TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LÊ THỊ NHANH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE TỪ Aspergillus niger BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN RẮN Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE TỪ Aspergillus niger BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN RẮN Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực Trần Thanh Trúc Lê Thị Nhanh MSSV: 2101945 Lớp: CNTP K36 Cần Thơ, 2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Xin cam đoan công trình nghiên cứu sinh viên Lê Thị Nhanh với hƣớng dẫn Ts. Trần Thanh Trúc. Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Một số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp protease từ Aspergillus niger phƣơng pháp lên men rắn” đƣợc hội đồng chấm luận văn thông qua. Cần Thơ, ngày Ngƣời hƣớng dẫn Trần Thanh Trúc tháng năm 2013 Ngƣời viết Lê Thị Nhanh Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng -i- Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Em cảm thấy thật hạnh phúc may mắn đƣợc thực luận văn tốt nghiệp dƣới hƣớng dẫn Trần Thanh Trúc. Lời cảm ơn đầu tiên, em xin đƣợc gởi đến Cô Trần Thanh Trúc giành nhiều thời gian công sức để tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời, Thầy đóng góp cho em nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngại thời gian hƣớng dẫn, em tìm hƣớng giải cho vấn đề phát sinh để có kết thu nhận tốt nhất. Trong suốt trình làm luận văn, em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ nhiệt tình nhƣ ủng hộ, động viên to lớn Chị Lê Thị Bảo Ngọc anh chị phòng thí nghiệm D006, bạn lớp Công nghệ Thực phẩm K36. Xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm – khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ, tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình học tập trƣờng. Cuối cùng, em xin đƣợc gởi lời biết ơn đến gia đình với tất tình yêu khuyến khích, ủng hộ dành cho em suốt chặng đƣờng để hoàn thành đƣợc luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Sinh viên thực Lê Thị Nhanh Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng -ii- Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp protease từ Aspergillus niger phương pháp lên men rắn” thực với mục tiêu nghiên cứu khảo sát số điều kiện lên men thích hợp cho trình sinh tổng hợp protease ưa acid môi trường rắn (SSF) với dòng A.niger đặc hiệu. Kết nghiên cứu xác định điều kiện lên men rắn sinh tổng hợp protease từ dòng A. niger S5 dựa việc khảo sát số yếu tố chất lên men phù hợp, tác động độ ẩm, pH, nhiệt độ thời gian ủ đến hiệu thu nhận protease. Kết cho thấy bột đậu nành chất cho hiệu lên men tổng hợp protease tốt nhất. Quá trình lên men đạt hiệu cao sử dụng dung dịch đệm citrate - phosphate có pH để điều chỉnh độ ẩm môi trường ban đầu, đồng thời môi trường lên men bổ sung dinh dưỡng khoáng chất gồm yeast extract (0,5%), K2HPO4 (0,4%), NaCl (0,1%), MgSO4 (0,05%), thời gian ủ thích hợp 72 nhiệt độ 31C. Ước tính hoạt tính protease đạt điều kiện lên men tốt 0,126  0,012 U/g chất. Từ khóa: Aspergillus niger, bột đậu nành, hoạt tính cao, lên men rắn SSF, protease acid. Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng -iii- Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC  LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN . ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC . iv DANH SÁCH HÌNH . vi DANH SÁCH BẢNG . vii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii Chƣơng MỞ ĐẦU . 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI . 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Chƣơng LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU . 2.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 2.1.1 Tổng quan 2.1.2 Tính chất protease ƣa acid . 2.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động protease 2.1.4 Cơ chế phản ứng enzyme protease 2.1.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến động học protease . 2.1.6 Tầm quan trọng việc sử dụng protease thực tiễn . 2.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC Aspergillus niger 2.2.1 Giới thiệu chung 2.2.2 Đặc điểm hệ sợi nấm Aspergillus niger 10 2.2.3 Cấu tạo quan sinh sản . 10 2.3 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE . 11 2.3.1 Vai trò chất trình sinh tổng hợp protease . 11 2.3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy 14 2.3.3 Độ ẩm môi trƣờng 14 2.3.4 Điều kiện pH ban đầu môi trƣờng . 14 2.3.5 Ảnh hƣởng thời gian ủ 15 2.3.6 Ảnh hƣởng phƣơng thức lên men đến trình tổng hợp protease 15 2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN . 16 Chƣơng PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 19 3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm 19 3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 19 3.1.3 Hóa chất sử dụng . 19 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 20 3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu 20 Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng -iv- Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.2 Phƣơng pháp phân tích đo đạc kết . 20 3.2.3 Phƣơng pháp thu thập xử lý kết . 22 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23 3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23 3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng chất đến trình len men sinh tổng hợp protease môi trƣờng rắn SSF 23 3.3.3 Thí nghiệm : Khảo sát ảnh hƣởng độ ẩm môi trƣờng đến khả thu nhận protease có hoạt tính cao từ Aspergillus niger . 24 3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng pH môi trƣờng ban đầu đến trình sinh tổng hợp protease . 25 3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng thời gian ủ đến trình tổng hợp protease nhiệt độ khác . 26 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 27 4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA CƠ CHẤT LÊN MEN ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE . 27 4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ ẨM MÔI TRƢỜNG LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP PROTEASE HOẠT TÍNH CAO 28 4.3 ẢNH HƢỞNG CỦA pH MÔI TRƢỜNG LÊN MEN BAN ĐẦU ĐẾN KHẢ NĂNG THU NHẬN PROTESE TỪ Aspergillus niger 29 4.4 ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ ĐẾN QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP PROTEASE Ở CÁC NHIỆT ĐỘ KHÁC NHAU 31 4.4.1 Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian ủ tƣơng ứng nhiệt độ 31 4.4.2 Xác định nhiệt độ thích hợp cho trình lên men sinh tổng hợp protease từ A. niger thời gian tối ƣu (72 giờ) . 32 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 KẾT LUẬN 34 5.2 ĐỀ NGHỊ . 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 35 PHỤ LỤC 1. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH . ix PHỤ LỤC 2. SỐ LIỆU THỐNG KÊ .xiii PHỤ LỤC 3. MỘT SỐ HÌNH ẢNH . xxii Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng -v- Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc không gian protease Hình 2.2: Sơ đồ phân loại protease . Hình 2.3: Hình thái Aspergillus sp . 11 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23 Hình 4.1: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính protease thu đƣợc từ trình lên men Aspergillus niger 33 Hình PL1.1: Đƣờng chuẩn Tyrosine xii Hình PL3.1: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu xxii Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng -vi- Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Các chất ức chế protease thông dụng Bảng 2.2: Các chất dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, nguồn gốc chức tế bào nấm mốc Aspergillus sp. 12 Bảng 3.1: Phƣơng pháp thiết bị sử dụng để phân tích tiêu 20 Bảng 3.2: Phƣơng pháp xác định lƣợng tyrosine mẫu . 21 Bảng 4.1: Hoạt tính protease thu đƣợc từ ba nguồn chất lên men 27 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng độ ẩm môi trƣờng lên men đến hoạt tính protease từ dòng nấm mốc A. niger S5 . 28 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng ban đầu đến hoạt tính protease 30 Bảng 4.4: Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian ủ nhiệt độ khác 31 Bảng PL1.1: Cách pha dung dịch đệm citrate – phosphate ix Bảng PL1.2: Xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ tyrosine xi Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng -vii- Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT A. niger Aspergillus niger CFU Colony Forming Unit (mật số bào tử hình thành) EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid EGTA Ethylene Glycol Tetra Acetic acid KCN Khu Công Nghiệp PMSF Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride rpm revolutions per minute SSF Solid State Fermentation TNHH Trách Nhiệm Hữu Hạn TTHĐ Trung Tâm Hoạt Động U Đơn vị hoạt tính enzyme U/g Units per weight (gram) of substrate (hoạt tính enzyme g chất) U/mL Units per volume (mL) of substrate (hoạt tính enzyme mL chất) v/w volume/weight (tỷ lệ thể tích/khối lƣợng) Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng -viii- Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ aqueous two-phase systems using response surface methodology. Biotechnol. Lett, 31: 43-47. Qazi, I. J., H. Jamshaid, M. Nadeem and S. S. Ali, 2008. Production of proteases by Aspergillus niger, through solid state fermentation. Punjab Univ. J. Zool., 23: 037-046. Radha, S., A. Sridevi, R. Himakiran Babu, V. J. Nithya, N. B. L. Prasad and V. Narasimha, 2012. Medium Optimization for Acid protease production from Apergillus sp under Solid state fermentation and mathematical modelling of protease activity. J. Microbiol. Biotech. Res., 2: 6-16. Ranganna, S., 1986, Handbook of Analysis and Quality Control for Fruit and Vegetable Products, 2nd Edition, McGraw-Hill Publishing Co. Ltd., New Delhi. Rao, M. B, A. M. Tanksale, M.S. Ghatge, V.V. Deshpande, 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Molec. Biol. Rev, 62: 597-635. Rombouts, M. and W. Pilnik, 1980, “Pectic enzymes”, In: Economic Microbiology, Rose A.H. (Editor), 5, Academic Press, London. Sajjaanantakul, T. and L. A. Pitifer, 1991, “Pectin”, In: The Chemistry and Technology of Pectin, R.H. Walter, (Editor), Academic Press, San Diego, CA, pp 135 – 145. Samarntarn, W., S. Cheevadhanarak and M. Tanticharoen, 1999. Production of alkaline protease by a genetically engineered Aspergillus oryzae U1521. J. Gen. Appl. Microbiol. 45: 99–103. Samson, R. A. and E. S. Van Reenen-Hoekstra 1988, Introduction to food-borne fungi (3 eds). Centraalbureau Voor Schimmelcultures CBS, Utrecht, The Netherlands. Samson, R. A., P. Noonim, M. Meijer, J. Houbraken, J. C. Frisvad and J. Varga, 2007. “Diagnostic tools to identify black aspergilli”, Study in Mycology, 59 (1), pp. 129-145. Shivakumar, S., 2012. Production and characterization of an acid Protease from a local Aspergillus sp by Solid substrate fermentation. Archives of Applied Sciences Research. 4: 188-199. Suresh, B. & T. Viruthagri, 2010, “Optimization and kinectics of pectinase enzyme using Aspergillus niger by solid-state fermentation”, Indian Journal of Science and Technology, 3(8), pp. 867-870. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - 41 - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Tewari, R., Tewari R.P. and Hoondal G.S., 1995, “Microbial pectinase” (chapter 12). In: Microbial Enzymes and Biotransformations, Barredo J.L. (editior), © Humana Press Inc., Totowa, New York, pp. 191–208. Tremacoldi, C. R., N. K. Watanabe and E. C. Carmona, 2004. Production of extracellular acid proteases by Aspergillus clavatus. World J. Microbial. Biotechnol, 20:639-642. Viniegra-Gonzalez, G., E. Favela-Torres, C. N Aguilar, S. Romero-Gomez, G. DiazGodinez and C. Augur, 2003. “Advantages of fungal enzyme production in solid state over liquid fermentation systems”, Biochemical Engineering Journal, 13, pp. 157–167. Vishwamatha, S. K., A. G. Appu Rao and S. A. Singh, 2009. Characterization of acid protease expressed from Aspergillus oryzae MTCC 5341. Food Chemistry, 114: 402-407. Trang web hoahocngaynay.com http://www.scribd.com www.pfdb.net http://en.angelyeast.com/contents/1285/20517.html Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - 42 - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 1. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phần 1: Phƣơng pháp xác định độ ẩm ban đầu nguyên liệu (AOAC 934.06) Cách tiến hành: Lấy cốc sứ đem sấy 105C khối lƣợng không đổi. Để nguội bình hút ẩm cân khối lƣợng xác đến 0,001 g. Sau cho vào cốc khoảng g mẫu. Cân tất cân phân tích với độ xác nhƣ trên. Cho tất vào tủ sấy 105C, sấy khối lƣợng không đổi, thƣờng tối thiểu giờ. Trong thời gian sấy, sau lại dùng đũa thuỷ tinh đầu bẹt nghiền nhỏ phần vón cục, sau dàn tiếp tục sấy. Sấy xong, làm nguội bình hút ẩm (20 - 25 phút) đem cân cân phân tích với độ xác nhƣ trên. Cho lại vào tủ sấy 105C 30 phút, lấy làm nguội bình hút ẩm (20 ÷ 25 phút) đem cân nhƣ tới khối lƣợng không đổi. Kết hai lần cân liên tiếp không đƣợc cách 0,1 mg cho gam mẫu thử. Tính kết quả: Độ ẩm theo phần trăm tính theo công thức: X  m0  m  m1  100 (%) m0 Trong đó: m: Khối lƣợng cốc (g); m0: Khối lƣợng mẫu (g) m1: Khối lƣợng cốc mẫu sau sấy (g). Sai lệch hai lần xác định song song không đƣợc lớn 0,5%. Kết cuối trung bình lần lặp lại. Phần 2: Bảng tra sử dụng cho chuẩn bị dung dịch đệm citrat – phosphate Bảng PL1.1: Cách pha dung dịch đệm citrate – phosphate pH Na2HPO4 0,2M (mL) Acid citric 0,1M (mL) 2,2 0,4 19,6 2,4 1,24 18,76 2,6 2,18 17,82 2,8 3,17 16,83 3,0 4,11 15,89 Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - ix - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3,2 4,94 15,06 3,4 5,7 14,3 3,6 6,44 13,56 3,8 7,1 12,9 4,0 7,71 12,29 4,2 8,28 11,72 4,4 8,82 11,18 4,6 9,35 10,65 4,8 9,86 10,14 5,0 10,3 9,7 5,2 10,72 9,28 5,4 11,15 8,85 5,6 11,6 8,4 5,8 12,09 7,91 6,0 12,63 7,37 6,2 13,22 6,78 6,4 13,85 6,15 6,6 14,55 5,45 6,8 15,45 4,55 7,0 16,47 3,53 7,2 17,39 2,61 7,4 18,17 1,83 7,6 18,73 1,27 7,8 19,15 0,85 8,0 19,45 0,55 Trong đó: - Dung dịch phosphate 0,2 M (mL): 71,7g Na2HPO4.12H2O hòa tan định mức đến 1000 mL. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD -x- Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ - Dung dịch citrate 0,1 M (mL): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan định mức đến 1000 mL. Phần 3: Xây dựng đƣờng chuẩn phƣơng pháp Anson cải tiến xác định hoạt tính protease: (theo Anson, 1938) Dựa vào Bảng PL1.2 xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ tyrosine xác định phƣơng trình đƣờng chuẩn tyrosine. Từ giá trị OD tƣơng ứng với hàm lƣợng tyrosine biết, xác định phƣơng trình đƣờng chuẩn tyrosine sử dụng để xác định hàm lƣợng tyrosine mẫu. Bảng PL1.2: Xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ tyrosine Ống nghiệm 10 Dung dịch tyrosine chuẩn mM (mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Dung dịch HCl 0,2 N (mL) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Dung dịch NaOH 0,5 N (mL) Thuốc thử Folin (mL) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lƣợng tyrosine (µmol) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Lắc để yên 10 phút đem đo mật độ quang bƣớc sóng 660 nm Trong đó:  Dung dich HCl 0,2 N: trộn 4,25 mL HCl đậm đặc với nƣớc cho đủ 250 mL.  Dung dịch Tyrosine 20 µM/L : khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosin dung dịch HCl 0,2 N vừa đủ 500 mL.  Dung dịch Tyrosin chuẩn µM/L dung dịch HCl 0,2 N: pha loãng mL dung dịch Tyrosine 20 µM/L dung dịch HCl 0,2 N thành 100 mL. Vẽ đƣờng chuẩn tyrosine tƣơng quan lƣợng tyrosine (µM) ΔOD (ΔOD = ODTN - ODKC ). Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xi - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ 1,6 Chì số dalta OD 1,4 1,2 y = 1,3868x R² = 0,9932 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 Nồng độ tyrosine Hình PL1.1: Đƣờng chuẩn Tyrosine Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xii - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 2. SỐ LIỆU THỐNG KÊ Phần 1. Ảnh hƣởng chất đến trình sinh tổng hợp protease từ Aspergillus niger ANOVA Table for Protease by Co chat len men Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,0035205 0,00176025 9,51 0,0138 Within groups 0,00111 0,000185 Total (Corr.) 0,0046305 Multiple Range Tests for Protease by Co chat len men Method: 95,0 percent LSD Co chat len men Count Mean Bot mi 0,0385 X Cam gao 0,054 X Dau nanh 0,086 Contrast X Sig. Difference +/- Limits Bot mi - Cam gao Bot mi - Dau nanh Homogeneous Groups * Cam gao - Dau nanh * -0,0155 0,0271744 -0,0475 0,0271744 -0,032 0,0271744 * denotes a statistically significant difference. Phần 2. Ảnh hƣởng độ ẩm môi trƣờng lên men đến khả sinh tổng hợp protease ANOVA Table for Protease by Do am MT Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,00108867 0,000272167 3,85 0,0381 Within groups 0,000706667 10 0,0000706667 Total (Corr.) 0,00179533 14 Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xiii - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Multiple Range Tests for Protease by Do am MT Method: 95,0 percent LSD Do am MT Count Mean Homogeneous Groups 70% 0,0683333 X 50% 0,069 65% 0,0733333 X 60% 0,0796667 XX 55% 0,0913333 X X Contrast Sig. Difference +/- Limits 50% - 55% * -0,0223333 0,0152934 50% - 60% -0,0106667 0,0152934 50% - 65% -,00433333 0,0152934 50% - 70% 0,000666667 0,0152934 55% - 60% 0,0116667 0,0152934 55% - 65% * 0,018 0,0152934 55% - 70% * 0,023 0,0152934 60% - 65% 0,00633333 0,0152934 60% - 70% 0,0113333 0,0152934 65% - 70% 0,005 0,0152934 * denotes a statistically significant difference. Phần 3. Ảnh hƣởng pH môi trƣờng ban đầu đến thay đổi hoạt tính protease ANOVA Table for Protease by pH moi truong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,0133578 0,0022263 13,89 0,0 Within groups 0,002244 14 0,000160286 Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xiv - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Total (Corr.) ,0156018 Trường Đại học Cần Thơ 20 Multiple Range Tests for Protease by pH moi truong Method: 95,0 percent LSD pH moi truong Count Mean Homogeneous Groups 0,0486667 X 0,0706667 XX 0,075 X 0,086 X DC (nuoc cat) 0,0913333 X 0,118 X 0,127 X Contrast Sig. Difference 3-4 +/- Limits -,00433333 ,0221711 3-5 * -,0563333 ,0221711 3-6 * -,0473333 ,0221711 3-7 -,0153333 ,0221711 3-8 ,022 ,0221711 - DC (nuoc cat) -,0206667 ,0221711 4-5 * -,052 ,0221711 4-6 * -,043 ,0221711 -,011 ,0221711 ,0263333 ,0221711 - DC (nuoc cat) -,0163333 ,0221711 5-6 ,009 ,0221711 4-7 4-8 * 5-7 * ,041 ,0221711 5-8 * ,0783333 ,0221711 - DC (nuoc cat) * ,0356667 ,0221711 6-7 * ,032 ,0221711 6-8 * ,0693333 ,0221711 - DC (nuoc cat) * ,0266667 ,0221711 Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xv - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 7-8 * - DC (nuoc cat) - DC (nuoc cat) * Trường Đại học Cần Thơ ,0373333 ,0221711 -,00533333 ,0221711 -,0426667 ,0221711 * denotes a statistically significant difference. Phần 4. Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian ủ nhiệt độ khác + Nhiệt độ 28oC ANOVA Table for Protease by Thoi gian u Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,0140987 0,00352467 14,92 0,3 Within groups 0,00236267 10 0,000236267 Total (Corr.) 0,0164613 14 Multiple Range Tests for Protease by Thoi gian u Method: 95,0 percent LSD Thoi gian u Count Mean Homogeneous Groups 24 0,0176667 X 48 0,0606667 X 120 0,067 96 0,0806667 X 72 0,108667 Contrast Sig. Difference +/- Limits 24 - 48 * -0,046 0,027964 24 - 72 * -0,094 0,027964 24 - 96 * -0,066 0,027964 24 - 120 * -0,0523333 0,027964 48 - 72 * -0,048 0,027964 48 - 96 -0,02 0,027964 48 - 120 -0,00633333 0,027964 0,028 0,027964 72 - 96 * X X Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xvi - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 72 - 120 * 96 - 120 Trường Đại học Cần Thơ ,0416667 0,027964 ,0136667 0,027964 * denotes a statistically significant difference. + Nhiệt độ 31oC ANOVA Table for Protease by Thoi gian u Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,0113837 0,00284593 17,76 0,2 Within groups 0,001602 10 0,0001602 Total (Corr.) 0,0129857 14 Multiple Range Tests for Protease by Thoi gian Method: 95,0 percent LSD Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups 24 0,045 X 120 0,0693333 X 48 0,0623333 X 96 0,0846667 X 72 0,126333 X Contrast Sig. Difference +/- Limits 24 - 48 * -0,0173333 0,016956 24 - 72 * -0,0813333 0,016956 24 - 96 * -0,0396667 0,016956 24 - 120 * -0,0173333 0,016956 48 - 72 * -0,064 0,016956 48 - 96 * -0,0223333 0,016956 0,004 0,016956 48 - 120 72 - 96 * 0,0416667 0,016956 72 - 120 * 0,064 0,016956 96 - 120 * 0,0223333 0,016956 Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xvii - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xviii - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ + Nhiệt độ 34oC ANOVA Table for Protease by Thoi gian u Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,566 Between groups 0,00290627 0,000726567 Within groups 0,00219267 10 0,000219267 Total (Corr.) 0,00509893 14 3,31 Multiple Range Tests for Protease by Thoi gian u Method: 95,0 percent LSD Thoi gian u Count Mean Homogeneous Groups 24 0,0363333 X 48 0,0473333 X 120 0,0476667 X 96 0,0553333 XX 72 0,078 X Contrast Sig. Difference +/- Limits -0,011 0,0269392 -0,0416667 0,0269392 24 – 96 -0,019 0,0269392 24 – 120 -0,0113333 0,0269392 -0,0306667 0,0269392 48 – 96 -0,008 0,0269392 48 – 120 -0,000333333 0,0269392 72 – 96 0,0226667 0,0269392 0,0303333 0,0269392 0,00766667 0,0269392 24 – 48 24 – 72 48 – 72 72 – 120 96 – 120 * * * * denotes a statistically significant difference. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xix - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ + Nhiệt độ 37oC ANOVA Table for Protease by Thoi gian u Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,222 Between groups 0,003608 0,000902 Within groups 0,00194 10 0,000194 Total (Corr.) 0,005548 14 4,65 Multiple Range Tests for Protease by Thoi gian u Method: 95,0 percent LSD Thoi gian u Count Mean Homogeneous Groups 24 0,026 X 48 0,041 X 120 0,0433333 X 96 0,0513333 XX 72 0,0733333 X Contrast Sig. Difference +/- Limits -0,015 0,0253395 -0,0473333 0,0253395 24 - 96 -0,0253333 0,0253395 24 - 120 -0,0173333 0,0253395 -0,0323333 0,0253395 48 - 96 -0,0103333 0,0253395 48 - 120 -0,00233333 0,0253395 72 - 96 0,022 0,0253395 0,03 0,0253395 0,008 0,0253395 24 - 48 24 - 72 48 - 72 72 - 120 96 - 120 * * * * denotes a statistically significant difference. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xx - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ + Xác định nhiệt độ tối thích thời gian ủ 72h ANOVA Table for Protease by Nhiet Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,135 Between groups 0,00575092 0,00191697 Within groups 0,002248 0,000281 Total (Corr.) 0,00799892 11 6,82 Multiple Range Tests for Protease by Nhiet Method: 95,0 percent LSD Nhiet Count Mean Homogeneous Groups 37 0,0733333 X 34 0,078 XX 28 0,108667 XX 31 0,126333 X Contrast Sig. Difference +/- Limits 28 – 31 -0,0176667 0,0315623 28 – 34 0,030667 0,0315623 28 – 37 * 0,0353333 0,0315623 31 – 34 * 0,0483333 0,0315623 31 – 37 * 0,053 0,0315623 0,00466667 0,0315623 34 – 37 * denotes a statistically significant difference. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xxi - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 3. MỘT SỐ HÌNH ẢNH a) Nồi trùng d) Máy ly tâm lạnh b) Tủ cấy Dalton c) Tủ ủ Sanyo e) Máy đo quang phổ f) pH kế Hình PL3.1: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp SHƯD - xxii - [...]... các nội dung nghiên cứu sau: 1) Khảo sát ảnh hƣởng của cơ chất đến quá trình lên men rắn sinh tổng hợp protease 2) Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến khả năng thu nhận protease có hoạt tính cao từ Aspergillus niger 3) Khảo sát ảnh hƣởng của pH ban đầu đến quá trình sinh tổng hợp protease 4) Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ủ đến quá trình tổng hợp protease ở các nhiệt độ khác nhau Ngành Công... với A niger, quá trình sinh tổng hợp enzyme nhiều nhất thƣờng kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) 2.3.6 Ảnh hƣởng của phƣơng thức lên men đến quá trình tổng hợp protease Trong việc sản xuất protease từ vi sinh vật, cả hai kỹ thuật: lên men chìm (SmF) và lên men bề mặt (SSF) đều có thể đƣợc sử dụng (Pandey et al., 2001; Mukhtar và Haq, 2008) Tuy nhiên, quá trình lên men. .. trị tối ƣu của các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh proease acid đã đƣợc tìm thấy với độ ẩm 60% (v/w), nhiệt độ ủ 32 ± 2°C, thời gian ủ 5 ngày và pH 5,0 Bên cạnh đó, việc ứng dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng trong tối ƣu hóa quá trình lên men sinh tổng hợp protease từ A oryzae cũng đƣợc áp dụng (Deepak et al., 2008 ; Gerritse et al., 2007) Ở Việt Nam, một số nghiên cứu về tổng hợp protease từ vi sinh. .. nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của cơ chất đến quá trình len men sinh tổng hợp protease trên môi trƣờng rắn SSF Mục đích: Tìm ra loại cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease đạt hiệu quả cao Kết quả này đƣợc sử dụng làm thông số cố định cho các thí nghiệm sau Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố Nhân tố A: Cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp protease A1: Bột... nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp protease cần đƣợc tiến hành một cách cụ thể thông qua các bƣớc khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình sinh tổng hợp protease từ dòng nấm mốc trên 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài này là tìm ra điều kiện lên men thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease ƣa acid trên môi trƣờng rắn (SSF) với dòng A .niger đặc hiệu Từ mục tiêu nghiên... của vi sinh vật, mà còn là một cơ chất cảm ứng, xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp protease Nguồn nitrogen cũng có vai trò nhƣ chất cảm ứng, ảnh hƣởng không nhỏ đến quá trình sinh tổng hợp protease Nitrogen tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật Tuy nhiên, khi nồng độ nitrogen tăng cao sẽ là chất kìm hãm cho sự sinh tổng hợp enzyme... tử hợp thành phân tử enzyme, acid amin có ảnh hƣởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng nhƣ quá trình sinh tổng hợp enzyme Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitrogen và là nguồn năng lƣợng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) 2.3.1.2 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng Các nguyên tố đa vi lƣợng có ảnh hƣởng lớn đến sự sinh trƣởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Phospho cần để tổng hợp. .. khối bào tử đính màu đen 2.3 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE 2.3.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình sinh tổng hợp protease Các loại nấm mốc trong tự nhiên có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống Với mỗi nguồn cơ chất nhất định, chúng sẽ sinh tổng hợp enzyme tƣơng thích, đặc hiệu với cơ chất đó nhằm chuyển cơ chất từ dạng phức tạp khó hấp thu... có khả năng sinh tổng hợp enzyme với hoạt tính tƣơng đồng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) Ngoài ra, để sản xuất enzyme từ vi sinh vật, quá trình lên men rắn (SSF) thƣờng đƣợc thực hiện Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi để sản xuất protease Quá trình này sử dụng các cơ chất rẻ tiền thƣờng là các phụ phẩm nông nghiệp với các điều kiện tối ƣu cho quá trình lên men nhằm đạt giá trị thu hồi protease cao... Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu đến quá trình sinh tổng hợp protease Mục đích: Xác định giá trị pH ban đầu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt lực protease tích lũy đƣợc Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên gồm một nhân tố với ba lần lặp lại Nhân tố C: pH ban đầu của dung dịch đệm sử dụng để điều chinh độ ẩm môi trƣờng lên men C1: 3 C2: 4 C 3: 5 C4: 6 C5 :7 C6 :8 Tổng số nghiệm . hiện Trần Thanh Trúc Lê Thị Nhanh MSSV: 2101945 Lớp: CNTP K 36 Cần Thơ, 2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa. viên to lớn của Chị Lê Thị Bảo Ngọc và các anh chị trong phòng thí nghiệm D0 06, các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm K 36. Xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm. men tốt nhất là 0,1 26  0,012 U/g cơ chất. Từ khóa: Aspergillus niger, bột đậu nành, hoạt tính cao, lên men rắn SSF, protease acid. Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại