KỸ THUẬT LẤY VÀ CHUYÊN CHỞ BỆNH PHẨM TRONG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG KỸ THUẬT ĐỊNH DANH VI KHUẨN PhạPhạ m Thá i Bình m Thá i Bình Cầu khuẩn Gram (-) Cầu khuẩn Gram (+) Bệnh phẩm mẫu thử lấy từ bệnh nhân khuẩ Gram (-) để phát chứnTrự g cgiú pnxá c đònh tác nhân gây nhiễm trùng. Trực khuẩn Gram (+) Bệnh phẩm thường gặp xét nghiệm vi sinh Hầu họng Mũi hầu Tai Xoang Máu PHƯƠNG PHÁP SỬ NG Mủ DỤ tiết dòch ng hô hấp trênM SINH HÓA THỬĐườNGHIỆ Phân Dòch não tủy Đàm Dòch phế quản Dòch khí quản Nước tiểu Đường hô hấp Đường sinh dục Vì bệnh phẩm lấy nhiều nguồn khác nên phải lấy bệnh phẩm đạt yêu cầu xét nghiệm vi sinh TRỰC KHUẨN GRAM (-) Haemophillus HACEK(1) Trực khuẩn Gram(-) Sphingomonas Moraxella (+) (-) Pasteurella Campylobacter Helicobacter Mac Conkey Agar Acinetobacter(2) (-) (-) (+) lavimonas (Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Serratia, ❊ ✇arsiella, Proteus, Morganella, Salmonella, Provi encia, Shigella, Yersinia .) Aeromonas Pleiosomonas Oxidase Glucose (-) Glucose (+) Chryseomonas Enterobacteriace Vibrio (+) Stenotrophomonas Pse (+) Brucella Chromobacterium Bor etella Bartonella rancisella Legionella as Burkhol eria lavobacterium Alcaligenes Achromobacter Trực khuẩn Gram (-) dễ mọc Chryseobacterium (1)HACEK: Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella sp. (2)cầu trực khuẩn Betty A. Forbes, et.al., 2002, Bailey & Scott’s, Diagnostic Microbiology, 7th edition, Mosby Nguyên nhân làm cho bệnh phẩm không đạt Enterobacteriaceae yêu cầu xé t nghiệm vi sinh Enterobacteriaceae bao gồm 120 loài khác nhau. Các họ phụ chính: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Serratia, Shigella, Salmonella, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia. Để đònh danh đến loài thực đến 40 phản ứng sinh hóa. Calgary Laboratory Services, Canada Patrick R. Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6th edition, American Society for Microbiology. D. Church, 2005, The seven principle of accurate microbiology specimens collection, Microbiology newsletter a publication of the division of microbiology, Cargary Laboratory Services Non ermentative Gram negative bacilli Acinetobacter (-) (+) (-) (-) Sphigobacterium lavobacterium Chryseobacterium Oxidase Phải đònh lấy bệnh phẩm sớm Di động (+) Di động (+) Stenotrophomonas bệnh nhân có Pseu ấuomonas hiệu nhiễm trùng -ngay Chryseomonas Burkhol eria lavimomas Alcaligenes Sphigomonas Comamonas Burkhol eria cepacia Burkhol eria gla ioli Máu Haemophilus Chỉ đònh cấy máu có dấ u hiệu nhiễm trùng V X huyết (septicemia) du khuẩn huyết (bacteremia). XV XV V X Vi khuẩn X V H. Influenzae H. Haemoliticus (+) (+) H. H. H. H. H. (-) (+) (+) (-) parainfluenzae parahaemoliticus segnis paraprophilus paraphrophaemolyticus H. ducreyi H. aphrophilus t, ớcn lạ nh,nglạn h run, tiếng thổi tim Vi khuẩnSốkhá (khô phả i (-) (-) Haemophilus) (cardiac murmur). XV V X Nghi ngờ viêm nội tâm mạc. Có xuất huyết da hay niêm XV X mạc, V xuất huyết dạng (splinder) móng tay, choáng. Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Dòch não tủy Chỉ đònh cấy dòch não tủy có triệu chứU ngKHUẨ nghi ngờ viêm mà(-) ng não. CẦ N GRAM Không đònh chọc dò DNT: trẻ sơ sinh bò suy tim, suy hô hấp. bệnh nhân có dấu hiệu gia tăng áp lực nội sọ (soi đáy mắt thấy gai thò bò phù nề). bệnh nhân bò nhiễm trùng vùng da nơi kim chọc dò Cầu khuẩn Gram (-) qua để lấy DNT. Acinetobacter(*) (-) (+) M. catarrhalis Neisseriaceae Oxidase N. gonorrhoeae N. meningiti is N. lactamica N. sicca M. catarrhalis (*)cầu trực khuẩn Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Nước tiểu TRỰC KHUẨN GRAM (+) Chỉ đònh cấy nước tiểu nghi ngờ nhiễm trùng tiểu cấp tính, mạn tính có triệu chứng Trực khuẩn Gram (+) Bacillus (+) (+) Catalase (-) (+) Nhiễm trù(-) ng bàng quang (đái Listeria mủ, máu, đái khó, đái đau, đau Sinh bà o tử tức vùnDigđộxương mu hay ng Gar nerella vaginalis (-) bụng dưới). Corynebacterium Nhiễm trùng thận (đau lưng, tức Lactobacillus căng vùng góc sống-sườn). Erysipelothrix rhusiopathiae Arcanobacterium Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Phân CẦU KHUẨN GRAM (+) Micrococcaceae (+) (-) Oxidase (-) (+) Streptococcus Planococcus Di động (+) Micrococcus (-) Chỉ đònh cấy phân bò tiêu (-) Streptococcaceae chảy hoặ c bò rối loạn tiêu Catalase hoá nghi ngờ nhiễm trùng Stomatococcus Enterococcus TiêAerococcus u chảy. Lactococcus Lỵ với phân có mủ, nhầy Pec iococcus hoặ máu. Leuconostoccus Bò đau bụng cơn. Genella 6.5% NaCl (+) Staphylococcus Patrick R. Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6th edition, American Society for Microbiology. Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Đường hô hấp Staphylococcus S. aureus (+) (R) Chỉ đònh cấy đường hô hấp có S. saprophyticus (-) nhiễm trùng vùng hầu họ(S) ng, tai, mũi xoang Viêm tai cấp tính. Coagulase Novobiocin Salt Viêm tai cấp tính hoặMannitol c mạn tính. Staphylococcus coagulase negative khác (-) (+) Viêm xoang cấp tinh mạn tính. S. epi ermi is (R) (-) Polymycin B (S) Viêm mũi cấp tính mạn tính. (-) (-) (+) Viêm nhiễm vùng hầu họng (đau ráS.t schlei vùng eri hầu họng, niê m mạc hầu họng sưng đỏ, phù nề, Ornithin Alkaline phosphatase viêm decarboxylase amydan, có mà ng mủ hay màng giả, (+) (+) Urease phù nề tiểu thiệt, lõi đỏ dâu tây, sưng S.chominis hạ h cổ). S. lu unensis S. haemolyticus Tìm người lành mang trùng. Basic Laboratory Procedure in Clinical Bacteriology, 2003, 2nd edition, WHO Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Đường hô hấp ưới Streptococcus Vi khuẩn Tiêu huyết α Optochin Bile solution CAMP SXT Tiêu huyết β Optochin S. pneumoniae S S. pseudopneumoniae I Bile solution (+) Viridans streptococcus Chỉ đònh cấy đường hô Rhấp Viridans streptococcus I (-) có viêm nhiễm đường hô hấp Bile esculin Vi khuẩn CAMP SXT (viêmS. pyogenes phổ i, viêmBacitracin phế n cấ p, S (-) S cấ p viêm phế n Rmạn). S. agalactidae R (+) C/F/G streptococcus Enterococcus Bacitracin Enterococcus Vi khuẩn Bile esculin Enterococcus R/S (-) R (-) R (-) (+) Bile esculin 6.5✪ NaCl (+) (+) CAMP Ho có máu,(+)ho nhiề(-)u, đau Non enterococcus (-) . ngực, khó thở S. agalactidae CAMP Viridans streptococcus (-) (+) (-) Có dấu hiệu đặc phổi, Tiêu huyết γ Pyruvate phim phổi có thâm nhiễm Enterococcus 6.5% NaCl Bile esculin E. faecalis (+) E. faecium (-) Basic Laboratory Procedure in Clinical Bacteriology, 2003, 2nd edition, WHO Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Mủ tiết òch PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG Mủ áp-xe.MẠI KITS THƯƠNG Chỉ đònh cấy mủ tiết dòch trường hợp: Vết thương nhiễm trùng (vết loét, lở, mổ hậu phẫu, loét nằm lâu). Mạch lươn; mạch dẫn xoang hay hạch bạch huyết. Dòch tiết (dòch màng phổi, dòch màng bụng…). Mẫu nạo mủ xương giải phẫu Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Đường sinh ục Đònh danh kits thương mại giúp đònh danh nhanh chóng xác nhờ hệ thống mã đònh danh Chỉ đònh cấy đường sinh dục nghi ngờ bệnh lây truyền đường sinh dục (ở đàn ông đàn bà) bò huyết trắng nghi nhiễm trùng (ở đàn bà). Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Trực khuẩn Gram (-), ễ mọc hệ thống IDS14GNR (Nam Khoa) 200µl/giếng 35oC/12-16h Giếng số Phải lấy bệnh phẩm Thử nghiệm Thuốc thử (+) (-) Glucose Vàng Tím ONPG Vàng Trắng Sinh Urease Đỏ hồng Vàng/đỏ nhạt PAD Xanh Vàng nhạt Citrate Xanh biển Xanh lá/ vàng Esculin Đen Không đen H2S Đen Không đen Indol Vòng đỏ Vòng vàng VP Đỏ Vàng 10 Malonate Xanh biển Xanh lá/ vàng → Nitrite ng n củ a táTìmcnitrite nhân Đỏ nhiễmVàtrù ng -nơi mà có hiện2 iệNitrate Oxidase Di động LDC 35oC/ 12-16h FeCl3 Kovac α-napthtol+KOH Mỗi nhóm gồm có 03 phản ứng Các phản ứng (-): điểm. Phản ứng (+): điểm (thứ nhóm); điểm (thứ hai nhóm); điểm (thứ ba nhóm). Tổng điểm nhóm số đònh danh thứ nhất. Tập hợp số đònh danh mã số đònh danh. IDS 14GNR- Hệ thống đònh ❞anh Số: …………………………………………………………… …… trực khuẩn Gram (-), ❞ễ mọc Tên: ……………………………………………………………………… ISO 9001:2000 WHO GMP/GLP OXI GLU NIT ONPG URE PAD CIT ESC H2s IND VP MLO LDC MOB Tìmđònh tácanh: nhân Kết gây viêm xoang Tìm tác nhân gây nhiễm trùng vết phải lấy quệt mũi sau, không Enterobacter cloaceae (ID: 100✁, P: 0.67) thương phải lấy mủ dòch tiết lấy quệt mũi trước. gần lớp mô, không lấy mủ bề mặt vết thương. Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Tìm tác nhân gây viêm phổi phải lấy đàm dòch hút khí phế quản, không lấy nước bọt Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG MÁY ĐỊNH DANH TỰ ĐỘNG Phải lấy bệnh phẩm thời điểm -vào PHOENIX lúc mà tác nhân nhiễm trùng iện bệnh phẩm BioMerieux VITEK2 PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S rRNA Cấy máu tuần thứ sau khởi bệnh Tìm S. typhi gây thương hàn Cấy phân tuần thứ ba sau khởi bệnh Máu Nguyên tắc Gen 16S rRNA gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn. Trong có đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống loài vi khuẩn. Thời điểm tốt để lấy máu bệnh nhân bò ớn lạnh Giảiđang trình lạ tựnh đoạ n trướ đặcchiệ run khiu nàysố giú danh t,p đònh lúc bệxá nhc vi khuẩn nhân lên sốt. 120bps 1542bps 2904bps Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Nước tiểu Thời điểm tốt để lấy nước tiểu vào buổi sáng, bệnh nhân cố nhòn tiểu đêm lúc lấy mẫu. Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Các bệnh phẩm khác Quy trình thực Tách chiết DNA : Vi khuẩ n trê n m Thờ i điể mặt thạch Lấy khúm khuẩn cho vào TE 1X để làm thành huyền dòch tương đương Mc. F 1.0 tốt để lấy mẫu vào giai đoạn sớm bệnh tốt, nghóa có chẩn đoán – Đun sôi 10min – Để lạnh 5min – Ly tâm 5min. Lấy dòch Primers Taq polymerase dNTP Mg2+ DNA đích PCR 16SrRNA (40X) Điện di gel agarose để xác đònh sản phẩm PCR 94oC/15s 60oC/30s 72oC/1min Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Cho vào PCR mix để khuếch đại gen 16S rRNA SV gel & PCR cleanup system (Promega) Tinh sản phẩm PCR Xuất kết giải trình tự để phân tích Đăng nhập vào NCBI BLAST SEARCH Phải lấĐoynồbệ nh phẩm trước bệnh nhân ng độ DNA sử ụng kháng sinh (10pg/µl) Xácnhiễ đònh tê n vitrù khuẩn ng -để tang khả nang phâ n lậ p tá c nhâ n m cần đònh nh Điện di mao quản PCR giải trình tự CEQ 8000 (30X) 96oC/20s 50oC/20s 60oC/4min Agencourt Clean SEQ (Beckman Coulter) DTCS Quickstart mix (Beckman Coulter) Tủa tinh sản phẩm PCR giải trình tự Việc điều trò kháng sinh theo kinh nghiệm không tiệt trừ hoàn toàn ức chế phát triển tác nhân nhiễm trùng nuôi cấy cho kết âm tính giả. Phải lấy bệnh phẩm nuôi cấy trước điều trò kháng sinh, với kháng sinh phổ rộng. Phải lấy bệnh phẩm phương pháp -để tránh bệnh phẩm bò ngoại nhiễm lấy bệnh phẩm cần lấy [...]... Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau Đường hô hấp ưới Streptococcus Vi khuẩn Enterococcus Optochin S pneumoniae Optochin SXT (+) Bile solution CAMP I Tiêu huyết β Viridans streptococcus Chỉ đònh cấy đường hô Rhấp dưới khi Viridans streptococcus I (-) có vi m nhiễm đường hô hấp dưới Bile esculin Vi khuẩ Bacitracin (vi mS pyogenes, n vi m phế CAMP SXT... không lấy mủ trên bề mặt vết thương Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm ¡ vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau Tìm tác nhân gây vi m phổi phải lấy đàm hoặc dòch hút khí phế quản, không lấy nước bọt Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 3 PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG MÁY ĐỊNH DANH TỰ ĐỘNG Phải lấy bệnh phẩm đúng thời điểm -vào PHOENIX... nàysốt,p đònh c lúc bệnh giú hoặ danh chính xác vi khuẩn nhân đang lên cơn sốt 120bps 1542bps 2904bps Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau Nước tiểu Thời điểm tốt nhất để lấy nước tiểu là vào buổi sáng, bệnh nhân cố nhòn tiểu trong đêm cho đến lúc lấy mẫu Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm... lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau Đường sinh ục Đònh danh bằng kits thương mại giúp đònh danh nhanh chóng và chính xác hơn nhờ hệ thống mã đònh danh Chỉ đònh cấy đường sinh dục nghi ngờ bệnh lây truyền bằng đường sinh dục (ở đàn ông và đàn bà) hoặc bò huyết trắng nghi do nhiễm trùng (ở đàn bà) Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh... mũi xoang (S) Vi m tai cấp tính Coagulase ngoài Novobiocin Vi m tai giữa cấp tính hoặMannitoltính c mạn Salt Staphylococcus coagulase negative khác (-) (+) n tính Vi m xoang cấp tinh hoặc mạ S epi ermi is (R) (-) Polymycin B (S) Vi m mũi cấp tính hoặc mạn tính (-) (-) (+) S vùng hầ Vi m nhiễm vùng hầu họng (đau rát schlei eri u họng, niêm mạc hầu họng sưng đỏ, phù nề, Ornithin Alkaline vi m decarboxylase... kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau Mủ và tiết òch PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG Mủ áp-xe KITS THƯƠNG MẠI Chỉ đònh cấy mủ và tiết dòch trong các trường hợp: Vết thương nhiễm trùng (vết loét, lở, mổ hậu phẫu, loét do nằm lâu) Mạch lươn; mạch dẫn xoang hay hạch bạch huyết Dòch tiết (dòch màng phổi, dòch màng bụng…) Mẫu nạo mủ xương khi giải phẫu Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật. .. Tổng điểm của nhóm được số đònh danh thứ nhất Tập hợp các số đònh danh được mã số đònh danh IDS 14GNR- Hệ thống đònh anh Số: …………………………………………………………… …… d trực khuẩn Gram (-), ễ mọc d Tên: ……………………………………………………………………… ISO 9001:2000 WHO GMP/GLP OXI GLU NIT ONPG URE PAD CIT ESC H2s IND VP MLO LDC MOB 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 6 1 3 6 0 Tìm tá nhâ Kết quả đònhcanh: n gây vi m xoang Tìm tác nhân gây nhiễm... CAMP SXT cấp, phổi quản S (-) S cơn cấp của vi m phế quản R n) mạ S agalactidae R (+) C/F/G streptococcus Enterococcus Bacitracin Vi khuẩn Bile esculin Enterococcus R/S (-) R (-) Bile esculin (+) R (-) (+) 6.5 7 Tiêu huyết α S S pseudopneumoniae Bile solution NaCl CAMP (+) Ho có máu,(+) nhiều, đau ho Non enterococcus (-) (-) ngực, khó thở S agalactidae CAMP Viridans streptococcus (-) (+) (-) Có dấu hiệu... 72oC/1min Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau Cho vào PCR mix để khuếch đại gen 16S rRNA 4 SV gel & PCR cleanup system (Promega) Tinh sạch sản phẩm PCR Xuất kết quả giải trình tự để phân tích Đăng nhập vào NCBI BLAST SEARCH Phải lấynồng độ h phẩm trước khi bệnh nhân Đo bện DNA sử ụng kháng sinh (10pg/µl) Xá nhiễm khuẩn đònh tê -để tang khả nang... thuật lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau Các bệnh phẩm khác Quy trình thực hiện Tách chiết DNA : – Vi khuẩn trên m Thời điể mặt thạch – tốt nhất để lấy mẫu là càng vào giai đoạn sớm của bệnh càng tốt, nghóa là ngay khi có chẩn đoán Để lạnh 5min – Lấy khúm khuẩn cho vào TE 1X để làm thành huyền dòch tương đương Mc F 1.0 Đun sôi 10min Ly tâm 5min Lấy dòch nổi Primers Taq polymerase