BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN TRỌNG CHUNG NGHIÊN CỨU, SÀNG LỌC VÀ CẢI TIẾN CHỦNG VI KHUẨN SINH FUCOIDANASE VÀ TỐI ƯU MÔI TRƯỜNG SẢN XUẤT FUCOIDANASE CAO SẢN CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. VŨ VĂN HẠNH TS. NGUYỄN XUÂN CẢNH HÀ NỘI – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Luận văn công trình nghiên cứu tôi; - Số liệu sử dụng luận văn trung thực; - Thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc có độ xác cao phạm vi hiểu biết tôi. Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2015 Học viên Nguyễn Trọng Chung Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Văn Hạnh Trưởng phòng Các chức sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS. Nguyễn Xuân Cảnh Trưởng môn vi sinh – Học viện Nông nghiệp Việt Nam định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn tạo điều kiện vật tư, hóa chất thiết bị cho nghiên cứu để hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất anh chị làm việc Phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tận tình cho sống, học tập, làm việc môi trường hòa đồng, thân thiện thời gian vừa qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên ngành sống suốt thời gian học tập trường. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, nỗ lực thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình cá nhân, tập thể trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, tập thể lớp CH22CNSHB tất bạn bè động viên, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập thực luận văn. Hà Nội, tháng năm 2015 Học viên thực Nguyễn Trọng Chung Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục sơ đồ viii MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề 2. Mục đích đề tài PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan rong biển 1.1.1. Giới thiệu chung rong biển 1.1.2. Đặc điểm phân bố rong nâu giới 1.1.3. Đặc điểm phân bố rong nâu Việt Nam 1.2. Tổng quan enzyme 1.2.1. Khái niệm chung enzyme 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 1.2.3. Tính chất enzyme 1.2.4. Một số nghiên cứu fucoidanase đối tượng vi sinh vật 1.3. Đột biến cải biến chủng 1.3.1. Giới thiệu đột biến 1.3.2. Sự cải biến chủng giới 1.3.3. Sự cải biến chủng Việt Nam PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10 2.1. Vật liệu 10 2.2. Phương pháp nghiên cứu 10 2.2.1. Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật 10 2.2.2. Phương pháp lên men vi sinh vật 10 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.2.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 11 2.2.4. Thử nghiệm họat tính enzyme cắt gắn mạch fucoidan 12 2.2.5.Cải biến chủng phương pháp đột biến 13 2.2.6. Tối ưu môi trường sản xuất fucoidanase cao sản 14 2.2.7. Thu nhận tinh fucoidanase 16 2.2.8. Xác định tính chất lý hóa fucoidanase 17 2.2.9. Phương pháp nhuộm Gram 18 2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu 19 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Phân lập chủng vi khuẩn theo định hướng phân cắt mạch fucoidan 20 3.2. Sàng lọc chủng vi khuẩn theo định hướng 21 3.3. Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase kỹ thuật đột biến 23 3.3.1. Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase NTG kết hợp UV 23 3.3.2. Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase NTG. 24 3.4. Tối ưu môi trường sinh tổng hợp fucoidanase cao sản 28 3.4.1. Ảnh hưởng nồng độ chất 28 3.4.2. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 29 3.4.3. Ảnh hưởng pH môi trường 30 3.4.4. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 31 3.5. Thu nhận tinh fucoidanase 35 3.6. Tính chất lý hóa fucoidanase 38 3.6.1.Tính đặc hiệu chất 38 3.6.2. Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt 40 3.6.3. Ảnh hưởng ion kim loại 42 3.6.4. Ảnh hưởng nhiệt độ 44 3.6.5. Ảnh hưởng pH 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 Kết luận 48 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 55 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv DANH MỤC VIẾT TẮT NTG : N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine UV : Tia cực tím DNS : 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid SDS : Sodium dodecyl sulfate CMC : Carboxymethyl cellulose EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid ADN : Axit Deoxyribo Nucleic ĐC : Đối chứng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Các bước tiến hành thử nghiệm hoạt tính theo Miller 12 3.1 Hình thái khuẩn lạc số chủng vi sinh vật phân lập 20 3.2a Hoạt tính fucoidanase ngoại bào từ chủng vi sinh vật 22 3.2b Hoạt tính fucoidanase nội bào từ chủng vi sinh vật 22 3.3 Sàng lọc dòng đột biến NTG kết hợp UV 23 3.4 Hoạt tinh fucoidanase dòng đột biến NTG 25 3.5 Tỷ lệ sống sót chủng T13 sau xử lí đột NTG, NTG kết hợp UV 26 3.6 Tính ổn định dòng đột biến qua hệ 27 3.7 Ma trận thí nghiệm hàm đa biến 32 3.8 Kết định lượng protein 36 3.9 Hoạt tính fucoidanase phân đoạn 37 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Hình thái chủng vi khuẩn có khả tổng hợp fucoidanase 21 3.2 Đường cong sống sót chủng T13 sau đột biến NTG UV 24 3.3 Đường cong sống sót chủng T13 sau đột biến NTG 25 3.4 So sánh hoạt tính fucoidanase trước sau đột biến 28 3.5 Ảnh hưởng % chất đến hoạt tính enzyme 28 3.6 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính enzyme 29 3.7 Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt tính fucoidanase 30 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính enzyme 31 3.9 Tương tác pH nồng độ chất fucoidan tới hoạt tính enzyme 32 3.10 Tương tác pH thời gian tới hoạt tính enzyme 33 3.11 Tương tác nhiệt độ nồng độ chất fucoidan tới hoạt tính enzyme 33 3.12 Tương tác thời gian nồng độ chất fucoidan tới fucoidanase 34 3.13 Hoạt tính fucoidanase môi trường tối ưu 35 3.14 Ảnh hưởng dung môi đến khả thu nhận enzyme 36 3.16 Tính đặc hiệu chất fucoidanase 39 3.17 Tính đặc hiệu chất enzyme từ chủng tự nhiên chủng đột biến 39 3.18 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt 40 3.19 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính enzyme hai chủng tự nhiên đột biến 41 3.20 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính fucoidanase 42 3.21 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme chủng đột biến chủng tự nhiên 44 3.22 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động enzyme 45 3.23 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme có nguồn gốc từ chủng đột biến chủng tự nhiên 45 3.24 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme 46 3.25 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme có nguồn gốc từ chủng đột biến chủng tự nhiên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 47 Page vii DANH MỤC SƠ ĐỒ STT Tên sơ đồ Trang 2.1 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật 10 2.2 Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 11 2.3 Tối ưu nồng độ fucoidan 14 2.4 Tối ưu thời gian nuôi cấy 15 2.5 Tối ưu pH 15 2.6 Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy 16 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nước ta có đường bờ biển dài 3600 km, nằm khu vực khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới, phía Đông phía Nam giáp biển với diện tích mặt nước biển 1000000 km2. Trong hệ thực vật biển, tảo biển chiếm lượng sinh khối lớn với khoảng 1000 loài, 639 loài xác định bao gồm: 151 loài rong lục, 269 loài rong đỏ, 143 loài rong nâu 76 loài rong lam (Trần Hoài Thu, 2000). Rong biển từ xưa sử dụng làm thức ăn cho người gia súc, số nước sử dụng rong biển vào mục đích chữa bệnh làm dược phẩm. Trong rong nâu có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao kháng khuẩn, chống khối u hay tăng cường miễn dịch. Một hợp chất có hoạt tính sinh học cao quý nhà khoa học tìm thấy rong nâu fucoidan (Trần Thị Luyến, 2003). Fucoidan sulphat polysaccharide sinh học chiết từ rong nâu, đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ nhiều hoạt tính dược lý đặc biệt chống đông tụ, chống viêm nhiễm, điều tiết miễn dịch, ức chế phát triển bướu, kháng ung thư kháng virus kể virus HIV… nguồn cung cấp chủ yếu rong nâu tự nhiên có trữ lượng lớn vùng biển nước ta (Bilan 2007; Bùi Minh Lý 2006) Tuy nhiên mối quan hệ hoạt tính sinh học cấu trúc chúng chưa giải thích rõ ràng cấu trúc phức tạp không theo quy luật fucoidan từ loài rong khác mà chiết ra. Trong mạch phân tử chúng chứa chủ yếu gốc fucose sulphat hóa vị trí khác liên kết với nhau. Ngoài phân tử có mặt số đường đơn khác như: galactose, manose, xylose, glucose mạch nhánh có chứa gốc fucosyl, galatosyl .(Berteau O 2003) Chính việc nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố cấu trúc lên hoạt tính sinh học fucoidan thách thức không nhỏ nhà khoa học. Hiện có nhiều phương pháp để nghiên cứu cấu trúc fucoidan sử dụng tác nhân vật lý, hóa học tác động trực tiếp vào cấu trúc phân tử, dù hay nhiều phương pháp ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học quý giá fucoidan. Việc tìm enzyme có khả cắt mạch fucoidan bước ngoặt quan Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 76 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 77 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 78 [...]... fucoidanase và tối ưu môi trường sản xuất fucoidanase cao sản 2 Mục đích của đề tài Chọn lọc và cải biến chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp được fucoidanase cao, tối ưu được môi trường lên men lỏng và xác định được một số tính chất của enzyme này Nội dung thực hiện: • Phân lập và sàng lọc vi khuẩn tổng hợp enzyme phân cắt mạch polysaccharide rong nâu • Cải biến chủng sinh vật sinh enzyme bằng đột biến • Tối. .. trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan Cho tới nay các nghiên cứu trong nước chưa có một công trình nào đề cập một cách toàn diện polysaccharide từ rong nâu Vi t Nam cũng như cải biến và nâng cao hoạt tính enzyme phân lập từ các vi sinh vật biển (Bùi Minh Lý 2006; Phạm Đức Thịnh 2007) Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu, sàng lọc và cải tiến chủng vi khuẩn sinh fucoidanase. .. bào và loại hóa chất Sau đó rửa tế bào 2 lần bằng nước cất, bổ sung thêm 200 µl nước muối sinh lý và cấy chải trên 3 đĩa petri Sau 24 giờ nuôi cấy, chọn ngẫu nhiên từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc và tiến hành thử hoạt tính enzyme Học vi n Nông nghiệp Vi t Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13 2.2.6 Tối ưu môi trường sản xuất fucoidanase cao sản 2.2.6.1 Tối ưu nồng độ fucoidan Tiến hành tối ưu nồng... trên thế giới bắt đầu nghiên cứu về vi sinh vật biển sinh enzyme phân cắt fucoidan Năm 2006 Bùi Minh Lý và cộng sự với đề tài Nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất Fucoidan từ một số loài rong nâu Vi t Nam” đã phân lập và tối ưu được môi trường lên men chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase tuy nhiên các kết quả này vẫn chỉ ở mức quy mô phòng thí nghiệm, chưa được đưa ra thị trường ( Bùi Minh Lý... các chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ các mẫu tảo khô ở Khánh Hòa và vùng biển Thanh Hóa, hệ tiêu hóa của nhuyễn thể biển và giáp xác Kết quả chúng tôi thu nhận được 90 chủng vi khuẩn với các đặc điểm hình thái khuẩn lạc ở bảng 3.1: Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi sinh vật phân lập được Chủng Hình thái khuẩn lạc Khuẩn lạc màu nâu nhạt, không nhân, lồi và bóng Chủng Hình thái khuẩn lạc Khuẩn. .. nhuôm gram (b) của chủng RT16 (b) của chủng C17 Hình 3.1: Hình thái các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp fucoidanase 3.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn theo định hướng Để xác định khả năng thủy phân cơ chất fucoidan của 90 chủng vi sinh vật đã phân lập chúng tôi tiến hành lên men lỏng trên môi trường có bổ sung 0,01% fucoidan Sau 2 ngày tăng sinh, 1ml dịch nuôi được hút vào ependoft sạch và li tâm ở 10.000... enzyme ngoại bào của chủng T13 để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo 3.3 Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase bằng kỹ thuật đột biến 3.3.1 Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase bằng NTG kết hợp UV Chủng vi khuẩn T13 được nuôi cấy trong môi trường lên men lỏng trong bình nón Sau 48 giờ, hút 2ml dịch đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào để tiến hành gây đột biến... Tối ưu thời gian nuôi cấy 2.2.6.3 Tối ưu pH Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường: 5g pepton, 2g Cao nấm men, 0.05g MgSO4.7H2O, 0.2g K2HSO4, 500ml nước biển, 500ml nước cất, với môi trường pH thay đổi từ 5 – 9 với tốc độ vòng lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 24 giờ Kiểm tra hoạt tính fucoidanase bằng phương pháp của Miller Tìm thời gian nuôi cấy thích hợp Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong các môi trường. .. tôi chọn và xác định được môi trường phân lập có khả năng chọn lọc tốt hơn Các chủng này được sử dụng để sàng lọc khả năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysacharite Hình thái các chủng vi khuẩn phân lập được từ rong nâu, Ngao và Sò huyết được trình bày trong hình 3.1: B a Khuẩn lạc (a), nhuôm gram B A Khuẩn lạc (a), nhuôm gram (b) của chủng T13 (b) của chủng T15 B a Khuẩn lạc (a), nhuộm gram A B Khuẩn lạc... Chúng tôi tiến hành phân lập các chủng vi sinh vật trong môi trường argar – nước biển có bổ sung thêm nguồn cacbon và fucoidan thô được chiết suất từ rong biển Nguồn phân lập vi sinh vật Sò lông, Sò huyết Rong biển Nghiền trong nước muối sinh lý 0.9% Chọn khuẩn lạc thuần trong môi trường phân lập Ly tâm thu tế bào và giữ giống trong glycerol 30% Sơ đồ 2.1: Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật . đề tài: Nghiên cứu, sàng lọc và cải tiến chủng vi khuẩn sinh fucoidanase và tối ưu môi trường sản xuất fucoidanase cao sản 2. Mục đích của đề tài Chọn lọc và cải biến chủng vi khuẩn có khả. NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VI N NÔNG NGHIỆP VI T NAM NGUYỄN TRỌNG CHUNG NGHIÊN CỨU, SÀNG LỌC VÀ CẢI TIẾN CHỦNG VI KHUẨN SINH FUCOIDANASE VÀ TỐI ƯU MÔI TRƯỜNG SẢN XUẤT FUCOIDANASE CAO SẢN. 3.3.1. Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase bằng NTG kết hợp UV 23 3.3.2. Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase bởi NTG. 24 3.4. Tối ưu môi trường sinh tổng hợp fucoidanase