BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------- ---------- LÂM MAI TÙNG KHẢO SÁT CHỌN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------- ---------- LÂM MAI TÙNG KHẢO SÁT CHỌN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN ĐỨC BÁCH HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị nào. Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2015 Tác giả luận văn Lâm Mai Tùng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp cố gắng thân nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, bạn bè người thân. Trước tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Đức Bách người định hướng nghiên cứu, tận tình bảo, giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin cám ơn chân thành PGS.TS. Phan Hữu Tôn, ThS. Tống Văn Hải, Bộ môn Sinh học phân tử Công nghệ Sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi trình thực luận văn Bộ môn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam người trực tiếp giảng dạy, trang bị kiến thức bổ ích suốt khoảng thời gian học tập nghiên cứu. Cuối cùng, với tất lòng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người bên cạnh động viên giúp đỡ trình học tập thực đề tài. Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2015 Học viên Lâm Mai Tùng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN . iii MỤC LỤC . iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu yêu cầu đề tài 2.1 Mục tiêu 2.2 Yêu cầu . Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung khoai tây . 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại . 1.1.3 Đặc điểm thực vật học . 1.1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh khoai tây 1.1.5 Giá trị dinh dưỡng khoai tây 1.2 Tình hình sản xuất khoai tây giới 1.3 Tình hình sản xuất khoai tây Việt nam . 10 1.4 Bệnh mốc sương khoai tây . 11 1.4.1 Lịch sử phát . 11 1.4.2 Phạm vi phân bố . 12 1.4.3 Triệu chứng . 12 1.4.4 Nguyên nhân gây bệnh 13 1.4.5 Điều kiện phát sinh phát triển 15 1.5 Chỉ thị phân tử ứng dụng . 16 1.5.1 Khái niệm thị phân tử . 16 1.5.2 Chỉ thị phân tử chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai 21 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv Chương II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 30 2.1 Vật liệu nghiên cứu . 30 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 31 2.3 Nội dung nghiên cứu . 31 2.4 Phương pháp nghiên cứu . 31 2.4.1 Ngoài đồng ruộng . 31 2.4.2 Phương pháp đánh giá số tiêu nông sinh học 32 2.4.3 Phương pháp PCR phát gen kháng sương mai R1 R3a 34 2.4.4 Phân lập mẫu bệnh sương mai khoai tây Phytophthora infestans . 36 2.4.5 Đánh giá bệnh lây nhiễm nhân tạo 37 Chương III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Đặc điểm nông sinh học số mẫu giống khoai tây vụ đông xuân 38 3.1.1 Thời gian sinh trưởng qua giai đoạn 38 3.1.2 Đặc điểm thân . 44 3.1.3 Đặc điểm . 48 3.1.4 Đặc điểm hoa, mẫu giống khoai tây . 52 3.1.5 Đặc điểm củ khoai tây . 56 3.1.6 Năng suất yếu tố cấu thành suất . 60 3.2 Đánh giá mức độ nhiễm bệnh đồng ruộng 63 3.2.1 Bệnh sương mai hay mốc sương 66 3.2.2 Bệnh đốm 67 3.2.3 Bệnh héo xanh 67 3.2.4 Bệnh héo vàng 67 3.2.5 Bệnh hại virut gây 68 3.2.6 Sâu xám 68 3.3 Kết PCR phát gen kháng sương mai R1 R3a 68 3.4 Phân lập nấm bệnh sương mai lây nhiễm đánh giá khả nhiễm 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 74 Kết luận 74 Đề nghị . 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 75 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Năng suất protein lượng số lương thực . Bảng 1.2 Năng suất khoai tây nước đứng đầu giới năm 2012- 2013 10 Bảng 2.1 Bảng mẫu giống nghiên cứu . 30 Bảng 2.2 Các thị phân tử DNA sử dụng để phát gen R1, R3a kháng sương mai . 36 Bảng 3.1 Thời gian sinh trưởng . 41 Bảng 3.2 Đặc điểm thân mẫu giống . 46 Bảng 3.3 Đặc điểm mẫu giống 49 Bảng 3.4 Đặc điểm hoa, mẫu giống khoai tây . 54 Bảng 3.5 Đặc điểm củ khoai tây 56 Bảng 3.6 Năng suất yếu tố cấu thành suất. 60 Bảng 3.7 Mức độ nhiễm số bệnh đồng ruộng 64 Bảng 3.8 Mức độ nhiễm số bệnh đồng ruộng 70 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây khoai tây . Hình 1.2 Thành phần dinh dưỡng 100 gam củ khoai tây sau luộc nướng . Hình 1.3 Bản đồ gen kháng đặc hiệu chủng bệnh mốc sương khoai tây . 22 Hình 1.5 Bản đồ gen RB/Rpi-blb1 23 Hình 1.6 Bản đồ gen Rpi-blb2 25 Hình 3.1 Các dạng khoai tây . 52 Hình 3.2 Các dạng thân khoai tây . 52 Hình 3.3 Hoa khoai tây . 55 Hình 3.4 Một số hình ảnh màu vỏ củ 59 Hinh 3.5 Điện di sản phẩm PCR phát gen kháng R1 . 69 Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR phát gen kháng R3a . 69 Hình 3.7 Lây nhiễm đánh giá nhân tạo . 73 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC VIẾT TẮT DNA Deoxyribo Nucleic Acid PCR Polymerase Chain Reaction CTAB Cetyl trimethyl Ammonium Bromide PCR Polymerase Chain Reaction EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid ALP Amplicon length polymorphism AFLP Amplified fragment lenght polymorphism RAPD Random amplified polymorphic DNA RGA Resistance Gene Analog SSR Single sequence repeat, microsetellite SNPs Single nucleotide polymorphism SSCP Single strand confortmation polimophism STS Sequence Tagged site MRDHV Moderately repeat, dispersed and highly variable DNA, minisatelite Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Khoai tây có tên khoa học Solanum tuberosum L., thuộc họ Solanaceae, có nguồn gốc từ vùng núi Andes Bolivia Peru, trồng ngắn ngày, chiếm vị trí quan trọng lương thực, thực phẩm phục vụ cho người. Hiện nay, khoai tây loài trồng lấy củ rộng rãi giới, trồng phổ biến thứ tư mặt sản lượng lương thực sau lúa, lúa mì ngô. Chúng có đặc điểm dễ trồng, cho thu hoạch nhanh thích ứng với điều kiện môi trường khác (International Year of the Potato. 2008; Jeff Chapman cs. 2011). Tuy nhiên, khoai tây thường hay nhiễm số bệnh hại làm ảnh hưởng không nhỏ đến suất chất lượng củ. Bệnh hại khoai tây đa dạng, phong phú thành phần nguyên nhân gây bệnh như: bệnh sương mai, bệnh héo vàng, bệnh đốm lá, bệnh héo rũ vi khuẩn, bệnh xoăn virus….Trong bệnh sương mai nấm Phytophthora infestans gây bệnh hại nghiêm trọng bậc nhất, gây thiệt hại 16% suất toàn giới (Haverkort A cs. 2009). Bệnh lây nhiễm toàn cây, bao gồm thân củ (Fry W. 2008). Để đối phó với dịch bệnh, tạo phát triển bền vững giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật tạo sản phẩm việc tạo giống khoai tây với khả kháng cao với Phytophthora infestans coi chiến lược bền vững cho việc trồng khoai tây tương lai. Nhờ phát triển mạnh mẽ sinh học phân tử, công nghệ chọn tạo giống nhờ thị phân tử đời rút ngắn thời gian chọn tạo giống, đảm bảo độ xác quy tụ nhiều gen mục tiêu vào giống mà phương pháp chọn giống truyền thống khó thực được. Để tạo giống khoai tây việc phải có nguồn gen kháng thị phân tử liên kết với gen kháng đó, sau đánh giá xác định khả kháng bệnh sương mai giống để sử dụng công tác lai tạo giống sau này. Gen kháng bệnh sương mai lai tạo từ loài dại S. demissum, S. stoloniferum S. tuberosum subsp. andigena, S. phureja loài khoai tây trồng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Bảng 3.7. Mức độ nhiễm số bệnh đồng ruộng Cấp độ STT Tên mẫu nhiễm giống bệnh đốm Cấp độ nhiễm Bệnh sương mai Bệnh Bệnh héo héo xanh vàng (%) (%) Sâu Bệnh xám virus (%) (%) PI442690 PI498094 10 PI208881 PI458395 18 PI320315 PI472772 PI472934 15 PI498104 PI275161 10 PI161172 12 11 PI472735 12 PI275189 18 13 PI160215 14 PI472759 25 15 PI186553 10 16 PI442688 20 20 15 17 PI279276 18 PI275235 12 12 19 PI473402 20 PI243506 21 PI218215 10 10 22 PI338620 23 PI283109 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 24 PI595517 25 PI558139 26 PI225673 33 27 PI338617 28 PI245317 20 10 29 PI175419 30 PI320284 15 31 PI310978 10 32 PI473228 10 33 PI472823 10 34 PI279291 10 35 PI472869 36 PI243457 37 PI225628 38 PI473234 39 PI230468 15 10 40 PI498110 12 41 PI234013 42 PI281112 15 43 PI292075 12 44 PI232841 10 12 45 PI283096 46 PI584496 10 47 PI473073 48 PI133619 49 PI275163 12 50 PI281066 12 20 51 PI320342 52 PI133636 25 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 53 PI320292 20 54 PI161350 12 12 55 PI310986 56 PI280977 57 PI275240 12 58 PI458397 59 PI230557 60 PI292121 61 PI338614 62 PI338621 63 PI320293 15 64 PI320311 65 PI281093 15 66 PI310961 12 67 PI458331 10 68 PI473230 20 69 PI473538 10 60 70 PI161152 71 PI217451 72 PI133713 73 PI 175443 74 PI 279278 75 PI473245 76 PI472737 3.2.1. Bệnh sương mai hay mốc sương Bệnh sương mai số bệnh gây hại nghiêm trọng khoai tây. Bệnh nấm Phytophthora infestans gây ra. Trên lá, vết bệnh ban đầu vết nhỏ màu nâu, lan rộng dần từ chóp cọng vào phiến tạo thành đám mô bị thối nâu, nhũn ẩm ướt, rũ xuống khô trời Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 nắng, làm cho khoai tây không sinh trưởng phát triển bị nặng. Trong 76 mẫu giống nghiên cứu có 51 mẫu giống không bị nhiễm bệnh mức điểm có 25 giống bị nhiễm nhẹ mức điểm 3. Như mẫu giống khoai tây phần lớn có khả kháng tốt với bệnh sương mai điều kiện tự nhiên. Để có kết luận xác cần phải lây nhiễm nhân tạo nhiều chủng nấm bệnh sương mai. 3.2.2. Bệnh đốm Bệnh nấm Alternaria solani gây ra. Trên xuất đốm nhỏ (đường kính 2-3mm) màu nâu đậm đến đen có vòng đồng tâm, đốm nhiều dần nhập với thành đốm lớn, chiếm diện tích lớn phiến lá, thân củ nhiễm bệnh, làm giảm suất từ 10-40% suất thực thu khoai tây. Từ kết theo dõi nhận thấy mẫu giống theo dõi có 23 mẫu giống bị nhiễm bệnh mức độ nhẹ. Bệnh xuất nhiều gây bệnh mức độ nhẹ không gây ảnh hưởng nhiều đến khả sinh trưởng suất mẫu giống. 3.2.3. Bệnh héo xanh Bệnh vi khuẩn Pseudomonas solanacearum gây ra, làm héo đột ngột, bệnh thường hại nặng trưởng thành, củ mạnh. Trên bị bệnh, xanh, héo cành toàn thân cây, làm giảm suất trầm trọng trí trắng khoai tây bước vào giai đoạn đâm tia củ nuôi củ. Dựa vào kết theo dõi đồng ruộng nhận thấy bệnh héo xanh bệnh gây ảnh hưởng nhẹ đến tất mẫu giống khoai tây nghiên cứu. Trong 76 giống nghiên cứu có 14 giống bị bênh mức độ nhẹ mức từ 5,0% đến 15,0%. 3.2.4. Bệnh héo vàng Bệnh gây nấm Fusarium oxysporum, gây hại vị trí gốc thân, cổ rễ củ. Ở gốc cây, vết bệnh màu nâu màu xám nhạt bao quanh gốc, gây tượng thối khô tóp lại, cắt ngang phần mô bệnh thấy bó mạch có màu nâu xám, thường vết bệnh có bao phủ lớp nấm trắng thưa. Điều kiện nhiệt độ từ 18 – 340C, ẩm độ cao thích hợp cho nấm phát triển. Kết bảng 4.7 nhận thấy có 24 giống bị nhiễm bệnh, nhiên mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng, phát triển suất mẫu giống khoai tây nghiên cứu. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 3.2.5. Bệnh hại virut gây Các loại virus Y, virus A hỗn hợp loại virus Y A; gọi virus thường gây hại nặng cho cây. Cây bị bệnh phát triển chậm, lùn; cong queo, hình thìa từ gốc lên, cứng giòn, mầu xanh đậm không đồng nhất; toàn màu vàng nhạt, có vết đen chết lá, thân cây.Các loại virus X, virus S virus M nguyên nhân gây bệnh virus dạng nhẹ. Cây bị bệnh có biểu bị khảm, bị nhăn, phát triển chậm. Dựa vào kết theo dõi đồng ruộng có 25 mẫu giống nhiễm bệnh virus. Trong có 18 mẫu giống nhiễm bệnh nhẹ, mẫu giống nhiễm mức độ trung bình mẫu giống nhiễm bệnh nặng : PI473538. 3.2.6. Sâu xám Sâu xám có tên khoa học Agrotis ipsilon, thuộc họ Ngài đêm (Noctuidae), Cánh vảy (Lepidoptera). Sâu xám loài sâu đa thực, phá hại hàng loạt loại trồng như: ngô, đậu, lạc, cà chua loại họ bầu bí . Các rau màu giai đoạn con, sâu thường phá hại nghiêm trọng, gây ruộng, làm giảm suất. Do điều kiện thời tiết vụ đông xuân 2014-2015 không thuận lợi cho sâu xám phát triển nên ảnh hưởng sâu xám đến sinh trưởng phát triển mẫu giống không đáng kể. 3.3. Kết PCR phát gen kháng sương mai R1 R3a Gen kháng bệnh sương mai R1 R3a hai gen nhà khoa học chứng minh kháng tốt cá chủng Phytophthora infestans châu Á có Việt Nam. Để chọn giống khoai tây kháng chủng bệnh nấm sương mai trước hết phải có nguồn gen kháng, sau phải phân lập chủng bệnh nấm sương mai từ đánh giá để chọn gen kháng hữu hiệu phục vụ đắc lực vào trương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh này. ADN 76 mẫu giống khoai tây chiết tách sau sử dụng thị R1F/R (76-2sf2/76-2SR) để phát gen kháng R1 R3-1380 để phát gen kháng R3a. Khi nhân đoạn thị liên kết với gen R1 kích thước đoạn nhân lên 1.400 bp (Ballvora, et. al., 2002) nghĩa có gen không đoạn nhân lên nghĩa gen. Trong 76 mẫu phát mẫu chứa gen R1 mẫu giống: PI133713, PI320311, PI230557, PI133619 PI558139. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 10 11 12 13 14 15 1400 bp Hinh 3.5. Điện di sản phẩm PCR phát gen kháng R1 Giếng 3, 5, 7, 10 đoạn thị nhân lên liên kết với gen kháng R1, giếng lại đoạn thị không nhân lên Đối với gen kháng R3a, nhân đoạn thị liên kết với gen kích thước đoạn nhân lên 1380 (Sakolova, et. al., 2010) đồng nghĩa chứa gen. Còn giống không chứa gen ADN không nhân lên. Trong tổng số 76 mẫu giống phát mẫu giống chứa gen R3a mẫu giống: PI175419, PI473234, PI234013, PI47307, PI320342, PI338621, PI279278, hình 3.6 bảng 3.8. Như thị phân tử phát mẫu giống chứa gen kháng R1 mẫu giống chứa gen kháng R3a. Những mẫu giống chứa gen R1 R3a cần đánh giá lây nhiễm nhân tạo xem có kháng chủng bệnh sương mai Việt Nam hay không. Nếu giống chứa gen kháng tốt nguồn vật liệu khởi đầu vô quý giá để tạo giống khoai tây kháng bệnh. 10 11 12 13 14 15 1380 bp Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR phát gen kháng R3a Giếng 4, 5, 6, 8, 9, 10 11 có chứa đoạn thị nhân lên, giếng lại Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69 Bảng 3.8. Mức độ nhiễm bệnh lây nhiễm nhân tạo STT Tên mẫu giống Gen R1 Gen R31 Chủng SM1 Chủng SM2 PI442690 - - R S PI498094 - - S S PI208881 - - R M PI458395 - - R R PI320315 - - R R PI472772 - - S S PI472934 - - M M PI498104 - - S R PI275161 - - S R 10 PI161172 - - R R 11 PI472735 - - M R 12 PI275189 - - M R 13 PI160215 - - R R 14 PI472759 - - R R 15 PI186553 - - HR R 16 PI442688 - - S R 17 PI279276 - - R R 18 PI275235 - - R R 19 PI473402 - - S S 20 PI243506 - - S S 21 PI218215 - - R S 22 PI338620 - - R S 23 PI283109 - - M R 24 PI595517 - - S R 25 PI558139 + - HR HR 26 PI225673 - - R R 27 PI338617 - - M R 28 PI245317 - - S R 29 PI175419 - + HR HR 30 PI320284 - - S M Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70 31 PI310978 - - S M 32 PI473228 - - R R 33 PI472823 - - HR R 34 PI279291 - - R M 35 PI472869 - - R M 36 PI243457 - - S M 37 PI225628 - - S S 38 PI473234 - + HR HR 39 PI230468 - - S R 40 PI498110 - - R R 41 PI234013 - + HR HR 42 PI281112 - - R R 43 PI292075 - - S R 44 PI232841 - - M R 45 PI283096 - - M M 46 PI584496 - - R M 47 PI473073 - + HR HR 48 PI133619 + - HR HR 49 PI275163 - - M S 50 PI281066 - - S M 51 PI320342 - + HR HR 52 PI133636 - - S M 53 PI320292 - - S M 54 PI161350 - - S M 55 PI310986 - - S M 56 PI280977 - - S M 57 PI275240 - - S M 58 PI458397 - - S R 59 PI230557 + - HR HR 60 PI292121 - - R R 61 PI338614 - - R R 62 PI338621 - + HR HR 63 PI320293 - - R S Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 64 PI320311 + - HR HR 65 PI281093 - - M S 66 PI310961 - - M S 67 PI458331 - - M S 68 PI473230 - - M S 69 PI473538 - - S R 70 PI161152 - - R S 71 PI217451 - - R S 72 PI133713 + - HR HR 73 PI 175443 - - R S 74 PI 279278 - + HR HR 75 PI473245 - - R S 76 PI472737 - - R R 3.4. Phân lập nấm bệnh sương mai lây nhiễm đánh giá khả nhiễm Để phục vụ trình lây nhiễm nhân tạo thu thập phân lập bệnh sương mai. Kết phân lập 02 mẫu bệnh đặt tên SM1 SM2. SM1 thu thập giống cà chua ST04 Bắc Giang, SM2 thu thập giống HT2 Hải Dương. Tại thời điểm tiến hành thí nghiệm không thu thập mẫu nấm bệnh khoai tây nên bắt buộc phải sử mẫu bệnh sương mai cà chua. Theo tác giả chủng nấm gây bệnh khoai tây chua nấm bệnh Phytophthora infestans gây nên. Sử dụng Isolate lây nhiễm nhân tạo 76 mẫu giống phương pháp đĩa lá. Mỗi giống đặt đĩa petri khay nhựa có dải lớp giấy thấm sau nhỏ bào tử với nồng độ 4.104 bào tử/ml. Lây nhiễm xong khay nhựa chứa lây nhiễm ủ 180C ngày sau đánh giá vết bệnh. Diện tích vết bệnh < 1,0 cm2 kháng cao (HR) Diện tích vết bệnh từ 1,1-2,5 cm2 kháng R Diện tích vết bệnh 2,51-6,0 cm2 nhiễm vừa (M) Diện tích vết bệnh > 6,0 cm2 nhiễm nặng (S) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 Qua lây nhiễm nhân tạo nhận thấy tất mẫu giống chứa gen kháng R1 R3a kháng hoàn toàn isolate bệnh. Điều khẳng định lại lần gen kháng R1 R3a kháng tốt chủng nấm gây bệnh châu nói chung Việt Nam nói riêng. Một số giống không chứa gen kháng tốt như: PI 458395, PI 320315, PI 161172, PI160215, PI472759, PI186535, PI279276, PI275235, PI225673, PI473228, PI472823, PI498110, PI281112 . có lẽ mẫu giống chúng chứa gen khác R1 R3a. Qua lây nhiễm khẳng định isolate lây nhiễm isolate hoàn toàn khác phản ứng chúng mẫu giống khoai tây nghiên cứu khác nhau. Như lần khẳng định nấm bệnh gây bệnh sương mai cà chua khoai tây một. Trong nghiên cứu phân lập lây nhiễm isolate nên chưa đánh giá xác khả kháng gen R1 R3a . Muốn chọn tạo giống kháng bệnh sương mai cần có chương trình nghiên cứu cụ thể hơn. Thứ phải thu thập, phân lập xác định số lượng phân bố chủng bệnh. Thứ hai xác định gen kháng hữu hiệu chủng nấm có. Thứ ba sử dụng gen kháng để lai chọn tạo giống Giống nhiễm Giống kháng Giống nhiễm Hình 3.7. Lây nhiễm đánh giá nhân tạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận - Đã đánh giá đặc điểm nông sinh học 76 mẫu giống khoai tây nhận thấy chúng đa dạng phong phú. Đa dạng kiểu sinh trưởng, đa dạng thân, hình dạng lá, hoa, củ, màu sắc củ. Đây nguồn vật liệu vô quý để khai thác, lai tạo giống mới. Ban đầu đánh giá suất yếu tố cấu thành suất mẫu giống, qua chọn lọc 18 giống có tiềm năng suất cao. Đánh giá khả kháng, nhiễm bệnh đồng ruộng bệnh sương mai, đốm lá, bệnh héo xanh, bệnh héo vàng, bệnh ro virut gây ra, sâu xám. Nhìn chung giống phần lớn kháng loại sâu bệnh nói trên. - Ứng dụng thị phân tử ADN phát mẫu giống chứa gen R1 PI133713, PI320311, PI230557, PI133619 PI558139. mẫu giống chứa gen R3a PI175419, PI473234, PI234013, PI47307, PI320342, PI338621, PI279278. - Phân lập isolate nấm bệnh sương mai Bắc Giang Hải Dương ký hiệu SM1 SM2. Lây nhiễm isolate mẫu giống nghiên cứu nhận thấy tất mẫu giống chứa gen kháng R1 R3a kháng tốt với Isolate. Ngoài chọn mẫu giống không chứa gen kháng kháng tốt với isolate này, có lẽ chúng chứa gen kháng khác. 2. Đề nghị - Vì mẫu giống khoai tây trồng từ hạt nên đạt suất thực thu chưa cao nên cần thu củ để giống, trồng lại vụ sau để có kết luận xác suất thực thu. - Cần phải thu thập, phân lập xác định số lượng chủng bệnh sương mai miền Bắc Việt Nam từ sử dụng chúng để lây nhiễm nhân tạo để xác định gen kháng hữu hiệu bệnh này. - Sử dụng mẫu giống chứa gen kháng R1 R3a để lai tạo với giống chứa gen dựa vào đặc tính nở hoa từ tạo giống khoai tây F1 ưu lai hay giống khoai tây suất, kháng bệnh. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hồ Hữu An (2005). Cây có củ kỹ thuật thâm canh khoai tây. NXB Lao động xã hội. PGS.TS. Tạ Thu Cúc (2007) Giáo trình rau, Tr 141-169 Hà Viết Cường (2008). Bài giảng Miễn dịch học thực vật. Đỗ Kim Chung(2003). Thị trường khoai tây Việt Nam. NXB Văn hóa thông tin. Đường Hồng Dật (2005). Cây khoai tây kĩ thuật thâm canh tăng suất .Nhà xuất Lao động xã hội. Trương Văn Hộ , (1990). Những két nghiên cứu tiến kỹ thuật, NXB Hà Nội Mai Thạch Hoành ( 2003) . Giống kỹ thuật thâm canh có củ. Nhà xuất nông nghiệp. Tr 98-130 Vũ Triệu Mân, (1978). Bệnh virus hại khoai tây. NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội Vũ Triệu Mân, (1978) Một số nhận xét bệnh hại khoai tây, Báo cáo khoa học kỹ thuật NN1978, Trường ĐHHNN I Hà Nội. NXB khoa học kỹ thuật 1986. Vũ Hướng Văn (2007), Khoai tây đâu thực phẩm. http:// www.suckhoe360.com. Trương Quang Vinh (2007), Phân tích đa hình ADN ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật vào việc nhân giống khoai tây củ bi bệnh, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên. Phan Hữu Tôn (2004). Giáo trình công nghệ sinh học chọn tạo giống trồng. Nxb Nông nghiệp Nguyễn Quang Thạch, (1993). Một số biện pháp khắc phục thoái hóa giống khoai tây sonalinum tuberosu mowr Đồng Bằng Bắc Bộ. Luận án PTS KHNN trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Lý Anh, nguyễn Thị Phương Thảo (2005). Giáo trình công nghệ sinh học. NXB Nông nghiệp. Bộ NN PTNT (2011). chuẩn ngành QCVN 01-59 : 2011/BNNPTNT. Tiếng anh Ballvora, A., Ercolano, M. R., Weiss, J., Meksem, K., Bormann, C. A., Oberhagemann, P., Salamini, F., and Gebhardt, C. (2002). The R1 gene for potato resistance to late blight (Phytophthora infestans) belongs to the leu-cine zipper/NBS/LRR class of plant resistance genes. Plant J. 30:361-371 Berckx R. (1967), Methodische untersuchungen uber den serologischen nachweis pflanzenpathogener viren mit dem bentonitflockungstest, den latex- text und dem bariumsulfat test, Phytopathologische Zeitschrift, 58, 1-17. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 Beukema,H.P. and D.E VanderZaag.(1990), Introductionto potato production. Pudoc Wageningen, 208. Bradshaw, J., Bryan, G., Lees, A., McLean, K., and Solomon-Blackburn, R. (2006). Mapping the R10 and R11 genes for resistance to late blight (Phytophthora infestans) present in the potato (Solanum tuberosum) R- gene differentials of Black. Theor. Appl. Genet. 112:744-751. Collins, A., Milbourne, D., Ramsay, L., Meyer, R., Chatot-Balandras, C., Oberhagemann, P., de Jong, W., Gebhardt, C., Bonnel, E., and Waugh, R. (1999). QTL for field resistance to late blight in potato are strongly correlated with maturity and vigour. Mol. Breed. 5:387-398 DucreuxG.RossignolL.etM.(1989), Laprotectiondelapommedeterre”,Journeessd’informatin, Paris, pp.7–8. Ellis P., Stace-Smith R., Bowler G., Mackenzie D.J. (1996), Production of monoclonal antibodies for detection and identification of strains of potato virus Y. Plant Pathol, 18, 64-70. Ewing, E. E., Simko, I., Smart, C. D., Bonierbale, M. W., Mizubuti, E. S.G., May, G. D., and Fry, W. E. (2000). Genetic mapping from field tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanum berthaultii. Mol. Breed. 6:25-36 Gebhardt, C., and Valkonen, J. P. (2001). Organization of genes controlling disease resistance in the potato genome. Annu. Rev. Phytopathol. 39:79-102 Gugerli P., Fries P. (1983), Characterization of monoclonal antibodies to potato virus Y and their use for virus detection, J. Gen. Virol, 64, 2471-2477. Gardner, R. G., and Panthee, D. R. (2010). ‘Plum Regal’ fresh-market plum tomato hybrid and its parents, NC 25P and NC 30P. HortScience 45:824-825 Hein, I., Birch, P., Danan, S., Lefebvre, V., Achieng Odeny, D., Gebhardt, C., Trognitz, F., and Bryan, G. (2009). Progress in mapping and cloning qualitative and quantitative resistance against Phytophthora infestans in potato and its wild relatives. Potato Res. 52:215-227. Hinrich J., Berger S., Shaw J.G.(1998): A hypersensitive response-like mechanism is involved in resistance of potato plants bearing the Rysto gene to the potyviruses potato virus Yand tobacco etch virus. Journal of General Virology:167-176. Huang, S., Vleeshouwers, V. G. A. A., Werij, J. S., Hutten, R. C. B., van Eck, H. J., Visser, R. G. F., and Jacobsen, E. (2004). The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closely linked R genes with distinct specificities. Mol. Plant-Microbe Interact. 17:428-435 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 76 Kerlan C (2008), Potato Viruses, @ 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved. Macdec P. (1963), "Tuber forming substances in the potato", The Growth of the potato, pp. 121- 130. Li, G., Huang, S., Guo, X., Li, Y., Yang, Y., Guo, Z., Kuang, H., Rietman, H., Bergervoet, M., Vleeshouwers, V., van der Vossen, E. A. G., Qu, D., Visser, R., Jacobsen, E., and Vossen, J. (2011). Cloning and characterization of R3b; Members of the R3 superfamily of late blight resistance genes show sequence and functional divergence. Mol. Plant-Microbe Interact. Lokossou, A. A., Rietman, H., Wang, M., Krenek, P., van der Schoot, H., Henken, B., Hoekstra, R., Vleeshouwers, V. G. A. A., van der Vossen, E. A. G., Visser, R. G. F., Jacobsen, E., and Vosman, B. 2010. Diversity, distribu- tion, and evolution of Solanum bulbocastanum late blight resistance genes. Mol. Plant-Microbe Interact. 23:1206-1216. Naess, S. K., Bradeen, J. M., Wielgus, S. M., Haberlach, G. T., McGrath, J. M., and Helgeson, J. P. (2001). Analysis of the introgression of Solanum bulbocastanum DNA into potato breeding lines. Mol. Genet. Genom. 265:694-704. Panthee, D. R., and Chen, F. (2010). Genomics of fungal disease resistance in tomato. Curr. Genom. 11:30-39. Park, T. H., Gros, J., Sikkema, A., Vleeshouwers, V. G. A. A., Muskens, M., Allefs, S., Jacobsen, E., Visser, R. G. F., and van der Vossen, E. A. G. 2005. The late blight resistance locus Rpi-blb3 from Solanum bulbocasta-num belongs to a major late blight R gene cluster on chromosome of po- tato. Mol. PlantMicrobe Interact. 18:722-729. Salaman, R.N.(1949), Somenotesonthehistoryofcurl, p.118–128. Smilde, W. D., Brigneti, G., Jagger, L., Perkins, S., and Jones, J. D. G. 2005. Solanum mochiquense chromosome IX carries a novel late blight re- sistance gene Rpi-moc1. Theor. Appl. Genet. 110:252-258. Simko, I., Costanzo, S., Ramanjulu, V., Christ, B. J., and Haynes, K. G. (2006). Mapping polygenes for tuber resistance to late blight in a diploid So- lanum phureja × S. stenotomum hybrid population. Plant Breed. 125:385-389 Śliwka, J., Jakuczun, H., Lebecka, R., Marczewski, W., Gebhardt, C., and ZimnochGuzowska, E. (2007). Tagging QTLs for late blight resistance and plant maturity from diploid wild relatives in a cultivated potato (Solanum tuberosum) background. Theor. Appl. Genet. 115:101-112 Śliwka, J., Jakuczyn, H., Kaminski, P., and Zimnoch-Guzowska, E. (2010). Markerassisted selection of diploid and tetraploid potatoes carrying Rpi- phu1, a major gene for resistance to Phytophthora infestans. J. Appl. Genet. 51:133-140. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 77 Sokolova, E., A. Pankin, M. Beketova, M. Kuznetsova, S. Spiglazova, E. Rogozina, I. Yashina, and E. Khavkin, 2011: SCAR markers of the R-genes and germplasm of wild Solanum species for breeding late blight-resistant potato cultivars. Plant Genet. Resour.9, 309—312 Song, J., Bradeen, J. M., Naess, S. K., Raasch, J. A., Wielgus, S. M., Haberlach, G. T., Liu, J., Kuang, H., Austin-Phillips, S., Buell, C. R., Hel- geson, J. P., and Jiang, J. (2003). Gene RB cloned from Solanum bulbocasta- num confers broad spectrum resistance to potato late blight. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:9128-9133 Umaerus, V., and Umaerus, M. (1994). Inheritance of resistance to late blight. In: Potato Genetics. Van der Zaag, D.E. (1976), “Potato production and utilization in the world”, Am. J. PotatoRes.19,pp.37 – 72. Van der Vossen, E. A. G., Gros, J., Sikkema, A., Muskens, M., Wouters, D., Wolters, P., Pereira, A., and Allefs, S. (2005). The Rpi-blb2 gene from Solanum bulbocastanum is an Mi-1 gene homolog conferring broad-spectrum late blight resistance in potato. Plant J. 44:208-222. Van der Vossen, E., Sikkema, A., Hekkert, B.-t. L., Cros, J., Stevens, P., Muskens, M., Wouters, D., Pereira, A., Stiekema, W. J., and Allefs, S. (2003). An ancient R gene from the wild potato species Solanum bulbocastanum confers broad-spectrum resistance to Phytophthora infestans in cultivated potato and tomato. Plant J. 36:867-882 Vleeshouwers, V., Raffaele, S., Vossen, J., Champouret, N., Oliva, R., Segretin, M. E., Rietman, H., Cano, L. M., Lokossou, A., and Kessel, G. (2011). Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors. Annu. Rev. Phytopathol. 49:507-531. Visker, M. H. P. W., Heilersig, H. J. B., Kodde, L. P., Van de Weg, W. E., Voorrips, R. E., Struik, P. C., and Colon, L. T. 2005. Genetic linkage of QTLs for late blight resistance and foliage maturity type in six related po-tato progenies. Euphytica 143:189-199 Vivianne G.A.A. Vleeshouwers, Sylvain Raffaele, Jack H. Vossen, Nicolas Champouret, Ricardo Oliva, Maria E. Segretin, Hendrik Rietman, Liliana M. Cano, Anoma Lokossou, Geert Kessel, Mathieu A. Pel, and Sophien Kamoun: Understanding and Exploiting Late Blight Resistance in the Age of Effectors. Annu. Rev. Phytopathol. 2011. 49:507–31 Wang, M., Allefs, S., van den Burg, R. G., Vleeshouwers, V. G. A. A., Van der Vossen, E. A. G., and Vosman, B. (2008). Allele mining in Solanum: Conserved homologues of Rpi-blb1 are identified in Solanum stolo- niferum. Theor. Appl. Genet. 116:933-943. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 78 Wenzel et al (1979). Comparion of single cell culture derived Solanum tuberosum.L. Plants and model of their application in breeding programs Walkey D.G.A., Webb M.J.W. (1984), The use of a simple electron microscope serology procedure to observe relationships of seven potyviruses, Phytopathologische Zeitschrift, 110, 319-327. http://ec.europa.eu/agriculture/fruit-and-vegetables/product-reports/potatoes/expertgroup/potatoes-2012-12_en.pdf https://www.academia.edu/1497480/Plant_disease_resistance_genes_Current_status _and_future_directions http://faostat.fao.org/ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 79 [...]... đoàn các mẫu giống khoai tây rất đa dạng và phong phú Để khai thác được nguồn gen này phục vụ công tác lai tạo giống kháng bệnh sương mai chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Khảo sát chọn giống khoai tây kháng bệnh sương mai bằng chỉ thị phân tử DNA 2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2.1 Mục tiêu Đánh giá được đặc điểm nông sinh học của các giống khoai tây từ đó chọn được các giống khoai tây cho năng... chỉ thị phân tử ADN nào lý tưởng, đạt được đầy đủ những yêu cầu này; tùy từng mục đích nghiên cứu mà người ta sử dụng hệ thống các chỉ thị phân tử ADN thỏa mãn một số điều kiện chính 1.5.2 Chỉ thị phân tử và chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai Trong số các biện pháp phòng trừ tác hại ảnh hưởng của bệnh sương mai thì việc sử dụng các giống kháng ngày càng được quan tâm nhiều hơn Việc lựa chọn. .. tốt; Phát hiện được các giống khoai tây chứa gen kháng bệnh sương mai R1 và R3a 2.2 Yêu cầu Đánh giá được đặc điểm nông sinh học và khả năng kháng sâu bệnh Phân lập các mẫu nấm sương mai (Phytophthora infestans) trên khoai tây Đánh giá khả năng kháng nhiễm của các mẫu giống trên đồng ruộng Dùng chỉ thị phân tử DNA phát hiện được các gen kháng R1, R3a trong các mẫu giống khoai tây Học viện Nông nghiệp... thống các marker phân tử DNA liên kết với các gen kháng đã được phát triển và hỗ trợ đắc lực cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai Các chỉ thị phân tử DNA dựa trên PCR cho gen R1 là R1F/R(76-2sf2/76-2SR)), gen R3a là R3-1380 đã được nhiều nhà chọn giống trên thế giới sử dụng để phát hiện và chọn lọc giống khoai tây kháng bệnh sương mai Trong những năm gần đây, Trung tâm Bảo tồn... thức tiếp cận - nghiên cứu sinh học phân tử, và là cơ sở nền tảng ra đời cho thế hệ chỉ thị phân tử tiếp theo Sau này, nhiều chỉ thị phân tử ADN đã được phát triển và ứng dụng trong nghiên cứu nói chung như RAPD, SSR, AFLP như đã nêu ở trên Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chỉ thị tử để phát hiện gen kháng bệnh sương mai, đó là chỉ thị SSR Một chỉ thị phân tử ADN đạt tiêu chuẩn cần có những yêu... Màu sắc của mầm khác nhau phụ thuộc vào từng giống có thể màu trắng hoặc màu tím, khi gặp ánh sáng mầm có màu xanh Hình 1.1 Cây khoai tây 1 Củ khoai tây 3 Hoa khoai tây 2 Lá khoai tây 4 Rễ khoai tây 5 Thân khoai tây 1.1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây • Nhiệt độ Nhiệt độ trong vụ trồng khoai tây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng phân bố, thời vụ gieo trồng, quá trình sinh... dựng và đưa ra một hệ thống sản xuất giống khoai tây hoàn toàn sạch bệnh Để chủ động khắc phục tình trạng nhiễm virus trên khoai tây năm 2010 Viện sinh học nông nghiệp đã tạo ra dòng khoai tây mới bằng phương pháp protoplast, dòng mới đã được trồng thử nghiệm và cho kết quả rất tốt 1.4 Bệnh mốc sương trên cây khoai tây 1.4.1 Lịch sử phát hiện Bệnh mốc sương khoai tây lần đầu tiên ghi nhận tại Mêxicô... nhiễm bệnh, ở mức độ nặng nhẹ khác nhau Mức độ bệnh còn phụ thuộc vào mùa vụ Mùa mưa (từ tháng 4-5 đến tháng 9-10) bệnh gây hại nặng và ảnh hưởng lớn đến năng suất, vào mùa khô mức độ bệnh giảm đi rõ rệt 1.5 Chỉ thị phân tử và những ứng dụng 1.5.1 Khái niệm về chỉ thị phân tử Một đoạn DNA được sử dụng để phân biệt sự khác nhau về kiểu hình giữa các cá thể, dòng, giống và giữa các loài được gọi là chỉ thị. .. chọn gen kháng hoặc yếu tố kháng căn cứ vào nhiều yếu tố, quan trọng nhất là mức độ đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh, đặc tính gây bệnh và tính độc của quần thể tác nhân gây bệnh, đặc biệt là của các chủng, nòi chiếm ưu thế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm hơn đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử phát... gen kháng sương mai Các nhà khoa học đã tìm được vị trí các gen được định vị trên từng nhiễm sắc thể, cũng như các chỉ thị phân tử DNA liên kết với các gen đó, tạo ra các bản đồ di truyền liên kết gen Dựa vào các chỉ thị này, chúng ta có thể phát hiện được sự có mặt của một gen bất kỳ, nếu biết được một hoặc nhiều chỉ thị liên kết chặt với gen đó Có ít nhất 11 gen kháng bệnh mốc sương thuộc loại gen kháng . gây bệnh 13 1.4.5 Điều kiện phát sinh phát triển 15 1.5 Chỉ thị phân tử và những ứng dụng 16 1.5.1 Khái niệm về chỉ thị phân tử 16 1.5.2 Chỉ thị phân tử và chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh. HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  LÂM MAI TÙNG KHẢO SÁT CHỌN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ. HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  LÂM MAI TÙNG KHẢO SÁT CHỌN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM