TRNG I HC CN TH KHOA NễNG NGHIP & SINH HC NG DNG PHAN TH BCH NGC NGHIấN CU TRCH LY PROTEASE T THT U TễM S Lun tt nghip i hc Ngnh: CễNG NGH THC PHM Cn Th, 12/2013 TRNG I HC CN TH KHOA NễNG NGHIP & SINH HC NG DNG Lun tt nghip Ngnh: CễNG NGH THC PHM Tờn ti: NGHIấN CU TRCH LY PROTEASE T THT U TễM S Giỏo viờn hng dn: Sinh viờn thc hin: PGs.Ts. Nguyn Vn Mi Phan Th Bớch Ngc MSSV: 2101943 Lp Cụng ngh Thc phm K36 Cn Th, 2013 Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th LI CAM OAN Em xin cam oan õy l cụng trỡnh nghiờn cu ca sinh viờn Phan Th Bớch Ngc vi s hng dn ca PGs. Ts. Nguyn Vn Mi. Cỏc s liu v kt qu trỡnh by lun l trung thc v chớnh tỏc gi thc hin. Lun ớnh kốm theo õy, vi ti Nghiờn cu trớch ly protease t tht u tụm sỳ ó c hi ng chm lun thụng qua. Cn Th, ngy 09 thỏng 12 nm 2013 Ngi hng dn Nguyn Vn Mi Ngi vit Phan Th Bớch Ngc Ngnh Cụng ngh Thc phm, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng -i- Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th LI CM N Em xin chõn thnh by t lũng bit n sõu sc ti: Thy Nguyn Vn Mi v cụ Trn Thanh Trỳc, nhng ngi ó trc tip hng dn, giỳp em tn tỡnh. ng thi cung cp nhiu kin thc v to iu kin thun li cng nh gii ỏp nhng thc mc ca em sut quỏ trỡnh thc hin ti. Cụ Nguyn Th Hong Minh, cỏn b phũng thớ nghim D006 ó to iu kin thun li cho em hon thnh tt ti ca mỡnh. Chõn thnh cỏm n s ging dy v truyn t kin thc ca cỏc Thy Cụ Trng i hc Cn Th, c bit l B mụn Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng, Trng i hc Cn Th. Anh Trn Bch Long hc viờn Cao hc ngnh Cụng ngh Sinh hc khúa 19, anh ó truyn t cho em nhiu kinh nghim, giỳp em tn tỡnh v kin thc cng nh phng phỏp hc tp, nghiờn cu. Cỏc bn bố thõn yờu v thy c hc kớnh mn ca lp Cụng ngh thc phm khúa 36 ó ng viờn, chia s kinh nghim bun vui sut thi gian hc bờn v cng nh ht lũng h tr, giỳp em quỏ trỡnh nghiờn cu ti. Cỏc anh ch v cỏc bn thc cựng phũng thớ nghim D006 ó giỳp rt nhiu quỏ trỡnh nghiờn cu ti. Con cm n cha m, nhng ngi thõn ó trang b tinh thn ln vt cht v l hnh trang cho bc vo i. Cui li em xin gi li cm n chõn thnh n ton th quý thy cụ trng i hc Cn Th ó tn tỡnh truyn t kin thc cho em sut bn nm hc ti trng. Kớnh chỳc quý thy cụ v cỏc bn luụn di sc khe v thnh cụng. Em xin chõn thnh cm n. Cn Th, ngy 09 thỏng 12 nm 2013 Sinh viờn thc hin Phan Th Bớch Ngc Ngnh Cụng ngh Thc phm, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng -ii- Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th TểM TT ti tin hnh kho sỏt mt s yu t nh hng n kh nng trớch ly protease t mu tht u tụm sỳ sn phm ph ca ngnh ch bin tụm ụng lnh. nh hng ca t l nguyờn liu v dung mụi (w/v) trớch ly, iu kin pH ca mụi trng, c bit l tỏc ng tng tỏc ca nhit v thi gian trớch ly n hiu qu thu nhn protease t tht u tụm sỳ ó c kho sỏt theo phng phỏp b mt ỏp ng vi cu trỳc cú tõm. Kt qu kho sỏt cho thy, dch chit protease thu c t tht u tụm sỳ cú hot tớnh ti u l 13,48 U/g CKNL (cht khụ nguyờn liu) s dng dung dch m glycine - NaOH vi pH lm dung mụi trớch ly vi t l nguyờn liu v dung mụi l 1: (w/v). Vic ỏp dng phng phỏp b mt ỏp ng ó xỏc nh c iu kin nhit v thi gian ti u ln lt l 46 C v 44,6 phỳt. T khúa: nhit , pH, protease, tht u tụm sỳ, thi gian, t l dung mụi. Ngnh Cụng ngh Thc phm, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng -iii- Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th MC LC LI CAM OAN i LI CM N . ii TểM TT iii MC LC iv DANH SCH HèNH . vi DANH SCH BNG . vii DANH SCH T VIT TT viii Chng TNG QUAN . 1.1 T VN . 1.2 MC TIấU NGHIấN CU Chng LC KHO TI LIU . 2.1 THT U TễM S - NGUN NGUYấN LIU LY TRCH ENZYME PROTEASE . 2.1.1 Tụm sỳ ngun thy sn lnh ụng xut khu . 2.1.2 Thc trng x lý v tiờu th tht u tụm sỳ nc ta 2.2 KHI QUT V PROTEASE V H PROTEASE TRONG THU SN 2.2.1 Tng quan v protease . 2.2.2 H serine protease 2.2.3 Protease ca tụm sỳ 10 2.2.4 Kh nng ng dng protease . 11 2.3 C S Lí THUYT CA VIC TRCH LY PROTEASE T T BO NG VT . 13 2.3.1 Lý thuyt chung . 13 2.3.2 Cỏc yu t nh hng n quỏ trỡnh trớch ly ca enzyme 14 2.4 QUY HOCH THC NGHIM XC NH IU KIN TRCH LY THCH HP BNG PHNG PHP B MT P NG (RSM) . 16 2.5 TèNH HèNH NGHIấN CU TRONG V NGOI NC V TRCH LY V NG DNG CA PROTEASE NGUN GC NG VT . 17 2.5.1 Nghiờn cu nc 17 2.5.2 Nghiờn cu ngoi nc 17 Chng PHNG TIN V PHNG PHP NGHIấN CU 19 3.1 PHNG TIN TH NGHIM 19 3.1.1 a im, thi gian thớ nghim 19 3.1.2 Dng c thớ nghim 19 3.1.3 Húa cht s dng . 19 3.2 PHNG PHP NGHIấN CU . 20 3.2.1 Nguyờn liu 20 3.2.2 Phng phỏp chun b mu 20 Ngnh Cụng ngh Thc phm, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng -iv- Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th 3.2.3 Phng phỏp trớch ly enzyme protease t tht u tụm sỳ . 20 3.2.4 Phng phỏp phõn tớch v o c kt qu . 20 3.2.5 Phng phỏp thu thp v x lý kt qu . 21 3.3 NI DUNG NGHIấN CU 22 3.3.1 S b trớ thớ nghim tng quỏt 22 3.3.2 Xỏc nh thnh phn húa lý v hot tớnh protease ban u cú tht u tụm . 22 3.3.3 Thớ nghim 1: Xỏc nh t l mu v dung mụi trớch ly protease t tht u tụm sỳ phự hp 23 3.3.4 Thớ nghim 2: Kho sỏt nh hng ca pH mụi trng n hiu qu trớch ly protease 24 3.3.5 Thớ nghim 3: Xỏc nh tng tỏc ca nhit v thi gian n hiu qu trớch ly protease 26 Chng KT QU V THO LUN . 29 4.1 THNH PHN HểA Lí C BN CA THT U TễM 29 4.2 NH HNG CA T L NGUYấN LIU V DUNG MễI N QU TRèNH TRCH LY ENZYME PROTEASE T THT U TễM S 30 4.3 NH HNG CA VIC IU CHNH pH MễI TRNG N HIU QU TRCH LY PROTEASE 31 4.4 NH HNG CA TNG TC NHIT V THI GIAN TRCH LY N HIU QU THU NHN PROTEASE T THT U TễM S 32 Chng KT LUN V NGH 38 5.1 KT LUN 38 5.2 NGH . 38 TI LIU THAM KHO . 39 PH LC PHNG PHP PHN TCH . ix PH LC KT QU THNG Kấ . xiii PH LC S LIU XY DNG NG CHUN TYROSINE xix Ngnh Cụng ngh Thc phm, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng -v- Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th DANH SCH HèNH Hỡnh 2.1 Tụm sỳ Penaeus monodon . Hỡnh 2.2 Phn ng thy phõn liờn kt peptide tỏc ng ca protease . Hỡnh 2.3 C ch xỳc tỏc ca endopeptidase v exopeptidase . Bng 2.2 Mt s serine protease cú ngun gc ng vt thụng dng hin Hỡnh 2.4 S cỏc bc xỳc tỏc c bn ca nhúm serine protease . Hỡnh 2.5 Hỡnh dng cỏc gc amino acid cỏc tỳi khỏc ca serine protease . Bng 3.1 Phng phỏp phõn tớch v o c kt qu c s dng 20 Hỡnh 3.1 S b trớ thớ nghim tng quỏt 22 Hỡnh 3.2 S b trớ thớ nghim . 24 Hỡnh 3.3 S b trớ thớ nghim . 25 Hỡnh 3.4 S b trớ thớ nghim . 28 Hỡnh 4.3 nh hng ca cỏc tha s kho sỏt (tng tỏc n, tng tỏc a) n quỏ trỡnh trớch ly protease t tht u tụm sỳ . 34 Hỡnh 4.4 th biu din s tng tỏc ca nhit v thi gian n hot tớnh ca enzyme protease c chit tỏch 35 Hỡnh 4.5 th biu din s tng tỏc ca nhit v thi gian trớch ly n hot tớnh ca enzyme protease c chit tỏch 36 Hỡnh 4.6 th tng quan gia hat tớnh protease xỏc nh bng thc nghim v tớnh toỏn theo phng trỡnh hi quy . 36 Hỡnh PL1 . ng chun Tyrosine . xx Ngnh Cụng ngh Thc phm, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng -vi- Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th DANH SCH BNG Bng 2.1 Thnh phn húa lý c bn ca tht u tụm sỳ Bng 2.2 Mt s serine protease cú ngun gc ng vt thụng dng hin Bng 3.1 Ma trn quy hoch thc nghim quỏ trỡnh trớch ly protease t tht u tụm . 27 Hỡnh 4.1 nh hng ca t l mu v dung mụi n quỏ trỡnh trớch ly protease t tht u tụm sỳ 30 Bng 4.2 Kho sỏt nh hng ca pH ng vi dung mụi n hiu qu trớch ly protease . 32 Bng 4.3 nh hng ca cỏc nhõn t mó húa i vi phng trỡnh hi quy 33 Bng PL1 Xõy dng ng chun nng tyrosine . ix Bng PL2 Phng phỏp xỏc nh lng tyrosine mu x Bng PL3 B trớ thớ nghim xõy dng ng chun tyrosine . xix Bng PL4 S liu xõy dng ng chun tyrosine . xix Ngnh Cụng ngh Thc phm, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng -vii- Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th DANH SCH T VIT TT CCD Central Composite Design CKNT Cht khụ ni tng CKTT Cht khụ tht u tụm CPE Ch phm enzyme DC Dch chit DFP Diisopropyl Fluoridate Phospho vtn n v thớ nghim EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EMS Early Mortality Syndrome HLSO Head Less Shell On IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology LysNA Lys-- Naphthylamide PMSF Phenyl Methane Sulfonyl Flouride (PMSF) SBTI Soya Bean Trypsin Inhibitor RSM Response Surface Methods TCA Trichloacetic acid U/g Units per weight (gam) of substrate U/mL Units per volume (mL) of substrate VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers W/v Weight/volume Ngnh Cụng ngh Thc phm, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng -viii- Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th Hernandez-Cortez, P., Whitaker, J.R. and Garcia-Carreno, F.L., 1997. Purification and characterization of chymotrypsinee from Penaeus vannamei (Crustacea Decapoda). J. Food Biochemistry 21, 497-5 14. Holthuis L.B., 1980. An annotated catalogue of species of interest to fisheries, FAO catalogue vol.1 - Shrimps and prawns of the world, FAO Fisheries Synopsis No.125. Honjo, I., Kimura, S. and Nonaka, M., 1990. Purification and characterization of trypsine-like enzyme from shrimp Penaeus indicus. Nippon Suisan Gakaishi 56, 1627- 1634. Howgate, P.F and Ahmed, S.F., 1972. Chemical and bacteriological changes in Fish muscle during heating and drying at 30C, J.Science Food and Agriculture, pp.23-25. Huss, H.H., 1994. Quality and quality changes of fresh fish, Food and agriculture organization of the United Nations, pp.92-95. Joo, H. S., & Chang, C. S., 2006. Production of an oxidant and SDS - Stable alkaline protease from an alkalophilic Bacillus clausii 1-52 submerged fermentation, Feasibility as a laundry detergent additive. Enzyme and Microbial Technology, 38, 176183. Lonsane B.K. & Krishnaiah M.M., 1992. Product leaching and downstream processing. In: Solid substrate Cultivation (editied by Doelle H.W., Mitchell D.A. & Rolz C.E., Elsevier Science Publishers, UK, pp. 147153. McCabe W.L., Smith J.C & Harriot P., 1993. Unit operation of chemical engineering, McGraw-Hill Chemical Engineering Series.Accensi F., Cano J., Figuera L., Abarca M.L. and Cabaủes F.J. (1999), New PCR method to differentiate species in the Aspergillus niger aggregate, FEMS Microbiology Letters, 180(2), pp. 191196. Min Soo Heu; Jin Soo Kim; Fereidoon Shahidi, 2002. Componets and nutritional quality ũ shrimp processing by products. Nedra EL Hadj Ali. Noomen Hmidet. Olfa Ghorbel Bellaaj. Nahed Fakhfakh Zouari. Ali Bougatef. Moncef Nasri, 2010. Solvent Stable digestive proteinases from striped seabream (lithognathus mormyrus) viscera: Characteristics, and evaluation in laundry commercial detergents. Nip, W.K., Lan, C.Y. and Moi, J.H., 1985. Partial characterization of collagenolytic enzyme fraction from the hepatopancreas of the fresh water prawn, Macrobrachium rosenbergii. J. Food Sci. 50, 1187-1 192. Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD 41 Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th Owens, J.D and Mendoza, L.S., 1985. Enzymically hydrolysed and bacterially fermented fishery products. J. Food Technology, pp.220-224. Palit S. and Banerjee R., 2001. Optimization of extraction parameters for recovery of -amylase from the fermented bran of Bacillus circulans GRS313, Brazilian Archives of Biology and Technology, 44, pp. 107111. Saurel R., Gavrilyuk S. and Renaud F., 2003. A multiphase model with internaldegrees of freedom: application to shock-bubble interaction, Journal of Fluid Mechanics, 495, pp. 283-321. Suutarinen M. and Autio K., 2004. Improving the texture of frozen fruit: the case of berries. In: Kilcas D. (Editor), Texture of food Volume 2: Solid foods, Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC. Rao D.G., 2010. Chapter 20 Extraction. In: Fundamentals of Food Engineering (editied by Rao D.G.), PHI Learning Private Limitted, New Delhi, pp 364-387. Reed, G. and T.W.Nagodawithana, 1995.Biotechnology. vol.9. Enzymes, Biomass, Food and Feed, Weinheim, pp.305-314. Robert, S.M., N.J. Turner, A.J. Willets, and M.K. Turner, 1995. Introduction to Biocatalis using Enzymes and Micro-organisisms, Cambridge University Press, pp.101-103. Rodney. F. B, 1993. Modern experimental biochemistry, The Benjamin/Cummings Publishin Company, Inc, 555 pp. Roe. S, Protein purification techniques, Oxford University press, 262p (2001). Ronald R.Eitenmiller and Selwyn C.Desouza, 1984. Enzymatic Mechanisms for Amine Formation in Fish, Repr. From ACS symposium series No. 262, pp.428-431. Roy, P., Colas, B. and Durand, P., 1996. Purification and molecular characterization of a serine collagenolytic protease from greenshore crab (Cecinus maenas). Comp. Biochem. Physiol. 115B, 87-95. Tran T.T., Huynh V.N. & Nguyen V.M., 2011. Evaluation the ability to recover and use the meat of Black Tiger shrimp (Penaeus monodon) head. The abstract proceedings of The 2nd conference of Food Safety and Food Quality in South-East Asia. Challenges for the next decade , 9-12 November 2011, Viet Nam, 43 pp. Trung T.S., Ng C-H., Stevens W.F., 2003. Preparation of decrystallized chitosan from shrimp shell waste and its application in the decolorization of textile Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD 42 Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th waste water, Proceedings National Chitosan Conference Chulalongkorn University Thailand. pp. 92-95. Van Wormhoudt, A., Chevalier L.E. and Sellos, D., 1992. Purification, biochemical characterization and N-terminal sequence of a serine-protease with chymotryptic and collagenolytic activities in a tropical shrimp, Penaeus vunnamei (Crustacea, Decapoda). Comp. Biochem. Physiol. 103B, 675-680. Walstra, P., T.J. Geurts, A. Noomen, A. Jellema, and van Boekel M.A.J.S., 1999. Food fermentation, Publisher Marcel Dekker, Inc, New York. pp.176-183. Yaneza, F. ; Castillo R. ; Pacheco-Aguilar R., Garcia-Carreno F.L. and de Los Angeles Navarrete-Del Toro M., 2004. Characterization of Acidic Proteolytic Enzymes from Monterey sardine (Sardinops sagas caerulae) viscera. J. Food Chem 85, pp 343-350. Internet http://healthyrecipes.wikia.com/wiki/File:Black_Tiger_Prawn_Jumbo_Size.jpg (28/11/2013) Tp Thng mi Thu sn VASEP (truy cp 15/11/2013) http://www. vasep.com.vn (truy cp 15/11/2013) http://www. fistenet.gov.vn (truy cp 15/11/2013) Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD 43 Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 PH LC Trng i hc Cn Th PHNG PHP PHN TCH 1. Xỏc nh hot tớnh bng phng phỏp Anson Theo phng phỏp Anson ci tin (Anson, 1938) s dng casein nh c cht. Nguyờn tc: Cho protease tỏc dng vi c cht l casein, sn phm to thnh l cỏc peptide ngn hay acid amin, cỏc loi acid amin, tyrosine chim a s. Xỏc nh tyrosine bng phn ng mu vi thuc th Folin, t ú xỏc nh hot protease theo nh ngha. Mt n v hot ca protease c biu th l s micromole tyrosine sinh thu phõn casein bi mL dung dch hay mg ch phm protease thi gian phỳt iu kin chun (30 C, pH 7,6). Hot tớnh enzyme c kho sỏt nhit 30 oC v pH = 7,6. Bng PL1 Xõy dng ng chun nng tyrosine ng nghim Dung dch tyrosine chun mM (mL) Dung dch HCl 0,2 N (mL) Dung dch NaOH 0,5 N (ml) Thuc th Folin (mL) 0,6 Lng tyrosine (àmol) 10 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Lc v yờn 10 phỳt em o mt quang bc súng 660 nm Cỏch thc hin o hm lng tyrosine ca mu c tin hnh theo Bng PL.2. Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD ix Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th Bng PL2 Phng phỏp xỏc nh lng tyrosine mu Dung dch húa cht ng nghim Mu i chng Casein 1% (ml) TCA 10% (ml) Dch enzyme mu (ml) TCA 10% (ml) Dch enzyme mu (ml) Lc u v gi 30 C; 30 phỳt Lc, ly ml dch lc thc hin phn ng mu Dch lc (ml) Dung dch NaOH 0,5 N (ml) Thuc th Folin 0,6 0,6 Lc u, yờn 10 phỳt, o OD bc súng 660 nm T kt qu o OD v phng trỡnh ng chun tyrosine, s s àmol tyrosine c xỏc nh v tỡm hot tớnh ca protease 1ml dch trớch theo cụng thc 3.1. Cỏch tớnh: Hot protease Hot protease (UI/ml) = x V K (3.1) vt x: S àmol tyrosine suy t ng chun. V: Tng th tớch hn hp phn ng enzyme (11 mL). v: Th tớch dch lc em phõn tớch (1mL). K: pha loóng mu. t: Thi gian phn ng (30 phỳt). a: Hot protease c xỏc nh theo nh ngha (U/mL dch chit enzyme). U (Anson) = àmol Tyrosin/mL/phỳt hoc U = àmol/mg/phỳt. Tng hot tớnh protease cú mu (A) c xỏc nh theo cụng thc (3.2): a. Vm A (U/g CKTT) = (3.2) mk Vm : Tng th tớch dch chit protease thụ (mL). mk : Khi lng cht khụ ca mu tht u tụm sỳ s dng trớch ly protease (g). Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD x Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th A: Tng hot protease cú mt gam tht u tụm sỳ, tớnh trờn cn bn khụ (U/g CKTT cht khụ tht u tụm). 2. Xỏc nh m bng phng phỏp sy khụ n lng khụng i Nguyờn lý: Dựng nhit lm bay ht hi nc sn phm, cõn lng sn phm trc sy v sau sy, t ú tớnh % m ca nguyờn liu. Tin hnh: Sy khụ a petri n lng khụng i cho vo a petri g mu v em sy nhit 100 ữ 105 C, thi gian ti thiu l gi. Mi ln em mu i cõn phi s dng bỡnh hỳt m trỏnh cho mu b hỳt m tr li. Kt qu c tớnh theo cụng thc: X G1 G 100 (%) G1 G Trong ú X: % m cú 100 g thc phm. G: Khi lng ca a petri khụng mu (g). G1: Khi lng ca a petri v mu trc sy (g). G2: Khi lng ca cc v mu sau sy (g). 3. Xỏc nh m tng s bng phng phỏp Kjeldahl a. Nguyờn tc Nit cú thnh phn cỏc hp cht hu c, di tỏc dng ca H2SO4 m c vi s hin din ca cht xỳc tỏc thớch hp thỡ tt c cỏc cht hu c b oxy hoỏ, cũn NH3 c gii phúng liờn kt vi H2SO4 to thnh (NH4)2SO4. Dựng kim mnh (NaOH, MgO) y NH3 t mui (NH4)2SO4 hỡnh thnh th t do. nh lng NH3 bng dung dch acid cú nng xỏc nh. Cỏc hp cht hu c + H2SO4 (m c) (NH4)2SO4 b. Tin hnh t m (vụ c hoỏ). Cõn chớnh xỏc g mu cho vo bỡnh Kjedahl v cho tip vo g cht xỳc tỏc, 10 mL H2SO4 m c, nghiờng bỡnh Kjedahl trờn bp v un t t n thu c dung dch sut khụng mu hoc cú mu xanh l ca CuSO4 ngui. c. Ct m Sau vụ c hoỏ mu hon ton, cho mt ớt nc ct vo bỡnh Kjedahl ri cho vo bỡnh nh mc 100 mL, bỡnh Kjeldahl vi ln v cho tip vo bỡnh nh mc. a nc bỡnh nh mc lờn n 100 mL. Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xi Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th Dựng pipet hỳt 10 mL mu cho vo bỡnh cu ca h thng kộo m v cho tip 10 ữ 15 mL NaOH 40% vo. Sau ú gia nhit ct kộo hi nc v hng NH3 thoỏt ra, ngng t bng mt bỡnh tam giỏc 100 mL cú cha sn 20 mL dung dch acid boric 20 g/L cho n thu c 100 mL dung dch. nh lng dung dch hng bng H2SO4 0,1 N. Tớnh kt qu: Hm lng Nit tng s 0.0014 V 10 100% m Trong ú V: Th tớch H2SO4 0,1 N (mL). m: Khi lng nguyờn liu vụ v hoỏ (g). 10: H s pha loóng. 0,0014: S gam nit tng ng vi 1mL H2SO4 0,1 N. Hm lng protein tng s: % protein tng s = % nit tng s H. Vi H: h s protein. i vi thc phm cú ngun gc ng vt thỡ H = 6,25. Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xii Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 PH LC Trng i hc Cn Th KT QU THNG Kấ 1. Thớ nghim 1: nh hng ca t l mu:dung mụi n quỏ trỡnh trớch ly protease t u tụm sỳ One-Way ANOVA - HOAT TINH by TI LE Number of observations: 18 Number of levels: ANOVA Table for HOAT TINH by TI LE Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 5,54275 1,10855 1180,57 Within groups 0,0112679 12 0,000938994 Total (Corr.) 5,55402 17 P-Value 0, Table of Means for HOAT TINH by TI LE with 95,0 percent LSD intervals Stnd. error TI LE Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 1:01 0,1388 0,0176918 0,111543 0,166057 1:02 0,755367 0,0176918 0,72811 0,782624 1:03 1,19453 0,0176918 1,16728 1,22179 1:04 1,92083 0,0176918 1,89358 1,94809 1:05 1,29747 0,0176918 1,27021 1,32472 1:06 0,731567 0,0176918 0,70431 0,758824 Total 18 1,00643 Multiple Range Tests for HOAT TINH by TI LE Method: 95,0 percent LSD TI LE Count Mean Homogeneous Groups 1:01 0,1388 X 1:06 0,731567 X 1:02 0,755367 X 1:03 1,19453 X 1:05 1,29747 X 1:04 1,92083 X * denotes a statistically significant difference. Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xiii Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Contrast Sig. Difference +/- Limits 1:01 - 1:02 * -0,616567 0,0545138 1:01 - 1:03 * -1,05573 0,0545138 1:01 - 1:04 * -1,78203 0,0545138 1:01 - 1:05 * -1,15867 0,0545138 1:01 - 1:06 * -0,592767 0,0545138 1:02 - 1:03 * -0,439167 0,0545138 1:02 - 1:04 * -1,16547 0,0545138 1:02 - 1:05 * -0,5421 0,0545138 0,0238 0,0545138 1:02 - 1:06 1:03 - 1:04 * -0,7263 0,0545138 1:03 - 1:05 * -0,102933 0,0545138 1:03 - 1:06 * 0,462967 0,0545138 1:04 - 1:05 * 0,623367 0,0545138 1:04 - 1:06 * 1,18927 0,0545138 1:05 - 1:06 * 0,5659 0,0545138 Trng i hc Cn Th 2. Thớ nghim 2: nh hng pH ca dung mụi n quỏ trỡnh trớch ly proteỏe t tht u tụm sỳ One-Way ANOVA - HOAT TINH by pH Number of observations: 18 Number of levels: ANOVA Table for HOAT TINH by pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 9,20249 1,8405 21,02 Within groups 1,05064 12 0,0875531 Total (Corr.) 10,2531 17 P-Value , Table of Means for HOAT TINH by pH with 95,0 percent LSD intervals Stnd. error pH Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 10 3,75267 0,170834 3,48947 4,01586 11 3,227 0,170834 2,9638 3,4902 2,42633 0,170834 2,16314 2,68953 2,44633 0,170834 2,18314 2,70953 3,82267 0,170834 3,55947 4,08586 nuoc cat (dc) 1,921 0,170834 1,6578 2,1842 Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xiv Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Total 18 Trng i hc Cn Th 2,93267 Multiple Range Tests for HOAT TINH by pH Method: 95,0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups nuoc cat (dc) 1,921 X 2,42633 X 2,44633 X 11 3,227 X 10 3,75267 XX 3,82267 X Contrast Sig. 10 - 11 Difference +/- Limits 0,525667 0,526394 10 - * 1,32633 0,526394 10 - * 1,30633 0,526394 -0,07 0,526394 10 - 10 - nuoc cat (dc) * 1,83167 0,526394 11 - * 0,800667 0,526394 11 - * 0,780667 0,526394 11 - * -0,595667 0,526394 11 - nuoc cat (dc) * 1,306 0,526394 -0,02 0,526394 -1,39633 0,526394 0,505333 0,526394 -1,37633 0,526394 0,525333 0,526394 7-8 7-9 * - nuoc cat (dc) 8-9 - nuoc cat (dc) * - nuoc cat (dc) 0,526394 * 1,90167 * denotes a statistically significant difference. Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xv Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th 3. Thớ nghim 3: Ti u nhit v thi gian n quỏ trỡnh trớch ly protease t tht u tụm sỳ Base Design Number of experimental factors: Number of blocks: Number of responses: Number of runs: 36, including centerpoints per block Error degrees of freedom: 28 Randomized: No Factors Low High Nhiet -2,0 2,0 Yes Thoi gian -1,0 1,0 Yes Responses Units Continuous Units UI Analyze Experiment - UI Estimated effects for UI Effect Estimate Stnd. Error V.I.F. average+block 13,3812 0,157919 A:Nhiet do+block -2,06309 0,291465 1,0 B:Thoi gian+block 0,802517 0,252416 1,0 AA+block -16,5639 0,45381 1,05051 AB+block -5,28735 0,35697 1,0 BB+block -2,86401 0,388067 1,05051 block 0,266853 0,26607 1,33333 block -0,459942 0,26607 1,33333 Standard errors are based on total error with 46 d.f. Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xvi Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th Analysis of Variance for UI Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Nhiet do+block 23,9419 23,9419 50,10 0, B:Thoi gian+block 4,83025 4,83025 10,11 0, 26 AA+block 636,607 636,607 1332,22 0, AB+block 104,835 104,835 219,39 0, BB+block 26,0273 26,0273 54,47 0, blocks 1,44018 0,720092 1,51 Total error 21,9813 46 0,477853 Total (corr.) 912,429 53 0,2323 R-squared = 97,5909 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 97,34 percent Standard Error of Est. = 0,691269 Mean absolute error = 0,542548 Durbin-Watson statistic = 0,401933 (P=0, 0) Lag residual autocorrelation = 0,794579 Estimation Results for UI Observed Fitted Lower 95,0% CL Upper 95,0% CL Row Value Value for Mean for Mean 1,97941 1,75045 1,06629 2,4346 2,08298 1,78733 1,10317 2,47148 1,7002 1,42393 ,739776 2,10808 6,16189 6,22738 5,64684 6,80793 6,26546 6,26426 5,68372 6,84481 5,88268 5,90087 5,32032 6,48141 8,0139 7,84031 7,15616 8,52446 8,06759 7,87719 7,19304 8,56135 7,77344 7,51379 6,82964 8,19795 10 8,01232 8,76797 8,25067 9,28528 11 8,11589 8,80485 8,28755 9,32216 12 7,73311 8,44146 7,92415 8,95876 13 10,8521 11,9231 11,5051 12,3411 14 10,9557 11,96 11,542 12,3779 15 10,5729 11,5966 11,1786 12,0145 16 11,8826 12,2142 11,6969 12,7315 17 11,9976 12,251 11,7337 12,7684 18 11,6321 11,8876 11,3703 12,405 Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xvii Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th 19 12,0805 11,6445 11,1416 12,1475 20 12,2397 11,6814 11,1785 12,1843 21 11,9144 11,318 10,8151 11,8209 22 14,192 13,4778 13,0621 13,8934 23 14,4 13,5147 13,099 13,9303 24 13,776 13,1513 12,7356 13,5669 25 12,7165 12,447 11,9441 12,95 26 12,8757 12,4839 11,981 12,9869 27 12,5504 12,1205 11,6176 12,6235 28 10,0224 10,3801 9,8628 10,8974 29 10,1373 10,417 9,89968 10,9343 30 9,77187 10,0536 9,53628 10,5709 31 9,68233 10,8915 10,4735 11,3095 32 9,79724 10,9284 10,5104 11,3464 33 9,43179 10,565 10,147 10,983 34 7,45155 8,53894 8,02164 9,05625 35 7,55512 8,57583 8,05852 9,09313 36 7,17233 8,21243 7,69512 8,72974 37 5,123 4,97471 4,29055 5,65886 38 4,968 5,01159 4,32743 5,69574 39 5,224 4,64819 3,96404 5,33234 40 4,123 4,16429 3,58375 4,74484 41 3,968 4,20118 3,62063 4,78172 42 3,224 3,83778 3,25723 4,41832 43 1,113 0,489873 -0,19428 1,17403 44 1,225 0,526756 -0,157398 1,21091 45 1,116 0,163358 -0,520796 0,847511 46 14,1545 13,4778 13,0621 13,8934 47 14,1581 13,5147 13,099 13,9303 48 13,753 13,1513 12,7356 13,5669 49 14,1545 13,4778 13,0621 13,8934 50 13,81 13,5147 13,099 13,9303 51 13,53 13,1513 12,7356 13,5669 52 14,45 13,4778 13,0621 13,8934 53 14,21 13,5147 13,099 13,9303 54 13,53 13,1513 12,7356 13,5669 Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xviii Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th The StatAdvisor This table contains information about values of UI generated using the fitted model. The table includes: (1) the observed value of UI (if any) (2) the predicted value of UI using the fitted model (3) 95,0% confidence limits for the mean response Regression coeffs. for UI Coefficient Estimate constant 13,3812 A:Nhiet -0,515772 B:Thoi gian 0,401258 AA -2,07049 AB -1,32184 BB -1,432 The StatAdvisor This pane displays the regression equation which has been fitted to the data. The equation of the fitted model is UI = 13,3812 - 0,515772*Nhiet + 0,401258*Thoi gian - 2,07049*Nhiet do^2 - 1,32184*Nhiet do*Thoi gian 1,432*Thoi gian^2 Optimize Response Goal: maximize UI Optimum value = 13,4789 Factor Low High Optimum Nhiet -2,0 2,0 -0,198364 Thoi gian -1,0 1,0 0,231596 Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xix Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th PH LC S LIU XY DNG NG CHUN TYROSINE Bng PL3 B trớ thớ nghim xõy dng ng chun tyrosine Nng tyrosine 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0,085 0,256 0,128 0,545 0,67 0,705 0,98 0,988 1,281 1,264 1,527 OD 0,08 0,079 0,079 0,092 0,075 0,069 0,238 0,31 0,25 0,261 0,241 0,237 0,199 0,14 0,479 0,417 0,4 0,408 0,543 0,542 0,529 0,484 0,493 0,539 0,548 0,69 0,724 0,561 0,508 0,509 0,766 0,724 0,703 0,775 0,801 0,796 0,842 0,742 0,743 0,979 0,978 0,992 0,979 0,977 0,704 0,715 1,029 1,04 1,042 1,031 0,957 1,033 0,959 1,267 1,253 1,26 1,286 1,272 1,258 1,263 1,243 1,215 1,279 1,257 1,268 1,264 1,498 1,51 1,339 1,492 1,618 1,514 1,238 1,498 Trung bỡnh 0,0799 0,2561 0,3101 0,5279 0,6440 0,7634 0,9130 1,0099 1,2675 1,2860 1,4670 Bng PL4 S liu xõy dng ng chun tyrosine Nng tyrosine 0,0 0,1 Dalta OD 0,1763 0,2303 0,448 0,5641 0,6835 0,8331 0,93 1,1876 1,2061 1,3871 0,2 0,3 0,4 0,5 Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 xix Lun tt nghip i hc Khúa 36 - 2013 Trng i hc Cn Th Hỡnh PL1 . ng chun Tyrosine Ngnh Cụng ngh thc phm, Khoa Nụng nghip v SHD xx [...]... trong mẫu theo phương pháp được trình bày ở bảng 3.1 - Trích ly protease Kết quả thu nhận: Đánh giá đặc điểm, thành phần của nguồn nguyên liệu thịt đầu tôm sú 3.3.3 Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ mẫu và dung môi trích ly protease từ thịt đầu tôm sú phù hợp Mục đích: Tìm ra tỷ lệ nước cất bổ sung thích hợp vào mẫu thịt đầu tôm sú giúp quá trình trích ly protease đạt hiệu quả cao nhất Bố trí thí nghiệm: Thí... trích ly protease thích hợp  Xác định pH của dung môi thích hợp giúp gia tăng hiệu quả trích ly protease  Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian trích ly protease từ thịt đầu tôm sú Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD 2 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 CHƯƠNG 2 Trường Đại học Cần Thơ LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 THỊT ĐẦU TÔM SÚ - NGUỒN NGUYÊN LIỆU LY TRÍCH ENZYME PROTEASE 2.1.1 Tôm sú –... 1983) 2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ TRÍCH LY VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE NGUỒN GỐC ĐỘNG VẬT 2.5.1 Nghiên cứu trong nước Nghiên cứu trích ly proease từ các nguồn động vật đã bắt đầu được quan tâm trong thời gian gần đây Nguyễn Lệ Hà (2011) đã tiến hành nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản Kết quả thu nhận enzyme protease tinh sạch... nghiên cứu Giá trị tối ưu của mỗi thông số được xác định dựa trên điểm uốn cong trên đồ thị không gian 3 chiều 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Nguyên liệu – thịt đầu tôm sú Xác định tỷ lệ mẫu: dung môi tối ưu cho quá trình trích ly enzyme protease Xác định pH của dung môi tối ưu cho quá trình trích ly enzyme protease Tối ưu hóa điều kiện trích ly enzyme protease từ đầu. .. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng như protein Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách được Chymosine (trích dẫn từ Nguyễn Lệ Hà, 2011) Gần đây, Min-Soo Heu et al (2002) đã nghiên cứu trích ly, kết tủa phân đoạn hoạt tính protease từ phụ phẩm tôm Quá trình trích ly protease được nghiên cứu riêng lẻ cho từng thành phần các phụ phẩm (đầu, ... việc nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú, giúp tận dụng triệt để lượng phụ phẩm của tôm trong quá trình chế biến và tăng hiệu quả kinh tế cho ngành thủy sản nói chung, ngành xuất khẩu tôm nói riêng Với tỷ lệ đầu tôm được loại bỏ trong quá trình chế biến khoảng 34% khối lượng ban đầu (Tran et al., 2011), trung bình hàng năm Việt Nam có khoảng 35.000 ÷ 46.000 tấn đầu tôm được thải ra từ. .. gần trung tính Để ly trích protease từ đầu tôm sú, môi trường được sử dụng tương tự nhau Theo một số nghiên cứu cho thấy, hoạt tính protease trên một đơn vị khối lượng nội tạng cao hơn nhiều so với đầu tôm ở cùng chế độ tách chiết (gấp từ 3,41 ÷ 4,33 lần) Điều này dễ hiểu vì nội tạng tôm là cơ quan tiêu hóa nên tập trung nhiều enzyme, còn đầu tôm thì lại có thêm cả phần vỏ và thịt tôm có ít hoạt tính... Trường Đại học Cần Thơ Thực trạng xử lý và tiêu thụ thịt đầu tôm sú ở nước ta Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản của thịt đầu tôm sú (bảng 2.1) cho thấy, đây chính là nguồn giàu protein, đồng thời thịt đầu tôm có giá trị pH khá cao (7,3) khi so sánh với pH của thịt tôm tươi (pH = 6,8 ÷ 6,9; Nguyễn Xuân Phương, 2003) Điều này cho thấy, thịt đầu tôm rất dễ chịu sự tấn công của các vi sinh vật và... của tôm sú, đồng thời làm giảm tác động ô nhiễm môi trường do quá trình xử lý đầu tôm gây ra là vấn đề có tính cấp thiết 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục đích chung của đề tài là xác định một số yếu tố cơ bản có ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly protease từ thịt đầu tôm sú Để đạt được mục tiêu đã được đặt ra, đề tài tập trung vào các nội dung cụ thể sau:  Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly. .. trữ đông ở -18 ± 2 C 3.2.3 Phương pháp trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú Thịt đầu tôm sú đông lạnh được phối trộn với dung môi theo tỷ lệ phù hợp Nhiệt độ dung môi trước khi phối trộn là 2 ÷ 4 C Tiếp theo, hỗn hợp được nghiền bằng máy quay sinh tố (tốc độ quay của motor ở mức 2, 3000 rpm) trong thời gian 3 phút trước khi quá trình trích ly enzyme bắt đầu Trong quá trình nghiền, nhiệt độ không . Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4. 1 THÀNH PHẦN HÓA LÝ CƠ BẢN CỦA THỊT ĐẦU TÔM 29 4. 2 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NGUYÊN LIỆU VÀ DUNG MÔI ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ENZYME PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ 30 4. 3. trích ly protease từ thịt đầu tôm sú 34 Hình 4. 4 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt và thời gian đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách 35 Hình 4. 5 Đồ thị biểu diễn sự tương tác. nghiệm tổng quát 22 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 24 Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 25 Hình 3 .4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 28 Hình 4. 3 Ảnh hưởng của các thừa số khảo sát (tương tác đơn,