BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TIẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TIẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA 2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực công trình nghiên cứu nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo chân tình Thầy Cô, bạn đồng nghiệp Cơ quan. Trước hết cho phép bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Giáo Sư Tiến Sĩ Hoàng Đình Hòa, Phó Giáo Sư Tiến Sĩ Quản Lê Hà, người hướng dẫn, bảo, động viên giúp đỡ tận tình suốt trình thực luận án. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch thuộc Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn giúp đỡ trình thực đề tài hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn Sở khoa học Công nghệ Hà Nội cấp kinh phí cho tôi, giúp đỡ trình thực đề tài hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn đến Thầy cô Viện Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm - Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội giúp đỡ suốt trình làm luận án. Tôi xin cảm ơn đồng nghiệp làm việc động viên giúp đỡ thời gian thực đề tài hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Giáo Sư, Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ chủ tịch hội đồng, phản biện Ủy viên hội đồng dành nhiều thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án với góp ý cụ thể, gợi ý bổ ích, giúp hoàn tất tốt nội dung nghiên cứu luận án. Bên cạnh đó, xin gửi lời biết ơn đến bố mẹ, gia đình người thân với tất tình yêu khuyến khích, ủng hộ dành cho chặng đường để hoàn thành luận án nghiên cứu này. Tác giả luận án NGUYỄN ĐỨC TIẾN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án công trình nghiên cứu riêng tôi. Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác. Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2015 Tập thể giáo viên hướng dẫn 1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA 2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ Tác giả luận án NGUYỄN ĐỨC TIẾN MỤC LỤC MỞ ĐẦU . 1. Đặt vấn đề 2. Nội dung 3. Đối tượng phạm vi nghiên cứu . 4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học tính thực tiễn luận án . 5. Bố cục luận án . Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) . 1.1.1. Khái niệm ĐTĐ . 1.1.2. Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ . 1.2. Cơ sở khoa học việc sử dụng AGIs đến trình trao đổi đường thể . 1.2.1. Enzyme α-glucosidase . 1.2.1.1. Sơ lược enzyme . 1.2.1.2. Giới thiệu enzyme α - glucosidase . 1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ 1.3. Chất kìm hãm α-glucosidase (alpha-Glucosidase inhibitor) (AGIs) 11 1.3.1. Các AGIs từ tổng hợp 12 1.3.2. AGIs từ động vật . 12 1.3.3. AGIs từ thực vật 12 1.3.4. AGIs từ vi sinh vật . 14 1.3.5. AGIs từ A.oryzae . 15 1.4. Đỗ đen sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ 16 1.4.1. Đỗ đen . 16 1.4.2. Sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ 17 1.5. A.oryzae lên men bề mặt 19 1.5.1. Đặc điểm hình thái A.oryzae . 19 1.5.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng hình thành AGIs A.oryzae . 21 1.5.2.1. Ảnh hưởng nguồn carbon 22 1.5.2.2. Ảnh hưởng nguồn nitơ . 23 1.5.2.3. Ảnh hưởng nguồn khoáng dinh dưỡng 23 1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng hình thành AGIs A.oryzae . 24 1.5.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy . 24 1.5.3.2. Độ ẩm môi trường 24 1.5.3.3. Ảnh hưởng độ thoáng khí . 25 1.5.3.4. Điều kiện pH ban đầu môi trường . 25 1.5.3.5. Tỷ lệ giống 26 1.5.3.6. Thời gian lên men . 27 1.6. Thu nhận AGIs . 27 1.6.1. Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men . 27 1.6.2. Tinh AGIs 29 1.7. Ứng dụng sóng siêu âm chiết xuất 30 1.8. Nghiên cứu, thử nghiệm ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men giới 35 1.9. Nghiên cứu ứng dụng AGIs Việt Nam . 39 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu 41 2.1.1. Các nguồn vi sinh vật vật liệu . 41 2.1.2. Hóa chất . 41 2.1.3. Môi trường . 42 2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy phân lập giữ giống . 42 2.1.3.2. Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus . 42 2.1.3.3. Môi trường đậu đỗ giá thể rắn . 42 2.1.3.4. Các môi trường rắn cho nhân giống 42 2.1.3.5. Đỗ đen lên men . 43 2.1.4. Thiết bị . 43 2.1.5. Địa điểm thời gian nghiên cứu 43 2.1.5.1. Địa điểm nghiên cứu . 43 2.1.5.2. Thời gian nghiên cứu 43 2.2. Phương pháp phân tích đo đạc . 44 2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc . 44 2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase . 44 2.2.2.1. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase môi trường sau lên men theo phương pháp Yamaki Mori (2006) . 44 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase dịch chiết xuất dung môi 45 2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki cộng sự, (1999) 45 2.2.2.4. Hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (giá trị IC50) . 45 2.2.3. Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate độ ẩm sản phẩm thực phẩm 46 2.2.4. Phương pháp phân tích cảm quan 46 2.2.5. Phương pháp tính toán, đánh giá hiệu tinh chế phẩm AGIs kỹ thuật . 47 2.2.6. Phương pháp phân tích tiêu an toàn thực phẩm 47 2.2.7. Phương pháp phân tích xử lý số liệu 47 2.3. Phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát . 48 2.3.2. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 49 2.3.2.1. Phân lập A.oryzae . 49 2.3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 50 2.3.2.3. Định danh chủng nấm tuyển chọn dựa so sánh trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 . 50 2.3.3. Xác định số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng A.oryzae T6 nhân giống môi trường rắn 52 2.3.3.1. Ảnh hưởng thành phần chất môi trường rắn đến sinh trưởng A.oryzae T6 52 2.3.3.2. Ảnh hưởng thành phần tỷ lệ trấu môi trường rắn đến sinh trưởng A.oryzae T6 52 2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu môi trường nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 52 2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 52 2.3.3.5. Ảnh hưởng nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 . 52 2.3.3.6. Ảnh hưởng độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 53 2.3.3.7. Ảnh hưởng thời gian nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 53 2.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 53 2.3.4.1. Ảnh hưởng nguồn chất môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 53 2.3.4.2. Ảnh hưởng thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 53 2.3.4.3. Ảnh hưởng thành phần K2HPO4; KCL MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 . 53 2.3.4.4. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 . 54 2.3.4.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 54 2.3.4.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 . 54 2.3.4.7. Ảnh hưởng lượng giống ban đầu lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 . 54 2.3.4.8. Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 . 55 2.3.4.9. Sự biến động AGIs trình lên men A.oryzae T6 55 2.3.5. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men sử dụng sóng siêu âm . 55 2.3.5.1. Ảnh hưởng dung môi đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 55 2.3.5.2. Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 55 2.3.5.3. Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi ethanol đỗ đen lên men đến khả chiết xuất AGIs . 56 2.3.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men: . 56 2.3.5.5. Ảnh hưởng thời gian cường độ sóng siêu âm đến khả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men . 56 2.3.6. Tinh định lượng AGIs từ đỗ đen lên men . 56 2.3.6.1. Khảo sát dung môi cho tinh sơ AGIs . 56 2.3.6.2. Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sơ AGIs 57 2.3.6.3. Thu nhận AGIs 57 2.3.6.4. Tinh AGIs RP - HPLC . 57 2.3.6.5. Xác định khối lượng phân tử trình tự amino acid AGIs khối phổ 57 2.3.6.6. Định lượng peptide AGIs RP - HPLC . 58 2.3.7. Ứng dụng AGIs . 58 2.3.7.1. Ảnh hưởng nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs 59 2.3.7.2. Đánh giá tiêu chất lượng, cảm quan an toàn thực phẩm chế phẩm AGIs . 59 2.3.7.3. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs . 60 Với A: T3; 61 2.3.8. Đề xuất công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men A.oryzae T6 62 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 63 3.1. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao . 63 3.1.1. Phân lập Aspergillus oryzae 63 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao . 64 3.1.3. Định danh chủng tuyển chọn dựa so sánh trình tự gen vùng ITS1- 5,8S - ITS2 . 66 3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng A.oryzae T6 nhân giống môi trường rắn . 68 3.2.1. Ảnh hưởng thành phần chất môi trường rắn đến sinh trưởng A.oryzae T6 . 68 3.2.2. Ảnh hưởng thành phần tỷ lệ trấu môi trường rắn đến sinh trưởng A.oryzae T6 70 3.2.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu môi trường nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 71 3.2.4. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 . 72 3.2.5. Ảnh hưởng nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 73 3.2.6. Ảnh hưởng độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 . 74 3.2.7. Ảnh hưởng thời gian nhân giống đến sinh trưởng A.oryzae T6 . 76 3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 . 77 3.3.1. Ảnh hưởng nguồn chất môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 . 77 3.3.2. Ảnh hưởng thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 79 3.3.3. Ảnh hưởng thành phần K2HPO4, KCL MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men đến khả hình thành AGIs A.oryzae T6 . 80 143 A.oryzae strain Yz12 18S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|JX489381.1| Length: 1030Number of Matches: Query Sbjct 633 Query 61 Sbjct 573 Query 121 Sbjct 513 Query 181 Sbjct 453 Query 241 Sbjct 393 Query 301 Sbjct 333 Query 361 Sbjct 273 Query 421 Sbjct 213 Query 481 Sbjct 153 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 60 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 120 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 180 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 240 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 300 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 360 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTA ATAAATACACCCCTTCC ||||||||||||||||| ATAAATACACCCCTTCC 574 514 454 394 334 274 420 214 480 154 497 137 Hình PL.1 So sánh độ tương đồng trình tự nucleotide đoạn ADN vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng T6 với trình tự nucleotide A.oryzae công bố Ngân hàng liệu Quốc tế với mã số gbJX489381.1 A.oryzae partial 18S rRNA gene, strain ARD 115 144 Sequence ID: emb|FN823241.1|Length: 950Number of Matches: Query Sbjct 652 Query 61 Sbjct 592 Query 121 Sbjct 532 Query 181 Sbjct 472 Query 241 Sbjct 412 Query 301 Sbjct 352 Query 361 Sbjct 292 Query 420 Sbjct 232 Query 480 Sbjct 172 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 60 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 120 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 180 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 240 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 300 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 360 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCA-AGGCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCATAGGCCAT 419 GCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| GCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCT AATAAATACACCCCTTCC |||||||||||||||||| AATAAATACACCCCTTCC 593 533 473 413 353 293 233 479 173 497 155 Hình PL.2 So sánh độ tương đồng trình tự nucleotide đoạn ADN vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng T6 với trình tự nucleotide A.oryzae công bố Ngân hàng liệu Quốc tế với mã số embFN823241.1 145 A.oryzae strain SEMCC-3.248 18S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|HM064501.1|Length: 1770Number of Matches: Query Sbjct 668 Query 61 Sbjct 608 Query 121 Sbjct 548 Query 181 Sbjct 488 Query 241 Sbjct 428 Query 301 Sbjct 368 Query 361 Sbjct 308 Query 421 Sbjct 248 Query 481 Sbjct 188 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 60 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 120 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 180 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 609 549 489 240 429 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 300 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 360 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG 420 CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTA 480 ATAAATACACCCCTTCC ||||||||||||||||| ATAAATACACCCCTTCC 369 309 249 189 497 172 Hình PL.3 So sánh độ tương đồng trình tự nucleotide đoạn ADN vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng T6 với trình tự nucleotide A.oryzae công bố Ngân hàng liệu Quốc tế với mã số gbHM064501.1 146 Conc.(x10) mAU 75 1(#1) Ch1 280nm 2(#1) Ch1 280nm 2(#2) Ch1 280nm 3(#1) Ch1 280nm 50 4(#1) Ch1 280nm 5(#1) Ch1 280nm 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 25 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 22.5 0.0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 Area Hình PL.4 Đường chuẩn chất kìm hãm glucosydase Từ vùng diện tích píc suy đường tuyến tính: Y = aX + b a = 1.818422e-004 b = 11.18738 R^2 = 0.9771138 R = 0.9884907 External Standard Curve Fit Type:Linear Origin:Not Forced Weight:None Mean RF : 6.020700e-004 RF SD : 5.854472e-004 RF %RSD : 97.23906 25.0 27.5 Hình PL.5 Diện tích píc trùng sau chạy HPLC với nồng độ khác chất kìm hãm -glucosydase Bảng PL.3 Vùng diện tích píc với nồng độ khác chất kìm hãm -glucosydase Level Conc (mg/ml) Area 10 6225 20 31433 30 103323 40 171369 50 204929 - Định lượng sản phẩm AGIs dịch trích ly đỗ đen lên men đường chuẩn Conc.(x10) 5.0 Level 4.0 3.0 Bảng PL.4 Vùng diện tích sản phẩm glucosydase so sách với đường chuẩn Conc. Mean Area SD %RSD Area 10 6225 20 38577 30 103323 103323 40 171369 171369 50 204929 204929 Area 6225 2.0 10102.97 26.18913 31433 1.0 0.0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 Area Hình PL.6 Nồng độ sản phẩm sau lên men bề mặt đường chuẩn 29862 147 Hình PL.7 Đỗ đen xanh lòng nguyên liệu Hình PL.8 Cám gạo nguyên liệu Hình PL.10 Thiết bị chiết xuất Hình PL.9 Đỗ đen xanh lòng sau lên men A.oryzae T6 Hình PL.11. Thử độc tính cấp chế phẩm AGIs sóng siêu âm TJS-3000 intelligent Ultrasonic Generator V6 (tần số 20 kHz công suất tối đa 3000W) Hình PL.12. Sản phẩm bột uống liền 148 Phụ lục KQ KP: Xác định khối lượng phân tử trình tự axit amin peptide AGIs từ đỗ đen lên men (đỗ đen xanh lòng lên men A.oryzae T6) khối phổ 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 [...]... bản chất và cơ chế hình thành AGIs từ các loại đậu đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắn băng A .oryzae còn hạn chế Chính vì thế, việc nghiên cứu có hệ thống thu nhận AGIs từ A .oryzae lên men trên các nguồn nguyên liệu trong nước và hướng ứng dụng ở điều kiện hiện tại của Việt Nam là vấn đề cấp thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus. .. 3-O-(-DGlucopyranozyl)-1-deoxynojirimycin, Isofagomin và Noeuromycin là hợp chất thu c nhóm chất iminosugar, Valiolamin, Hydroxyvalidamin và Voglibose là hợp chất thu c nhóm chất carbasugar và pseudoaminosugar, X = O; S; Se; N Tetrahydroxyazepan là hợp chất thu c nhóm chất thiosugar và các hợp chất không có liên kết glycosidic 1.3.2 AGIs từ động vật Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra chất chiết xuất từ Stichopus... được người dân Ấn Độ và Sri Lanka sử dụng như một loại thu c dân gian từ lâu đời ) có hoạt tính kìm hãm αglucosidase Salacinol có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, sucrase và isomaltase của chuột với giá trị IC50 lần lượt là 3,2; 0,84; 0,59 µg/µl Các nghiên cứu thử nghiệm trên chuột chứng minh salacinol có hoạt tính kìm hãm sự tăng nồng độ đường trong máu mạnh hơn acarbose Một vài nghiên cứu lâm sàng... Phần 6: Xây dựng hướng ứng dụng AGIs và đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A .oryzae nghiên cứu: + Xây dựng phương pháp cô sấy dịch chiết AGIs cho tạo chế phẩm AGIs + Đánh giá tính an toàn về độc tính cấp, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và an toàn thực phẩm của AGIs tạo ra bằng A .oryzae nghiên cứu + Đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A .oryzae nghiên cứu 3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nước ta... dạng và ít phản ứng phụ Do đó, các nhà khoa học trên thế giới thường sử dụng những phương pháp sàng lọc hoạt tính kìm hãm enzyme này để định hướng trong nghiên cứu Nhiều nước đã công bố trên các tạp chí quốc tế về các thực vật, vi sinh vật có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với mục đích sử dụng trong lĩnh vực thực phẩm chức năng, dược phẩm, cũng như đã trích ly được nhiều hợp chất có hoạt tính kìm hãm. .. men bằng A .oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 84 Hình 3.15 Ảnh hưởng độ đầy của khối khối môi trường lên men bằng A .oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α - glucosidase 85 Hình 3.16 Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men bằng A .oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α - glucosidase 86 Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men bằng A .oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase... Sâm) có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase Nghiên cứu cho thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 0,5 mg/ml thì hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ nấm men là 68% và từ dịch chiết Hải Sâm đã thu được ba loại AGIs [127] 1.3.3 AGIs từ thực vật Năm 1997, Yoshikawa và cộng sự đã phát hiện salacinol từ dịch chiết của rễ và lá cây Salacia reticulata (một loại cây bụi leo thu c họ... phẩm AGIs bằng A .oryzae nghiên cứu (4) Tinh chế, xác định thành phần hóa học AGIs hình thành bằng A .oryzae nghiên cứu (5) Hướng ứng dụng và đề xuất quy trình công nghệ sản xuất AGIs hình thành bằng A .oryzae nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án được tiến hành với nội dung sau: 2 Nội dung - Phần 1: Tuyển chọn A .oryzae cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao: + Phân lập A .oryzae từ các mẫu tương,... hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men bằng A .oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 80 Hình 3.12 Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men bằng A .oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 81 Hình 3.13 Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men bằng A .oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 82 Hình 3.14 Ảnh... hợp chất được tìm thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase Tuy nhiên, những tác nhân kìm hãm α-glucosidase tổng hợp bằng con đường hóa học hiện nay thường gây nhiều phản ứng phụ Vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Thông thường, việc nghiên cứu các AGIs luôn bắt đầu từ các hợp chất . : 62420 201 LU SINH HC NG DN KHOA HC: 1. GS.TS.  2. PGS.TS. QU i - 2015 LỜI CẢM ƠN Trong thi gian thc. gii p NPG p--D-glucopyranoside RP - HPLC Sng hi o (Reverse phase-high performance liquid chromatography) DANH MỤC BẢNG BIỂU Bng 1.1 Mt s ch-glucosidase. trưởng của A.oryzae T6 52 2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 52 2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng