B ộ YTỂ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ca NGUYỄN THỊ LỆ NINH GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u LÊN MEN SINH TỎNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 16.34 (KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 2002-2007) Người hướng dẫn : PGS-TS.Cao Văn Thu Nơi thực : Bộ môn Vi Sinh Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: 02-05/2007 HÀ NỘI, 05/2007 ;oU- LỜI CẢM ƠN Nhân dịp khóa luận hồn thành, cho phép tơi gửi lời cảm ơn chân thành, lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS TS Cao Văn Thu - người trực tiếp hướng dẫn tơi thực hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm fn thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy, làm việc môn Vi Sinh Sinh Học, mơn Cơng nghiệp Dược tận tình giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu toàn thể thầy giáo, cô giáo trưcmg Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập trường Cuối xin cảm fĩi gia đình, bạn bè, người giúp đỡ ủng hộ tơi để có kết hơm Với thời gian thực nghiệm có hạn, khóa luận chắn cịn nhiều điều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy giáo, bạn bè đồng nghiệp để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2007 Sinh viên Nguyễn Thị Lệ Ninh MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN Đ Ề PHẦN - TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Phân loại kháng sinh 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.4 Tính kháng ứiuốc kháng sinh vi khuẩn 1.1.5 Nguyên tắc sử dụng kháng sin h 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN 1.2.1 Xạ khuẩn (Lớp phụ Actỉnomycetales) 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2.3 Khả sinh tổng hợp kháng sinh Sft’eptomyces 1.3 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH 1.3.1 Giống vi sinh vật 1.3.2 Lên men [5],[9] 1.4 TUYÊN CHỌN, CẢI TẠO VÀ BẢO QUẢN GIỐNG XẠ KHUẨN 10 1.4.1 Tuyển chọn, cải tạo giống xạ khuẩn 10 1.4.2 Bảo quản giống xạ khuẩn 12 1.5 CmẾT TÁCH, TINH CHẾ KHÁNG SINH TỪ DỊCH LÊN MEN 12 1.5.1 Chiết x u ấ t .12 1.5.2 Tách sản phẩm 12 1.5.3 Tinh chế 13 1.6 M SỐNGHIÊN cứu M TRONG CÔNGNGHỆ SINHHỌC 14 ỘT ỚI 1.6.1 PR207944, kháng sinh chống nấm từ Chaetomium sp No 217 Sự phân lập làm rõ cấu trúc 14 Ảnh hưởng tác nhân gây thoái biến acid clavunalic lên men có bổ sung chủng Streptomyces clavulỉgerus .14 PHẦN - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 16 2.1.1 Nguyên vật liệu 16 2.1.2 Các phương pháp thực nghiệm: 19 2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 24 2.2.1 Hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces 16.34 số vi khuẩn kiểm định 24 2.2.2 Kết chọn lọc ngẫu nhiên 25 2.2.3 Kết đột biến cải tạo giống 26 2.2.4 Kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29 2.2.5 Kết chiết xuất kháng sinh 31 2.2.6 Kết sắc ký lớp mỏng 32 2.2.7 Kết kiểm tra thay đổi bột kháng sinh thô 32 2.2.8 Kết sắc ký cột 33 2.2.9 Kết kiểm tra biến đổi hoạt tính kháng sinh tinh chế 35 2.2.10 Kết thử khả chống nấm 36 2.2.11 Kết sắc ký kháng sinh chống nấm .37 PHẦN - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 3.1 KẾT LUẬN 39 3.2 ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO .40 CHÚ GIẢI CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic A nỉger Aspergillus niger ARN Acid ribonucleic B cereus Bacillus cereus ATCC 9946 B pumỉlus Bacillus pumilus f in c c 10241 B subtỉlis Bacillus subtilis ATCC 6633 c albicans Candida albicans D (mm) Đưcmg kính trung bình vịng vơ khuẩn (vơ nấm) E Colỉ Escherichia coli ATCC 25922 Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương KS Kháng sinh MC Mầu chứng MT Môi trưcmg M Tdd Môi trường dung dịch p aeruginosa Pseudomonas aeruginosa VM 201 PL Phần phụ lục P mirabilis Proteus mỉrabỉlis BV 108 SKLM Sắc ký lóp mỏng S aureus Staphỉlococcus aureus ATCC 1128 S flexneri Shigella flexneri DT 112 STT Số thứ tự vsv Vi sinh vật ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phát triển vũ bão vi sinh vật học, với phát minh vĩ đại Penicillin với việc phát triển hồn thiện cơng nghệ lên men đại tạo cho nhân loại chất kháng sinh, công cụ hữu hiệu để đấu tranh chống lại bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo, bệnh ung thư mở “ kỷ nguyên vàng ” cho ngành công nghệ sản xuất chế phẩm này.Tuy nhiên thực tiễn điều trị cho thấy, lịch sử vấn đề kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh gần đồng hành với lịch sử ứng dụng chất kháng sinh vấn đề có xu hướng xuất ngày thường xuyên, với mức độ ngày trầm trọng hoTi Do nhu cầu nghiên cứu, sản xuất chất kháng sinh với đặc tính ưu việt cấp thiết Trong số 10.000 kháng sinh biết giới khoảng 6 % xạ khuẩn tạo Trong số đáng ý xạ khuẩn chi Streptomyces - kháng sinh chi xạ khuẩn sinh tổng hợp đa dạng, có phổ tác dụng rộng; số lồi chi cịn có khả sinh tổng hợp kháng sinh chống ung thư Nghiên cứu xạ khuẩn nói chung, xạ khuẩn chi Sừeptomyces nói riêng để tạo kháng sinh thu hút quan tâm nhà khoa học Việt Nam, chủng xạ khuẩn thuộc chi Sừ-eptomyces phân lập, nghiên cứu rộng rãi nhằm phục vụ cho việc tìm kiếm kháng sinh mới, ứng dụng điều trị Do đó, tơi lựa chọn đề tài: “ Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nìíìỉ Strepíomyces 16.34 ” với mục tiêu sau: - Tiến hành nghiên cứu cải tạo giống nhằm tạo chủng có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao so với chủng gốc - Bước đầu lựa chọn mơi trưịng lên men - Nghiên cứu phương pháp chiết tách, tinh chế thành phần kháng sinh PHẢN - TỎNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VÈ KHÁNG SINH 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh [1] Có nhiều định nghĩa khác kháng sinh Song nêu lên định nghĩa coi hoàn chỉnh: Kháng sinh sản phẩm đặc biệt nhận từ vỉ sinh vật hay nguồn tự nhiên khác cỏ hoạt tỉnh sinh học cao,cỏ tác dụng kìm hãm tiêu diệt cách chọn lọc lên nhỏm vỉ sinh vật xác định (vỉ khuẩn, nấm, nguyên sình động vật v.v ) hay tế bào ung thư nồng độ thấp 1.1.2 Phân loại kháng sinh [3] Có thể phân loại kháng sinh theo nguồn gốc (kháng sinh xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm) tạo ra; theo chế tác dụng (kháng sinh tác dụng lên thành tế bào, lên tổng hợp protein, tổng hợp ADN, ARN v.v ) phân loại theo cấu trúc hóa học Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học khoa học nhất, gồm nhóm: - Nhóm beta lactam - Nhóm tetracyclin - Nhóm aminoglycosid - Nhóm peptid - Nhóm macrolid - Nhóm lincosamid - Nhóm quinolon - Nhóm co-trimoxazol - Nhóm phenicol - Các kháng sinh khác: Rifamicin, kháng sinh chống nấm, chống ung thư 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh [3] Các kháng sinh thường tác dụng lên khuẩn theo chế sau: - ứ c chế tổng họp vách tế bào vi khuẩn - ứ c chế tổng họp protêin vi khuẩn - ứ c chế tổng họp aicd nucleic - Thay đổi tính thấm màng - Kháng chuyển hóa (ức chế tổng hợp acid folic) - ứ c chế trao đổi chất hô hấp 1.1.4 Tính kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn [l]y[3] Định nghĩa; Kháng thuốc tượng vi sinh vật đ i(tì^^h y cảm ban đầu nỏ U'ong thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng KS hay hóa trị liệu Hiện tượng kháng KS hóa trị liệu xuất hầu hết loài v s v Sự phát triển sinh học phân tử năm gần tạo sở để nghiên cứu cách toàn diện chất phân tử tính kháng thuốc vi khuẩn Thành cơng nghiên cứu di truyền tính kháng thuốc vi khuẩn khẳng định có kháng thuốc đột biến NST kháng thuốc plasmid Tính kháng tìiuốc vi khuẩn có chế sâu sau: - Thay đổi vị trí hay đích tác dụng KS làm cho KS công vào tế bào - Thay đổi cấu ừúc thành tế bào làm KS không xâm nhập vào tế bào - Tiết enzym cảm ứng để khử hoạt tính KS trước bị tác dụng thuốc - Làm hiệu lực thuốc cách thích ứng trao đổi chất đặc biệt tế bào vi khuẩn 1.1.5 Nguyên tắc sử dụng kháng sinh [1],[5] Đe khắc phục tưọng kháng thuốc v s v gây bệnh, giải pháp sử dụng KS mới, Tuy nhiên việc tìm kiếm, phát sản xuất KS khối lượng công việc khổng lồ, tiêu tốn nhiều thời gian, nhân lực tiền bạc Đồng thời để kháng thuốc xảy đồng nghĩa với việc phải trả giá sức khỏe tính mạng bệnh nhân Chính nỗ lực nhằm hạn chế xuất khả kháng thuốc trở nên cần thiết hiệu quả, cần triệt để tôn trọng nguyên tắc sử dụng KS sau: Phân lập vsv gây bệnh thử độ nhạy cảm với KS phương pháp khoanh giấy lọc (KS đồ) Chọn KS có hoạt tính kháng khuẩn mạnh v s v gây bệnh Qui định liều dùng thời gian điều trị thích hợp, đường đưa KS vào thể Phối hợp KS với chế phẩm khác nhằm tăng tác dụng giảm phản ứng không mong muốn 1.2 ĐẠI CƯƠNG VÈ XẠ KHUẨN 1.2.1 Xạ khuẩn (Lớp ^hụ Acíinomycetales) [5],[6],[8] Đặc điểm chung: Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi tự nhiên Đa số xạ khuẩn v s v Gr(+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh Xạ khuẩn có khả sản sinh nhiều loại sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: KS, enzym, số vitamin acid hữu Trong só 10.000 KS biết giới khoảng 6 % xạ khuẩn tạo Xạ khuẩn gây bệnh cho người động vật trường hợp hạn hữu (Streptomyces ixraeỉi) ❖ Đặc điểm hình thái xạ khuẩn: Xạ khuẩn phát triển thành hệ sợi Hệ sợi xạ khuẩn chia thành khuẩn ty chất khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty chất khuẩn ty cịn khuẩn ty khí sinh phát triển mạnh hay yếu, chí khơng phát triển tùy chi lồi Đa số khuẩn ty xạ khuẩn khơng có vách ngăn; màu sắc phong phú,có thể gặp màu da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu, trắng, vàng, xám Khuẩn ty chất tiết vào mơi trường số loại sắc tố, có sắc tố tan nước, có loại phụ thuộc pH, có loại tan dung môi hữu Trong môi trường đặc hiệu có loại xạ khuẩn tạo sắc tố melanoid sẫm đen Khuẩn ty chất xạ khuẩn phát triển thời gian dài khơng khí thành khuẩn ty khí sinh Tập hợp tập đoàn xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn Khuẩn lạc xạ khuẩn có dạng thơ ráp, dạng phấn khơng suốt, có nếp gấp tỏa theo hình phóng xạ, ❖ Đặc điểm cẩu tạo tế bào: - Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn ứiay đổi khoảng từ 0,3-1,0 Ịim đến lụm - Thành tế bào có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm - Màng tế bào chất: chủ yếu phospholipid protein, dày 7,5-10 nm - Mezosom; hình phiến, hình bọng hay hình ống - Các thể ẩn nhập tế bào chất: gồm hạt polysaccarid, hạt polyphosphat 1.2.2.Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces [5],[7],[8] ❖ Đặc điểm hình thái: - Khuẩn lạc: + Tạo thành cụm, bề mặt khơ, xù xì, bao phủ bởimộtlớp bột mịn bụi phấn sợi nhỏ lông tơ + Khuẩn lạc có chân vững khó tách khỏi mơi trường nuôi cấy + Hệ sợi khuẩn lạc: khuẩn ty chất khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty chất: mọc sâu vào mơi trưịng ni cấy, khơng phân cắt suốt trình phát triển, bề mặt nhẵn sần sùi Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty chất phát triển dài khơng khí Sau thời gian phát triển đỉnh khuẩn ty khí sinh xuất chuỗi bào tử - Chuỗi bào tử: mọc đơn hay mọc vịng gồm thẳng, uốn cong, móc câu đon hay kép, xoắn lị xo cáchìnhthái Nhận xét\ n-butanol cho kết chiết tốt, chiết pH =3 cho kết chiết tốt Do sử dụng n-butanol làm dung môi chiết KS từ chủng Streptomyces 16.34 pH chiết 2.2.6 Ket sắc ký lớp mỏng Tiến hành sắc ký lớp mỏng dịch chiết n-butanol để sơ xác định thành p h ấn ^ án g sinh làm sở cho việc tinh chế sau Ba hệ dung môi sắc ký có thành phần sau: Hệ dung mơi 1: Cloroform : Methanol: NH4OH 25% (2:2:1) Hệ dung môi : n-butanol: Ethanol: Dimethylformamid (3:1:1) Hệ dung môi 3: Butylacetat: Aceton : Triethylamin (1:2: 1) vết kháng sinh phát phương pháp hình vi sinh vật Kết trình bày bảng 12 hình P.3 (PL), Bảng 12: Kết chạy SKLM ( thử với B.pumỉỉus ) Kết Dung môi Rf Hệ 0,85; 0,93 Hệ 0; 0,83 Hệ 0,89 Nhận xét: Dịch chiết kháng sinh chạy SKLM với hệ dung môi sử dụng Sơ kết luận dịch chiết có tìiành phần có hoạt tính kháng sinh 2.2.7 Kết kiểm tra thay đổi bột kháng sinh thô Dịch chiết n-butanol đem cất chân không thu bột kháng sinh thô, kiểm tra biến đổi hoạt tính kháng sinh thành phần kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc phương pháp SKLM (chạy với hệ dung môi trên) Thu két sau: (bảng 13, bảng 14) Bảng 13: Kết kiểm tra biến đổi hoạt tính bột kháng sinh thơ \ Kết Hoạt tính kháng sinh B pumỉlus \ p mirabilis %biên đơi Mầu D{mm) hoạt tính 23,60 BộtKS s 0,70 108,85 21,68 0,38 100,00 %biên đơi s hoạt tính 21,00 0,85 104,47 20,10 0,47 100,00 D{mm) thô/aceton Dịch chiêt Bảng 14: Kết SKLM dịch chiết bột KS thô (thử với B pumỉlus) Kết Hệ dung Rf Bột KS thô Dịch chiêt 0,85; 0,93 0,85; 0,93 ; 0,84 0; 0,84 0,89 0,89 Nhận xét: hoạt tính kháng sinh thơ thay đổi ít, SKLM cho vết dịch chiết KS dịch kháng sinh thơ/ aceton trùng nhau.Vậy hoạt tính thành phần kháng sinh coi không thay đổi sau cất chân không Hệ dung môi cho kết tách tốt Do vậy, sử dụng hệ dung môi cho trình tinh chế sau 2.2.8 Kết sắc ký cột Cân lượng xác bột kháng sinh thô khối lượng 0,030 l(g), tiến hành sắc ký cột, sử dụng hệ dung môi 4, thu 15 phân đoạn phản hấp phụ Thử hoạt tính 15 phân đoạn phương pháp khoanh giấy lọc, kết sau:(Bảng 15) hình P.4, P.5 (PL) Nhận xét: Phân đoạn có hoạt tính kháng sinh mạnh Các phân đoạn từ đến có hoạt tính kháng sinh giữ lại để nghiên cứu tiếp SKLM phân đoạn với hệ dung môi Được kết sau: (Bảng 16) Bảng 16: Kết SKLM phân đoạn (thử với B.pumỉlus) Phân đoạn Kết Rf Nhận xét : 0,93 0,93 0,93 0,93 0,93 0,85 sắc ký đồ phân đoạn 2, 3, 4, 5, 0,85 0,85 cho vết trùng Các vết phân đoạn 7, , trùng Có thể kết luận phân đoạn chứa hoạt chất kháng sinh Đem cất chân khơng phân đoạn 2, 3, ,5, thu bột kháng sinh tinh chế, có màu vàng sẫm, khối lượng 0,025 gam (bột KS (1)) Hiệu suất trình tinh chế : (0,0250 / 0,0301) X 100 = 83,05 % Hiệu suất trình tinh chế tương đối cao Đem cất chân không phân đoạn 7, thu bột KS có màu nhạt hon khối lượng , 0 gam (bột KS (2 )) 2.2.9 Kết kiểm tra biến đổi hoạt tính kháng sinh tinh chế Cân xác lượng bột kháng sinh tinh chế lượng bột kháng sinh thơ hịa tan methanol với tỷ lệ ngang So sánh hoạt tính kháng sinh hai dịch ứiu phương pháp khoanh giấy lọc phương pháp SKLM Kết trình bày bảng 17,18 hình P (PL): Bảng 17: Hoạt tính kháng sinh bột KS tinh chế bột KS thơ Hoạt tính \K e t B pumỉlus p mỉrabỉlỉs %biên Mầu Đ(mm) s đổi hoạt %biên D(mm) s tính BộtKS đổi hoạt tính 23,64 0,56 117,61 22,00 0,51 115,91 22,85 0,80 113,68 21,72 0,37 114,98 20,10 0,67 100,00 18,89 0,23 100,00 (l)tinh/methanol BộtKS (2 )tinh/methanol BộtKS thô/methanol Bảng 18: Kết SKLM bột KS thô KS (1) tinh / methanol (thử với B pumilus) Bột KS (1) tinh / methanol Bột KS thô/ methanol 0,93 0,93 Kết Rf ^ Nhận xét: hoạt tính bột KS tinh chế có thay đổi so với bột KS thô, cho thấy bột KS tinh chế tinh khiết hoĩi bột ứiô Thành phần bột KS tinh chế không ứiay đổi, bột KS tinh khiết sắc ký 2.2.10 Kết thử khả chống nấm Để thử tác dụng chống nấm kháng sinh Streptomyces 16.34 tạo ra, sử dụng dịch chiết n-buthanol (tại pH =3), dịch nước loại, dịch lọc methanol để thử hoạt tính phương pháp khuyếch tán sử dụng khối thạch khoanh giấy lọc Thử với c aỉbicanSị mốc xanh sp 1, A nỉger Kết trình bày bảng 19 hình P.7 P (PL): Bảng 19: Kết thử khả chống nấm chủng Streptomyces 16.34 Kêt STT Mau thử c albicans A niger Môc xanh sp D(mm) ĩ s D(mm) s D(mm) s (CMng 1634)' 15,60 0,32 15,96 0,36 13,90 1,2 Dịch lọc nước 13,80 1,10 11,61 1,11 17,70 0,56 Dịch n-butanol (pH3) 0,00 0,00 0,00 Nước loại 0,00 0,00 0,00 Dịch lọc 13,47 1,20 13,36 0,73 12,34 0,90 methanol Nhận x é t : Kháng sinh chủng Sữeptomyces 16.34 tạo có tác dụng chống nấm rõ rệt Dịch chiết n-butanol (dịch chiết có hoạt tính với vi khuẩn), pha nước loại (sau chiết n-butanol pH =3) khơng có tác dụng chống nấm Do sơ kết luận thành phần có tác dụng chống nấm bị nbuthanol phá hủy, có nhiều khả chất khác Streptomyces i ố 3^ tổng hợp Dịch lọc methanol có hoạt tính chống nấm Do sử dụng dịch lọc cho nghiên cứu khả chống nấm chủng Streptomyces 16.34 2.2.11 Kết sắc ký kháng sinh chống nấm Dịch lọc methanol sau cất chân không thu bột thơ, cân 10 mg bột KS thơ hịa tan vào 10 ml methanol, tiến hành SKLM bột số hệ dung môi, nhận thấy hệ dung môi ( Cloroform : methanol : NH4 OH 25% (2 :2 : ) ) có khả tách tốt Cân xác lượng 0,0250 gam bột thơ tiến hành sắc ký cột, sử dụng hệ dung môi , thu phân đoạn phản hấp phụ Thử hoạt tính 8 phân đoạn phưoTig pháp khoanh giấy lọc với A nỉger, kết trình bày bảng 20: Bảng 20: Hoạt tính chống ĩ\ầmA nỉger phân đoạn Kết Hoạt tính £)(mm) s 0,00 0,00 10,62 0,75 15,21 0,44 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Phân đoạn Nhận xét: Các phân đoạn 2, có khả chống nấm, giữ lại cho nghiên cứu PHẦN - KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 3.1 KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu chúng tơi hồn thành mục tiêu đề thu kết sau: - Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên đột biến cải tạo giống qua hệ chọn số biến chủng có hoạt tính cao so với chủng ban đầu r Trong môi trường khảo sát, môi trường MT4 dd mơi trường lên men chìm tốt cho chủng Streptomyces 16.34 sinh tổng hợp kháng sinh - Tiến hành chiết sắc ký lóp mỏng với số hệ dung mơi, kết cho ứiấy có ửiành phần kháng sinh có hoạt túih với vi khuẩn vi nấm - Thành phần có hoạt tính với vi khuẩn chiết hồn tồn nbutanol pH=3 - Thành phần có hoạt tính với vi nấm khơng thể chiết n-butanol, thu nhận từ môi trường nuôi cấy bề mặt sử dụng methanol - Kháng sinh Sữeptomyces 16.34 sinh tổng họp có tìiể tách tinh chế phương pháp sắc ký ừên cột với chất hấp phụ Silicagel 60 F245, Merck 3.2 ĐÈ XUẤT - Tiếp tục nghiên cứu đột biến ánh sáng u v nhằm tạo nhiều chủng đột biến dưong cao, tăng khả sinh tổng hợp kháng sinh - Tiếp tục nghiên cứu điều kiện lên men để nâng cao hiệu suất lên men - Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện trình chiết tách tinh chế kháng sinh tinh khiết - Tiếp tục nghiên cứu, chiết tách thành phần có hoạt tính chống nấm - Tiếp tục phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) phổ khối để có ứiể xác định cấu trúc hóa học, đặc túih hóa, lý, kháng sinh ứiu TÀI LIỆU THAM KHẢO I] Bộ môn Dược Lý (2004), Dược lý học, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tập2,tr 112-130 [2] Bộ mơn Hóa Phân Tích (2002), Hỏa phân tích, Trưịng Đại Học Dược Hà Nội, tập 2, tr 43-98 [3] Bộ môn Công Nghiệp Dược (2003), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tập 1, tr 142-164 [4] Bộ mơn Hóa Phân Tích (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại Học DượcHàNội,tr.l03-128 5] Bộ môn Vi sinh Sinh học (2005), Vi sinh vật học, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tr 3-30; tr 37-47; tr 73-89 ] Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 9-23 7] Hoàng Thị Hồng cẩm (2006), Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Sừ'eptomyces 21.123, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học, Trường Đại Học Dược Hà Nội ’8] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr 38-41 9] Từ Minh Kng (2004), Cơ sở cơng nghệ sinh học sản xuất dược phẩm, NXB Y học, tr 42-54 [10] Lê Đình Lưong, Phan Cự Nhân (2003), Cơ sở di truyền học, NXB Giáo dục, tr.40-49 II] Lê Xuân Phương (2001), Vỉ sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, tr 212-228 [12] Huỳnh Thu Trang ( 2002), Góp phần nghiên cứu khảng sinh từ chủng Sừ-eptomyces 315, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học, Trường Đại Học Dược Hà Nội [13] Motoo Kobayashi, Seiji Yoshimura, Takayoshi Kinoshita, Michizane Hashimoto, Seiji Hashimoto, Shigehiro Takase, Akihiko Fujie, Motohiro Hino, and Yasuhiro Hori (2005), “FR207944, an Antifiingal Antibiotic from Chaetomium sp No.217 Il.Isolation and Structure Elucidation”, Bioscience, Biotechnologyl, and Biochemistry, Vol 69, p 1029-1032 [14] Kobayashi, M., Kanasaki, R., Sato, L, Abe, F., Nitta, K., Ezaki, M., Sakamoto, K., Hasimoto, M,, Fujie, A., Hino and et al (2005) “FR207944, an Antifimgal antibiotic from Chaetomium sp No 217 I Taxonomy, frmentation and biological prperties”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol 69, p.515-521 15] Shigematus, N., Tsujii, E., Kayakiri, N., Takase, s., Tanaka, H., and Tada (1992) “WFl 1605, an antagonist of leukotriene B4 produce by a fungus II Structure determination”, J Antibiotics, Vol 45, p.704-708 [16] Andre A Neves, Luis M Vieria and Jose c Menzes (2001), “Effect of Perculture variabilyti on clavunalic and Permentation”, Biotechnology and Bioengineering, Vol 72, p.628-632 17] Johanes A Roubos, Perben Krabben, w T.A.M de Laat, Robert Babuska and Joseph J Heijnen (2002), “Clavunalic acid degradation in Sú’eptomyces clavuligerus — Batch cultivations”, Biotechnologyl, Progress, Vol 18, p.451-457 Phần phụ lục Hình p 1: Hoạt tính kháng sinh dạng chủng chọn lọc tự nhiên (vi khuẩn kiểm định Bacillus pumilus) Hình P.2: Hoạt tính kháng sinh biến chủng sau đột biến lần (vi khuẩn kiểm định Bacillus pumilus) Hình P.3: Kết SKLM dịch chiết n-butanol vói hệ dung mơi V khuân kiêm định Bacillus pumilus) I Hưứi R4: Hoạt tính kháng sũih phân đoạn khuẩn kiểm định Bacillus pumiius) 1 (vi ( Hình P.5: Hoạt túứi kháng sinh phân đoạn , 7, , 9, 10, ( vi khuẩn kiểm định B pumilus) % ;v ^ iS lS Hình R6 : Kết SKLM bột KS (1) tinh/methanol (vi khuẩn kiểm định B pumilus) Hình R7: Hoạt túứi chống nấm chủng Streptomyces 16.34(1), dịch chiết n-butanol (2), dịch lọc nước (3), pha nước loại(4, pH chiết =3), (vi nấm kiểm định mốc xanh sp.l) Hình R : Hoạt tứứi chống nấm dịch chiết n-butanol(l) (tại pH 3), dịch lọc methanol(2), pha nước loại(3) (tại pH chiết = 3) Hình RẴ; Máy lắc lên men Bio Shaker BR 300 LF P-9 Hình FV Nồi hấp vơ trùng Hirayama 9: P-40 ... Streptomyces 16. 34 có khả sinh tổng hợp KS Kết trình bày bảng Bảng 9: Khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Sừ-eptomyces 16. 34 môi trưcmg lên men khác lên men chìm Hoạt tính kháng sinh MT lên men. .. xuất phương pháp lên men chìm Lên men chìm chia thành lên men gián đoạn, lên men có bổ sung, lên men liên tục lên men bán liên tục > Lên men gián đoạn (lên men có chu kỳ): trình lên men coi hệ thống... nghiên cứu rộng rãi nhằm phục vụ cho việc tìm kiếm kháng sinh mới, ứng dụng điều trị Do đó, tơi lựa chọn đề tài: “ Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nìíìỉ Strepíomyces 16. 34