn E. coli (Escherichia coli) 17 2.6.2 Vi khuẩn A. hydrophila (Aeromonas hydrophila) . 19 Tình hình nghiên cứu Diếp cá nước 22 2.7 2.7.1 Trong nƣớc . 22 2.7.2 Ngoài nƣớc . 22 CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 24 Phương tiện nghiên cứu . 24 3.1 3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực . 24 3.1.2 Dụng cụ - thiết bị 24 3.1.3 Vật liệu . 25 3.1.4 Hóa chất 25 a. Môi trƣờng phân lập vi khuẩn nội sinh . 25 b. Môi trƣờng khảo sát khả hòa tan lân 25 c. Môi trƣờng khảo sát khả tổng hợp NH4+ 26 d. Môi trƣờng khảo sát khả kháng khuẩn . 27 e. Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn 27 f. Hóa chất trích DNA . 27 g. Hóa chất thực phản ứng PCR 28 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Phương pháp nghiên cứu . 29 3.2 3.2.1 a. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn nội sinh . 29 Thu mẫu . 29 b. Xử lý mẫu phân lập . 29 3.2.2 Quan sát hình dạng khả chuyển động vi khuẩn . 31 3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh . 32 3.2.4 Xác định khả tổng hợp NH4+ . 33 a. Nguyên tắc . 33 b. Hóa chất . 33 c. Tiến hành thí nghiệm: 34 d. Định lƣợng đạm vi khuẩn sinh ngày 2, 4, (sau chủng) 34 3.2.5 Xác định khả hòa tan lân . 35 3.2.6 Xác định khả tổng hợp IAA 35 a. Chuẩn bị . 35 b. Hóa chất . 35 Phƣơng pháp 36 c. 3.2.7 Thử nghiệm khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn 36 3.2.8 Nhận diện số dòng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu . 37 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 39 4.1 Kết phân lập vi khuẩn từ Diếp Cá. . 39 4.1.1 Kết phân lập dòng vi khuẩn. . 39 4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc 20 dòng vi khuẩn 41 4.1.3 Hình dạng khả di chuyển 20 dòng vi khuẩn 43 4.1.4 Kết nhuộm Gram 20 dòng vi khuẩn. 45 4.2 Khả tổng hợp NH4+. 47 4.3 Khả hòa tan lân. 51 4.4 Khả tổng hợp IAA. 54 4.5 Khả kháng khuẩn. . 59 4.5.1 Tính kháng khuẩn Escherichia coli (E. coli). . 59 4.5.2 Tính kháng khuẩn với Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) . 65 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 4.6 Trường Đại học Cần Thơ Kết nhận diện dòng vi khuẩn 69 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 74 PHỤ LỤC . Phụ lục Kết hàm lượng NH4+ 20 dòng vi khuẩn Phụ lục Đường chuẩn NH4+ ngày đo Phụ lục Kết thống kê hàm lượng NH4+ dòng vi khuẩn phân lập từ rễ Phụ lục Kết thống kê hàm lượng NH4+ dòng vi khuẩn phân lập từ thân Phụ lục Kết thống kê hàm lượng NH4+ dòng vi khuẨn phân lập từ Phụ lục Kết hàm lượng IAA 20 dòng vi khuẩn Phụ lục Đường chuẩn IAA ngày đo Phụ lục Kết thống kê hàm lượng IAA dòng vi khuẩn phân lập từ rễ Phụ lục Kết thống kê hàm lượng IAA dòng vi khuẩn phân lập từ thân Phụ lục 10 Kết thống kê hàm lượng IAA dòng vi khuẩn phân lập từ Phụ lục 11 Đường kính khuẩn lạc đường kính vòng sáng khảo sát khả kháng Escherichia coli dòng vi khuẩn phân lập Phụ lục 12 Phân tích thống kê đường kính vòng vô khuẩn khảo sát khả kháng E. coli dòng vi khuẩn Phụ lục 13 Phân tích thống kê đường kính vòng vô khuẩn khảo sát khả kháng A. hydrophila dòng vi khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Môi trƣờng PDA. . 25 Bảng 2: Môi trƣờng NBRIP đặc (Nautiyal, 1999). . 25 Bảng 3: Môi trƣờng NFb (g/l) (Kirchhof ctv, 1997). . 26 Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lƣợng . 26 Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamine 27 Bảng 6: Môi trƣờng LB (Lauria Betani) . 27 Bảng 7: Thành phần chất phản ứng PCR . 28 Bảng 8: Kết phân lập dòng vi khuẩn từ rễ, thân Diếp Cá . 40 Bảng 9: Đặc điểm 20 dòng vi khuẩn đƣợc phân lập 41 Bảng 10: Đặc tính 20 dòng vi khuẩn 43 Bảng 11: Kết nhuộm Gram 20 dòng vi khuẩn. 45 Bảng 12: Kết khảo sát khả hòa tan lân 20 dòng vi khuẩn . 52 Bảng 13: Khả kháng A. hydrophila 10 dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. . 66 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Pooled StDev = 0.171 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean Grouping T3 14.0556 T6 9.2778 B T1 9.2222 B T4 6.8333 T2 5.8333 D T5 5.7778 D A C Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source DF SS MS F P 57.6791 11.5358 847.88 0.000 Error 12 0.1633 0.0136 Total 17 57.8424 Dòng vi khuẩn S = 0.1166 R-Sq = 99.72% R-Sq(adj) = 99.60% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev T1 10.714 0.143 T2 5.905 0.082 T3 8.476 0.082 T4 7.857 0.143 T5 10.810 0.082 T6 7.143 0.143 --+---------+---------+---------+------(*) (*) (* (*) (*) (*) --+---------+---------+---------+------- Chuyên ngành Vi sinh vật học 109 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ 6.0 7.5 9.0 10.5 Pooled StDev = 0.117 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean Grouping T5 10.8095 A T1 10.7143 A T3 8.4762 T4 7.8571 T6 7.1429 T2 5.9048 B C D E Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source DF SS MS F P 34.1660 6.8332 455.44 0.000 Error 12 0.1800 0.0150 Total 17 34.3461 Dòng vi khuẩn S = 0.1225 R-Sq = 99.48% R-Sq(adj) = 99.26% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev T1 1.1481 0.1604 T2 4.4352 0.1604 T3 1.4259 0.0802 T4 3.2315 0.0802 T5 3.3704 0.0802 Chuyên ngành Vi sinh vật học +---------+---------+---------+--------(*-) (*-) (*-) (*-) (-*) 110 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 T6 4.8056 Trường Đại học Cần Thơ 0.1389 (*-) +---------+---------+---------+--------1.0 2.0 3.0 4.0 Pooled StDev = 0.1225 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean Grouping T6 4.8056 T2 4.4352 T5 3.3704 C T4 3.2315 C T3 1.4259 T1 1.1481 A B D E Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học 111 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 10 KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƢỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ở LÁ Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source DF SS MS F P 104.3704 14.9101 715.68 0.000 Error 16 0.3333 0.0208 Total 23 104.7037 Dòng vi khuẩn S = 0.1443 R-Sq = 99.68% R-Sq(adj) = 99.54% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev L1 3.6111 0.0962 L2 6.7222 0.0962 L3 9.2222 0.2546 L4 8.8333 0.1667 L5 8.2222 0.0962 L6 3.9444 0.0962 L7 4.5000 0.1667 L8 6.7222 0.0962 -------+---------+---------+---------+-(*) (*) (*-) (*) (*) (*) (*) (*) -------+---------+---------+---------+-4.5 6.0 7.5 9.0 Pooled StDev = 0.1443 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean Grouping Chuyên ngành Vi sinh vật học 112 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 L3 9.2222 L4 8.8333 L5 8.2222 L8 6.7222 D L2 6.7222 D L7 4.5000 L6 3.9444 L1 3.6111 Trường Đại học Cần Thơ A B C E F G Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source DF SS MS F P 113.9048 16.2721 1063.11 0.000 Error 16 0.2449 0.0153 Total 23 114.1497 Dòng vi khuẩn S = 0.1237 R-Sq = 99.79% R-Sq(adj) = 99.69% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -------+---------+---------+---------+-- L1 4.667 0.082 *) L2 10.000 0.143 L3 12.000 0.143 L4 8.048 0.082 L5 7.000 0.143 L6 5.762 0.082 L7 8.857 0.143 L8 8.429 0.143 (*) (*) (*) (*) (*) *) (*) -------+---------+---------+---------+-6.0 Chuyên ngành Vi sinh vật học 8.0 113 10.0 12.0 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Pooled StDev = 0.124 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean L3 12.0000 L2 10.0000 L7 8.8571 L8 8.4286 L4 8.0476 L5 7.0000 L6 5.7619 L1 4.6667 Grouping A B C D E F G H Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source DF SS MS F P 28.3814 4.0545 201.78 0.000 Error 16 0.3215 0.0201 Total 23 28.7029 Dòng vi khuẩn S = 0.1418 R-Sq = 98.88% R-Sq(adj) = 98.39% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev L1 2.6759 0.1604 L2 3.7870 0.0802 L3 2.0741 0.0802 L4 1.1944 0.1389 Chuyên ngành Vi sinh vật học -+---------+---------+---------+-------(*-) (-*) (*-) (*) 114 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 L5 4.8981 0.0802 L6 2.8611 0.2406 L7 2.4444 0.1389 L8 3.8333 0.1389 Trường Đại học Cần Thơ (-*) (-*) (*-) (-*) -+---------+---------+---------+-------1.2 2.4 3.6 4.8 Pooled StDev = 0.1418 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean Grouping L5 4.8981 L8 3.8333 B L2 3.7870 B L6 2.8611 C L1 2.6759 C D L7 2.4444 D L3 2.0741 L4 1.1944 A E F Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học 115 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 11 ĐƢỜNG KÍNH KHUẨN LẠC VÀ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG SÁNG TRONG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG ESCHERICHIA COLI CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƢỢC Ngày Ngày Ngày Dòng STT vi khuẩn Đƣờng kính Đƣờng kính vòng Đƣờng kính Đƣờng kính vòng Đƣờng kính Đƣờng kính vòng khuẩn lạc (mm) sáng (mm) khuẩn lạc (mm) sáng (mm) khuẩn lạc (mm) sáng (mm) 7,0 9,0 7,0 10,0 7,0 10,0 6,0 11,0 6,5 12,0 7,0 12,0 6,0 10,0 7,0 12,0 7,0 9,0 8,0 10,0 8,0 12,5 8,5 12,5 6,0 8,0 8,0 x 7,5 10,0 x 9,0 8,0 10,5 6,0 8,0 8,5 10,5 9,0 10,5 9,0 10,0 9,0 11,0 9,5 11,0 7,0 8,5 9,0 11,0 9,5 11,0 8,0 12,0 9,0 x 6,0 10,0 x 12,0 8,0 11,0 8,0 12,0 8,0 x 9,0 11,0 x 11,5 9,0 12,0 R1 R2 R5 R6 T1 Chuyên ngành Vi sinh vật học 1Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 10 11 12 Trường Đại học Cần Thơ 6,0 8,0 7,0 7,5 7,0 20,0 x 15,0 6,0 7,0 7,5 x 6,0 9,0 x 7,0 7,0 16,0 x 19,0 6,0 9,0 6,0 x 10,0 7,0 x 12,0 6,0 x 10,0 16,0 x 20,0 6,0 7,0 6,0 x 8,0 7,5 x 10,0 7,0 16,0 x 18,0 6,0 9,0 7,0 9,0 7,0 9,0 6,0 8,0 7,0 x 8,0 8,5 x 11,0 7,0 x 8,0 8,0 x 9,0 6,0 8,0 6,0 x 8,0 9,0 7,0 9,0 6,0 7,0 6,0 x 7,0 9,0 7,0 x 8,0 8,0 x 9,0 6,0 9,0 7,0 9,0 8,0 10,0 6,0 9,0 7,0 x 10,0 8,5 x 12,0 7,0 x 10,0 8,0 x 12,0 8,0 x 6,0 12,0 x 9,0 6,0 x 9,0 12,0 x 13,0 7,0 x 9,0 10,0 x 13,0 7,0 11,0 7,0 14,0 7,5 11,0 7,0 x 8,0 7,0 x 8,0 7,5 x 9,5 7,5 x 9,5 8,0 x 10,0 15,0 x 17,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 11,0 x 2,0 T2 T3 T4 T5 L2 L3 L5 Chuyên ngành Vi sinh vật học 1Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 12 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG VÔ KHUẨN TRONG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source DF SS MS F P Dòng vi khuẩn 11 30.583 2.780 3.25 0.027 Error 12 10.250 0.854 Total 23 40.833 S = 0.9242 R-Sq = 74.90% R-Sq(adj) = 51.89% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev L2 3.0000 0.0000 L3 3.7500 0.3536 L5 0.0000 0.0000 R1 3.5000 2.1213 R2 3.0000 1.4142 R5 2.0000 0.0000 R6 1.2500 0.3536 T1 4.0000 0.0000 T2 1.5000 0.7071 T3 2.0000 1.4142 T4 2.5000 0.7071 T5 1.5000 0.7071 -------+---------+---------+---------+-(------*------) (------*------) (------*------) (-------*------) (------*------) (------*------) (------*------) (------*------) (-------*------) (------*------) (-------*------) (-------*------) -------+---------+---------+---------+-0.0 2.0 4.0 6.0 Pooled StDev = 0.9242 Grouping Information Using Fisher Method Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Dòng vi khuẩn N Mean Grouping T1 4.0000 A L3 3.7500 A R1 3.5000 A B L2 3.0000 A B C R2 3.0000 A B C T4 2.5000 A B C R5 2.0000 A B C D T3 2.0000 A B C D T5 1.5000 B C D T2 1.5000 B C D R6 1.2500 C D L5 0.0000 D Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source DF SS MS F P Dòng vi khuẩn 11 63.896 5.809 11.99 0.000 Error 12 5.812 0.484 Total 23 69.708 S = 0.6960 R-Sq = 91.66% R-Sq(adj) = 84.02% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev L2 1.8750 0.1768 L3 6.0000 1.4142 L5 0.0000 0.0000 R1 4.2500 1.7678 Chuyên ngành Vi sinh vật học ----+---------+---------+---------+----(----*---) (---*---) (---*---) (---*---) Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ R2 4.7500 0.3536 (---*---) R5 1.8750 0.1768 (----*---) R6 2.0000 0.0000 (---*---) T1 3.3750 0.1768 T2 0.8750 0.5303 T3 1.6250 0.1768 T4 2.1250 0.1768 (----*---) T5 2.2500 0.3536 (---*---) (----*---) (----*---) (----*---) ----+---------+---------+---------+----0.0 2.5 5.0 7.5 Pooled StDev = 0.6960 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean Grouping L3 6.0000 A R2 4.7500 A B R1 4.2500 B T1 3.3750 B C T5 2.2500 C D T4 2.1250 C D R6 2.0000 C D R5 1.8750 C D L2 1.8750 C D T3 1.6250 D T2 0.8750 D E L5 0.0000 E Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source DF SS MS F P Dòng vi khuẩn 11 251.708 22.883 33.28 0.000 Error 12 8.250 0.688 Total 23 259.958 S = 0.8292 R-Sq = 96.83% R-Sq(adj) = 93.92% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+---------+ L2 1.750 0.354 L3 3.500 0.000 L5 8.250 1.768 R1 4.000 1.414 R2 3.000 1.414 R5 2.000 0.000 R6 1.500 0.000 T1 3.000 0.000 T2 10.500 0.000 T3 10.000 0.000 T4 1.500 0.707 (---*---) T5 1.500 0.707 (---*---) (---*---) (----*---) (----*---) (---*----) (---*---) (----*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*----) ---------+---------+---------+---------+ 3.0 6.0 9.0 12.0 Pooled StDev = 0.829 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn N Mean Grouping Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 T2 10.500 A T3 10.000 A B L5 8.250 B R1 4.000 C L3 3.500 C D R2 3.000 C D E T1 3.000 C D E R5 2.000 D E L2 1.750 D E T5 1.500 E T4 1.500 E R6 1.500 E Trường Đại học Cần Thơ Means that not share a letter are significantly different. PHỤ LỤC PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG VÔ KHUẨN TRONG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG A. HYDROPHILA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.4841 Level L1 L2 L3 L8 R1 R2 R3 R6 T4 T5 N 2 2 2 2 2 DF 10 19 SS 15.066 2.344 17.409 R-Sq = 86.54% Mean 1.0000 3.7500 2.2500 0.8750 1.7500 1.2500 0.6250 1.2500 2.0000 1.1250 StDev 0.3536 1.0607 0.3536 0.1768 0.3536 0.3536 0.1768 0.3536 0.7071 0.1768 MS 1.674 0.234 F 7.14 P 0.002 R-Sq(adj) = 74.42% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+---------+---------+---------+-------(-----*------) (-----*------) (------*-----) (-----*------) (------*-----) (-----*------) (-----*------) (-----*------) (------*-----) (-----*------) -+---------+---------+---------+-------0.0 1.2 2.4 3.6 Pooled StDev = 0.4841 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn L2 L3 T4 R1 R6 R2 T5 L1 L8 R3 N 2 2 2 2 2 Mean 3.7500 2.2500 2.0000 1.7500 1.2500 1.2500 1.1250 1.0000 0.8750 0.6250 Grouping A B B C B C D B C D E B C D E C D E C D E D E E Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.5506 Level L1 L2 L3 L8 R1 R2 R3 R6 T4 T5 DF 10 19 SS 21.503 3.031 24.534 N 2 2 2 2 2 R-Sq = 87.64% Mean 0.5000 3.7500 3.2500 1.2500 1.7500 1.2500 0.7500 1.5000 2.3750 0.7500 StDev 0.0000 0.3536 1.0607 0.3536 0.0000 0.3536 0.3536 0.7071 0.8839 0.3536 MS 2.389 0.303 F 7.88 P 0.002 R-Sq(adj) = 76.53% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev --+---------+---------+---------+------(----*-----) (-----*-----) (-----*----) (----*-----) (-----*----) (----*-----) (-----*-----) (-----*-----) (-----*-----) (-----*-----) --+---------+---------+---------+------0.0 1.5 3.0 4.5 Pooled StDev = 0.5506 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn L2 L3 T4 R1 R6 R2 L8 T5 R3 N 2 2 2 2 Mean 3.7500 3.2500 2.3750 1.7500 1.5000 1.2500 1.2500 0.7500 0.7500 Grouping A A B B C C D C D E C D E C D E D E D E Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 L1 0.5000 Trường Đại học Cần Thơ E Means that not share a letter are significantly different. Ngày One-way ANOVA: Ngày versus Dòng vi khuẩn Source Dòng vi khuẩn Error Total S = 0.8062 Level L1 L2 L3 L8 R1 R2 R3 R6 T4 T5 DF 10 19 SS 76.863 6.500 83.363 MS 8.540 0.650 N 2 2 2 2 2 R-Sq = 92.20% Mean 0.0000 4.0000 1.0000 1.0000 6.5000 0.7500 1.0000 2.2500 3.2500 0.0000 StDev 0.0000 2.1213 0.0000 0.0000 0.7071 0.3536 0.3536 0.3536 1.0607 0.0000 F 13.14 P 0.000 R-Sq(adj) = 85.19% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -----+---------+---------+---------+---(----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*----) (----*----) -----+---------+---------+---------+---0.0 2.5 5.0 7.5 Pooled StDev = 0.8062 Grouping Information Using Fisher Method Dòng vi khuẩn R1 L2 T4 R6 R3 L8 L3 R2 T5 L1 N 2 2 2 2 2 Mean 6.5000 4.0000 3.2500 2.2500 1.0000 1.0000 1.0000 0.7500 0.0000 0.0000 Grouping A B B B C C D C D C D C D D D Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... đƣợc các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp Cá (Houttuynia corata T.) có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về Thành Phố Cần Thơ 2.1.1 Vị trí địa lý Thành phố Cần Thơ nằm ở vùng hạ lƣu của... học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Diếp cá (Houttuynia cordata T.) 5 Hình 2: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 14 Hình 3: Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 18 Hình 4: Bệnh xuất huyết trên cá 19 Hình 5: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 20 Hình 6: Quy trình phân lập vi khuẩn nội sinh trên Diếp Cá 30 Hình 7: Quy trình thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các... breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang Nhƣ vậy, vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ Đậu mà còn xâm nhiễm vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây 2.5 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thƣờng gặp Theo nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học Trung Quốc, hiện nay ngƣời ta đã phân lập đƣợc trên dƣới 200 dòng vi khuẩn nội. .. ở các dòng tế bào ung thƣ Sarcoma – 180 trong thử nghiệm in vitro và in vivo gây ung thƣ trên chuột Các alkaloid đƣợc tìm thấy trong dịch chiết methanol của cây Diếp cá có tác dụng chống lại 5 dòng tế bào u ở ngƣời (A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF-498 và HCT-15 ) 2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel, 1992) Từ vùng rễ, chúng... 22: Biểu đồ so sánh vòng sáng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập từ Rễ 60 Hình 23: Biểu đồ so sánh vòng sáng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập từ Thân 61 Hình 24: Biểu đồ so sánh vòng sáng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập từ Lá 63 Hình 25: Biểu đồ so sánh vòng sáng vô khuẩn trung bình của 12 dòng vi khuẩn 64 Hình 26: Một số hình ảnh sự tạo vòng sáng vô khuẩn kháng E coli 65 Hình... khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá nhƣ Azospirillum, Klebsiella…nhƣng trong đó phải kể đến 2 chi có khả năng kháng khuẩn đó là Bacillus và Pseudomonas Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.5.1 Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dƣơng, có nội bào tử hình ovan có khuynh hƣớng phình ra ở một... vi khuẩn nội sinh nhƣ: Streptomyces specialis trong rễ cây Sedum sp., Pseudomonas alni trong lá cây Hoa môi (Callicarpa longifolia) cũng có khả năng kháng khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Gon et al., (2012) khi nghiên cứu công dụng của cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.) cho biết dịch chiết của cây. .. thấy, các vi khuẩn nội sinh với các cây trồng nhƣ Lavandula officinalis, Echinacea purperea và Echinacea angustifolia có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn gây các bệnh nhƣ Cysitic Fibrosis (CF) Cây Diếp cá là một vị thuốc cổ truyền của Trung Quốc dùng để trị các bệnh nhiễm khuẩn (http://www.wisegeek.com) Theo Kim et al., (2008), cây Diếp cá có khả năng ức chế phát triển của vi khuẩn. .. kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay 2.7.2 Ngoài nước Hiện nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong cây dƣợc liệu, đặc biệt là những cây dƣợc liệu nhiệt đới nhƣ: cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.), cây Sài đất (Wedelia chinensis M.), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)… Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các chủng... tổng hợp đƣợc của các dòng vi khuẩn phân lập từ Thân theo thời gian 56 Hình 20: Hàm lƣợng IAA tổng hợp đƣợc của các dòng vi khuẩn phân lập từ Lá theo thời gian 57 Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 21: Biểu đồ hàm lƣợng IAA trung bình từng ngày các dòng vi khuẩn 58 Hình . lập 29 3. 2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 31 3. 2 .3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh 32 3. 2.4 Xác định khả năng tổng hợp NH 4 + 33 a. Nguyên tắc 33 b. Hóa chất 33 c 2 .3. 1 Tác dụng kháng khuẩn 6 2 .3. 2 Tác dụng kháng viêm 7 2 .3. 3 Tác dụng trên hệ miễn nhiễm 7 2 .3. 4 Tác dụng lợi tiểu 7 2 .3. 5 Tác dụng trên hệ hô hấp 7 2 .3. 6 Tác dụng chống oxy hóa 8 2 .3. 7. nghiệm: 34 d. Định lƣợng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) 34 3. 2.5 Xác định khả năng hòa tan lân 35 3. 2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA 35 a. Chuẩn bị 35 b.