BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ợ c HÀ NỘI NGUYỄN HUY THANH NÂNG CAO HIỆU SUẤT CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG CHUYỂN HOÁ XYLOSE THÀNH XYLITOL ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999-2004) Giáo viên hướng dẫn: TS. Vũ Nguyên Thành CN. Nguyễn Lệ Phi Nơi thực hiện: Bộ môn vi sinh Viện công nghiệp thực phẩm Bộ môn vi sinh trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI, THÁNG 5-2004 âĩ i N ' X ă r - / Kìlị LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: -TS. Vũ Nguyễn Thành -CN. Nguyễn Lệ Phi Là thầy cô giáo tận tịnh hướng dẫn giúp đỡ trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Dương Anh Tuấn, CN. Đỗ Ngọc Quang cho kinh nghiệm quý báu công việc Tôi xỉn cảm ơn cán - Bộ môn vi sinh Viện Công nghiệp Thực phẩm, thầy cô giáo - Bộ môn vi sinh Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện tốt cho hoàn thành đê tài Cuối cho gửi lòi cảm ơn đến người thân, bạn bè động viên giúp đỡ thời gian qua Hà Nội, tháng năm 2004 Sinh viên Nguyễn Huy Thanh MỤC LỤC Đặt vấn đề Phần I. Tổng quan . . 1.1 Một vài nét Hemicellulose xylose 1.1.1 Hemicellulose 1.1.2 Xylose . 1.2 Xylitol . 12.1. Nguồn gốc, công thức cấu tạo . 1.2.2 Trạng thái tự nhiên . 1. 1.3 Tầm quan trọng Xylitol . 1. 1.4 Tình hình sản xuất xylitol . 10 Phần n. Thực nghiệm kết .16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị phương pháp nghiên cún . 16 2.1.1. Nguyên vật liệu . 16 2.1.2 Máy móc- thiết b ị 16 2.1.3 Một số môi trường sử dụng nghiên cứu . 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu .18 2.2.1. Phương pháp quan sát hình thái tế bào .18 2.2.2. Phương pháp định lượng xylitol . 18 2.2.3 Phương pháp lựa chọn chủng giống 20 2.2.5 Phương pháp chọn chủng chịu nồng độ dịch thuỷ phân cao 21 2.2.6 Phương pháp nghiên cứu điều kiện lên men . 21 2.3. Kết bàn luận .22 2.3.1 Quan sát hình thái tế bào . 22 2.3.2 Định lượng xylitol phương pháp enzyme 24 2.3.3. Tìm số điều kiện len men xylitol thích hợp . 30 Phần m. Kết luận đề xuất 37 Tài liệu tham khảo 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, với phát triển đời sống vật chất xã hội người gia tăng số bệnh như: bệnh đái tháo đường, bệnh tim mạch số bệnh trẻ em .Vì việc tìm kiếm hoạt chất để phục vụ nâng cao sức khoẻ cho người đươc đầu tư nghiên cứu với quy mô lớn. Vào năm 1891, nhà hoá học người Đức Emil Fisher người phát xylitol loại hoa quả. Ban đầu công dụng chủ yếu xylitol chất làm thay đường. Sau chiến tranh giới lần thứ II xylitol biết đến hoạt chất dùng để cải thiện rối loạn glucid bệnh nhân đái tháo đường, làm giảm tỷ lệ sâu trẻ em, làm chất ngọt, bổ dưỡng đưa vào sản phẩm công nghiệp thực phẩm đồ uống. Có nhiều phương pháp để sản xuất xylitol đường tổng hợp hóa học tìm phương pháp chủ yếu giới. Nhưng trình sản xuất bao gồm nhiều công đoạn phức tạp giá thành sản phẩm cao. Trong hoàn cảnh đó, việc tìm phương pháp sản xuất đơn giản hiệu cần thiết. Phương pháp lên men xylitol từ xylose nhờ vi sinh vật phương pháp hứa hẹn nhiều tiềm thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu. Với mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu chất thải nông nghiệp (rơm, bã mía, lõi ngô .) để phục vụ cho sản xuất xylitol góp phần tìm phương pháp sản xuất xylitol đường lên men nhờ vi sinh vật, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nâng cao hiệu suất chủng nấm men có khả chuyến hóa xylose thành xylitol" với mục tiêu: > Phát triển phương pháp xác định xylitol dựa phản ứng enzyme > Tìm điều kiện lên men thích hợp để sản xuất xylitol Phần I TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét Hemicellulose xylose 1.1.1 Hemỉcellulose Hemicellulose hỗn hợp gồm polysaccharid có nhiều trong thân cây. Bảng hàm lượng hemicellulose loại cây: Bảngl: Hàm lượng hemicellulose số nguyên liệu điển hình Loại Hemicellulose Cellulose (% tổng số) % tổng số Thân ngô khô 39-41 30 43 Cỏ khô 36-41 32 45 Cây gỗ ngắn ngày 34-46 34 33 Sợi gỗ Sericea ỉespeedeza 18 34-42 %carbonhydrat 34 Quá trình thuỷ phân hemicellulose tạo đường hexose pentose: mannose, galactose, xylose arabinose.Các hợp chất khác, mà chủ yếu acid acetic tạo trình thuỷ phân có khả ức chế trình phát triển vi sinh vật. Các sản phẩm phụ bao gồm chủ yếu lignin. Hàm lượng đường tạo trình thủy phân hemicellulose phụ thuộc vào nguyên liệu, điều kiện phát triển bảo quản nguyên liệu. Bảng trình bày thành phần hemicellulose nguyên liệu điển hình. Bảng 2: Thành phần Hemicellulose sinh khối (% trọng lượng) Thành phần Hemicellulose (%) Loai Galactan Thân ngô khô cỏkhô (Switchgass) Sericea lespedeza Cây gỗ ngắn ngày Sợi ngô Xylan Arabinan Mannan , 19-23 1,8-3,4 ,3 -0 ,7 , -2 ,0 -3 ,4 , -1 ,3 - 2,0 - 2,5 -1 ,4 - , , , ,7 - , 3,8 25 18 , , , - , ,9 - 1,3 NR Chú thích : NR - K lông công bố Hemicellulose nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm. Việc tận dụng nguồn nguyên liệu mang đến ý nghĩa mặt kinh tế môi trường. 1.1.2 Xylose Xylose đường pentose có công thức sau: yHO H— ý — OH HO— c — H H — j: — OH CH2OH Xylose biến đổi thành xylitol hai cách: + Khử hoá nhờ xũc tác raney nikel. + Trong tế bào vi sinh vật xylose bị khử thành xylitol nhờ enzyme xylose reductase với coenzyme NADH NADPH. 1.2 Xylitol 2.1. Nguồn gốc, công thức cấu tạo Xylitol polyol có carbon. Công thức cấu tạo sau: c h 2o h H— ỳ — OH HO— c — H „ H— Ĩ c — OH CH2OH Công thức phân tử: C H] 05. Khối lượng phân tử: 152,15. Nguồn 2ốc\ r I I Xylitol có nguồn gốc tự nhiên, có mặt với lượng nhỏ số hoa va rau xanh (Bảng 3), tạo thể với hàm lượng thấp. Bảng 3: Hàm lượng xylitol số loại rau Rau, Xylitol (mg/lOOg sản phẩm khô) Chuối 21 Mâm xôi 268 Dâu tây 362 Mận 935 Cà rốt 865 Rau diếp quăn 258 Xà lách 131 Cải hoa 3000 Bí ngô 96,5 Su hào 94 Cà 180 Tỏi tây 53 Nấm trắng 128 1.2.2 Trạng thái tự nhiên tính chất hóa lý **** Trạng thái tự nhiên Xylitol chất bột kết tinh, màu trắng, không mùi, có vị đường. Thu nhiệt tan nước nên tạo cảm giác mát cho người sử dụng. ♦♦♦ Tính chất lý hóa [ ] Tính chất lý hoá Xylitol nêu Bảng 4: Bảng :Một số tính chất lý hoá xylitol Tính chất Xylitol Độ tan (ở 20°C) 169 g/lOOg H20 pH nước (lg/100 ml). -7 Nhiệt độ sôi (ở atm) 216°c Nhiệt độ nóng chảy 92°c đến 96°c Độ nhớt 20°c Dung dịch 10% 1,23 cP Dung dịch 40% 4,18 cP Dung dịch 50% 8,04 cP Dung dịch 60% 20,63 cP Nhiệt tan -34.8 cal/g Giá trị calo 4.06 cal/g 1. 2.3 Tầm quan trọng Xylitol ♦> Trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm Xylitol đường polyol gồm năm carbon có vị ngọt. Giá trị calo mà xylitol cung cấp thấp so với saccharose tương đương với glucose. Không thế, xylitol tạo cảm giác mát lạnh miệng có đặc điểm thu nhiệt hoà tan. Đặc tính làm xylitol hấp dẫn số sản phẩm thực phẩm, đặc biêt đồ uống. Vì xylitol sử dụng để thay glucose saccharose loại kẹo, socola, đồ uống mát, đồ uống bổ dưỡng, thuốc ho, kem đánh răng, kẹo cao su .Đặc biệt, xylitol có hàm lượng lượng thấp nên dùng để thay loài đường khác chế độ dinh dưỡng bệnh nhân mắc bệnh béo phì. Trong ngành mỹ phẩm, xylitol có tính chất giữ ẩm cho da mà không làm hại đến da, xylitol đưa vào kem dưỡng da, kem chống nắng, sữa rửa mặt . ♦♦* Trong ngành Y- Dược Trong năm gần xylitol ngày nghiên cứu ứng dụng rộng rãi ngành Y, Dược. Hiện nay, xylitol sử dụng điều trị số bệnh như: bệnh sâu răng, bệnh đái tháo đường, bệnh viêm tai trẻ em Xy/ữo/ với bênh sâu bênh rang miêns: Xylitol có tác dụng trực tiếp lên vi khuẩn gây sâu răng, chủ yếu Streptococcus mutants. Thông thường vi khuẩn sử dụng lượng đường tiết trình tiêu hoá thức ăn miệng thể. Chúng sử dụng lượng đường để sinh trưởng, phát triển. Quá trình đồng hoá nguồn đường chúng tạo sản phẩm phụ acid (đặc biệt acid lactic) , acid tiết môi trường ngoại bào. Chính môi trường acid lại tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển s. mutants vi sinh vật gây sâu khác. Đồng thời, acid tiết yếu tố gây sâu răng, acid tạo phức chelate hoà tan canxi phospho cấu thành men răng, phá huỷ liên kết phân tử chúng tạo lỗ hổng ăn sâu vào răng. Thông thường, sử dụng florua để khắc phục tượng này, ĩlorua có tác dụng việc bảo vệ chống acid lại tác dụng đến chất trình gây sâu răng, vi khuẩn. Xylitol tác dụng đến trình theo cách khác với ílorua, xylitol làm thay đổi khu hệ vi sinh vật miệng theo hướng trì vi sinh vật hại cho răng. s. mutants hấp thụ xylitol vào tế bào lại khả đồng hoá xylitol chúng không lấy lượng với việc pH môi trường không thay đổi theo hướng acid hoá nên sinh vật khả phân chia. Ngược lại vi sinh vật hại lại gặp điều kiện thuận lợi chúng bắt đầu phân chia. Mặc tổng số dù vi sinh vật miệng không thay đổi khu hệ vi sinh vật miệng thay đổi theo hướng hại cho theo cách xylitol giúp ngăn ngừa sâu răng. Những ngiên cứu gần thấy xylitol làm giảm tỷ lệ mắc bệnh sâu tới 83%. Trong saccharose tác dụng này. Từ kết nghiên cứu trên, người ta đưa xylitol vào sản phẩm để phòng chống sâu bệnh miệng như: kem đánh răng, kẹo cao su, nước súc miệng . Xvỉitoỉ với bênh đái tháo đường [41 Xylitol chất trung gian bình thường chuyển hóa glucid chuyển hóa thể qua đường pentose acid uronic. Lượng xylitol từ bên đưa vào thể chuyển hóa không phụ thuộc vào insulin không làm tăng lượng đường máu, xylitol có hiệu lực cung cấp lượng cho thể kể trường hợp rối loạn chuyển hóa glucid. Ngoài ra, xylitol có tác dụng chống gây ceton huyết mạnh. Do xylitol dùng làm chất làm thực phẩm cho người mắc bệnh đái tháo đường. Không thế, xylitol cải thiện rối loạn chuyển hóa glucid cung cấp lượng cho thể. o ọ /N ° l,s 'i o o _ ìo 0Ọ o (9 03 o{ r> o o > 0-0 V.' / í? Q O SJ "3 /r \ ề o Hình 2. Hình thái số nấm men sử dụng đề tài. 2g, 2h NRRLY 12968; 2i , 2k - NRRLY 17677; 2m , 2n - KFP 252. Thanh chèn hình g, i, m tương ứng với 10 HIĨ1 , chèn hình h, k, n tương ứng với ịom. 23 2.3.2 Định lượng xylitol phương pháp enzyme Tách enzvme từ chủng Candịda tromcalis N R R L Y 12968 Chủng Candida tropicalis NRRLY 12968 nuôi cấy môi trường III 28°c tốc độ lắc 130 vòng/phút 48 giờ. Tế bào lấy cách ly tâm 10000 vòng/phút 15 phút. Rửa lần nước cất, rửa tiếp hai lần đệm kali phosphat 0,5 M (pH = 7,5). Sau phá vỡ tế bào cát vô trùng (đã xử lý acid kiềm) 4°c. Ly tâm dịch máy ly tâm 15000 vòng/phút 15 phút 4°c. Phần dịch sau phã vỡ tế bào sử dụng làm enzyme để định lượng xylitol. Enzym bảo quản dung dịch Glycerol 20% giữ -20 °c. Xác định nồng đô enzvme: Để sử dụng enzyme thu cho việc định lượng xylitol, trước tiên phải xác định nồng độ enzyme thích hợp. Các nồng độ enzyme khác thử nghiệm, thành phần phản ứng enzyme sử dụng sau: NAD (11,2 mg/ml) 10 ụ.\ PMS (1 mM) 20 JUÌ INT (lmM) 20 JUÌ Dung dịch 0.05% xylitol /Ll\ Enzyme nồng độ khác Nước cất vô trùng: vừa đủ 250 ỊJ. (Trong thí nghiệm đối chứng sử dụng nước cất vô trùng thay cho dung dịch xylitol). Sau cho đầy đủ thành phần phản ứng, hỗn hợp phản ứng ủ bóng tối nhiệt độ phòng, đọc kết sau 30 phút. Kết thu được trình bày bảng sau: 24 Bảng 6. Thí nghiệm xác định nồng độ enzyme. Lượng enzyme ( JU 1) Mầu Đối chứng +++ ++ ++ + + 0,5 Giếng , - - - - - Chú thích: + Phản ứng dương tính, tạo sản phẩm mầu đỏ - Phản ứng âm tính, mầu Từ số liệu ta thấy, thân dung dịch enzyme có chứa lượng định NADH nên cho vào dung dịch phản ứng chúng tác dụng với INT PMS để tạo thành sản phẩm formazan có mầu đỏ. Việc tạo mầu gây ảnh hưởng đến kết quả. Do nồng độ enzyme thích hơp chọn nồng độ enzyme không tạo mầu phản ứng đối chứng. Ở đây, chọn nồng độ enzyme thích hợp ju\ cho phản ứng với dung tích 250 ụ . Thiết lây đường, cong chuẩn: Để xác định hàm lượng xylitol mẫu, tiến hành nghiên cứu tìm điều kiện nồng độ xylitol phù hợp để thiết lập đường chuẩn. Phản úng tiến hành đĩa microtiter plate có thành phần trình bày (mục tìm nồng độ enzyme thích hợp). Phản ứng để bóng tối nhiệt độ phòng, sau khoảng thời gian định, đĩa microtiterplate đem đo OD bước sóng 620 nm. Trong thí nghiệm này, nồng độ xylitol khác thử nghiệm, kết thu được trình bày bảng hình 25 Bảng 7. Độ hấp thụ ánh sáng dung dịch xylitol chuẩn STT Độ hấp phụ Nồng độ xylitol (%) 15 phút 30 phút 45 phút 60 phút 0,071 , 0,063 0,068 0,070 , 0,074 0,085 0,094 Std , Std 0,030 0,095 Std 0,040 Std Std Std , 0,127 0,142 0,132 0,157 0,178 0,103 0,159 0,195 0,050 0,117 0,186 0,226 0,258 Std 0,060 0,129 0,208 0,251 0,285 Std 0,070 0,156 0,248 0,295 0,327 Std 0,080 0,166 0,267 0,319 0,347 Std 10 0,090 0,182 0,288 0,336 0,365 Std 11 0,187 0,300 0,346 0,374 Std 12 0,125 0,218 0,333 0,370 0,395 Std 13 0,150 0,241 0,357 0,397 0,414 Std 14 0,175 0,248 0,365 0,396 0,411 Std 15 0,279 0,390 0,418 0,432 Std 16 0,250 0,310 0,400 0,420 0,427 Std 17 0,300 0,330 0,414 0,430 0,438 Std 18 0,350 0,352 0,423 0,433 0,439 Std 19 0,400 0,367 0,427 0,434 0,440 Std 20 0,500 0,392 0,429 0,436 0,443 , , 0,084 26 , , 0.5 0.45 ♦♦ 0.4 0.35 0.3 ♦♦ írì 0.25 ♦ ♦ - 0.2 ♦ ♦ 0.15 ♦ ♦ 0.1 ♦ ♦ 0.05 ị► 0 0.2 a. b. 0.5 0.5 0.45 0.35 0.25 Ọ 0.2 0.15 0.1 0.35 ♦ Ẹ ♦ ♦ 0.3 ♦ ♦ ♦ c ©CN| 0.25 ♦ ♦ ♦ ừ) Q o ♦ ♦ ♦ 0.2 0.15 ♦ ♦ o ♦ ♦ ♦ ♦♦♦ ♦ 0.4 ậ♦ 0.3 §ìõ 0.45 ♦♦♦♦♦ 0.4 c 0.6 Nồng đ ộ xylitol (g/1) Nồng độ xy |ito1 £ 0.4 0.1 ♦ 0.05 0.05 ► 0.2 0.4 0.6 0.2 Nồng độ xylitol (g/1) 0.4 0.6 Nồng độ xylitol (g/I) c. d. Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ xylitol độ hấp thụ. a - sau 15 phút; b - sau 30 phút; c - sau 45 phút; d - sau 60 phút 27 Từ số liệu thu bảng hình thấy nồng độ xylitol phù hợp để có đường chuẩn tuyến tính từ 0.01% đến 0.07%. Thời gian phù hợp cho phản ứng từ 45 đến 60 phút. Khi đồ thị biểu diễn mối liên quan nồng độ xylitol độ hấp thụ thu tuyến tính trình bày hình 4. Standarđs Conc.(g/l) / A(Mean) 0.0 0.071 (Coeff. of Var.: 2.0%) 0.100 0.101 (Coeff. of Var.: 1.4%) 0.200 0.142 (Coeff. of Var.: 15% ) 0.300 0.178 (Coeff. of Var.: 12% ) 0.400 0.222 (Coeff. of Var.: 1.3%) 0.500 0.258 (Coeff. of Var.: 16% ) 0,600 0.285 (Coeff. of Var.: 0.2%) 0.700 0.327 (Coeff. of Var.: 0.2%) Concentration (g/1) slope = 0.4 Corr.Goeff.: 0.9981 Hình 4. Đường chuẩn phương pháp xác định xylitol enzyme Như để xây dựng đường chuẩn sử dụng nồng độ xylitol có nồng độ tương ứng 0,01%; 0,02%; 0,03%; 0,04%; 0,05%; 0,06%; 0,07%. Đô xác ỵhươrtg ỵhÓ2 Do enzyme dung dịch enzyme chưa tinh chế nên XDH có enzyme khác mà chuyển hóa chất chúng 28 có tham gia NAD+ nên gây ảnh hưởng đến kết thu được. Vì vậy, để kiểm tra độ xác tình hình nhiễm chéo phương pháp pha dung dịch xylitol, glucose, ethanol biết trước nồng độ sau định lượng phương pháp trên. Kết trình bày bảng . Bảng . Độ xác độ đặc hiệu phương pháp xác định xylitol nhờ phản ứng enzyme _____________________________________ Nồng độ xylitol tính Độ xác/Độ đặc Nồng độ (g/1) hiêu(%) theo phương pháp (g/l) 94 0,141 0.15 . 0,186 93 0.3 0,292 97,3 0.5 0,469 93,8 xylitol glucose . 0.5 0,14 0.5 ethanol 15 0,3 Qua số liệu trình bày bảng 14 đến kết luận: + Phương pháp xác định xylitol enzyme mà xây dựng thay phương pháp HPLC với độ xác cao. Sử dụng phương pháp chon tiến hành chọn lọc chủng nấm men phân lập chọn 1 chủng có khả chuyển hóa xylose thành xylitol với hiệu suất cao (Xyl-2, Xyl-7, Xyl-14, Xyl-36, Xyl-37, Xyl-47, Xyl-52, Xyl-63, Xyl- 29 , Xyl-91, Xyl-94) + Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm chưa xác định xylitol có dịch lên men chủng nấm men nuôi cấy môi trường dịch thủy phân có phản ứng chéo với số chất khác (glucose, ethanol). Các vấn đề khắc phục nghiên cứu tiếp theo. 2.3.4. Tìm sô điều kiện lên men xylitol thích hợp Chon chủng siốns nồng đô đường khử môi trường lên men Trong thành phần dịch thủy phân xylose đường khử khác có sản phẩm phụ tạo trình thủy phân acid acetic, fufural .Các sản phẩm phụ có khả ức chế trình sinh trưởng nấm men. Thực tế chủng sưu tập giống khả phật triển môi trường có nồng độ đường khử dịch thủy phân cao 10 %. Trong lên men, việc chủng giống có khả lên men nồng độ đường cao thuận lợi lớn cho việc giảm chi phí chống tạp nhiễm . Do tiến hành thí nghiệm lựa chọn chủng giống cách thích nghi chủng có môi trường có nồng độ dịch thủy phân tăng từ thấp đến cao. Trong thí nghiệm này, sử dụng chủng NRRLY 12968, NRRLY 17677, KFP 222, KFP 252, KFP 177 KFP 214 lấy từ sưu tập giống Viện Công nghịêp Thực phẩm. Các chủng nhân giống môi trường nhân giống cấp 24h sau chuyển vào môi trường lên men có chứa 5% đường khử. Nuôi cấy lắc ống nghiệm nhiệt độ 28°c, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Sau ngày lấy dịch lên men soi kính hiển vi để xem xét khả mọc nấm men. Sau chuyển 0.1 ml dịch lên men vào 3ml môi trường có chứa 7.5% đường khử. Làm tiếp với nồng độ 10%, 12.5%. 15%, 17.5% 20%. Kết trình bày bảng 9. Bảng 9. Khả phát triển chủng nấm men nồng độ đường khác KFP NRRLY NRRLY KFP KFP KFP Nồngđộ 252 17677 12968 214 177 đường +++ +++ +++ +++ +++ 5% 44+ +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++- ++- ++ +++ ++- +++ +- ++ +++ +- +++- +- ++- +++- 7.5% +++ +++ +++ % +++ +++ ++ 12.5% +++ +++ ++- 15% +++ +++ 17.5% +++ +++- % +++ - Chú thích: (+++)mọc tốt. (++ )có mọc. ( +++) mọc tốt có tượng chết (++-).có mọc có tượng chết( +-) mọc chết nhiều ( - ) không mọc Sau thời gian nuôi cấy chọn chủng chịu nồng độ đường dịch thủy phân lên tới 15% đến 20%, đặc biệt chủng NRRLY 12968, NRRLY 17677 KFP 252 có khả mọc tốt cả. Đa số chủng ban đầu khả mọc môi trường có nồng độ đường khử lớn 10%. Các chủng chọn được bảo quản môi trường chứa nồng độ dịch thủy phân tương đương đồng thời giữ lạnh sâu để sử dụng thí nghiệm lên men sau này. Xác định thời gian lên men thích hơp: Trong thí nghiệm chọn chủng nấm men NRRLY 12968, NRRLY 17677 KFP 252 thích nghi thí nghiệm để lên men. Các chủng nấm men nhân giống môi trường nhân giống cấp chuyển vào môi trường lên men có chứa 10% đường khử. Các chủng nuôi cấy 28 °c, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Hàng ngày lấy lml dịch lên men cho vào ống eppendorí sau ly tâm lấy dịch để xác định hàm lượng xylitol. Tế bào rửa nhiều lần nước cất sau đem đo 31 độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 620nm để xác định khả phát triển chủng này. Số liệu OD thu được trình bày bảng 10. Bảng 10. Tốc độ phát triển chủng nấm men theo thời gian 24 Chủng 48 72 96 144 23,06 24,40 25,20 15,84 10,04 NRRLY12968 24,94 25,72 19,24 22,90 24,90 NRRLY17677 9,88 20,07 24,02 8,04 14,22 18,34 KFP 252 8,52 Chú thích: Giá trị bảng độ hấp thụ ánh sáng bước song 620 nm. , E p cò Q c o 50 100 150 200 Thời gian NRRLY12968 NRRLY17677 KFP 252 Hình 5. Đồ thị sinh trưởng số chủng môi trường 10% đường khử theo thời gian Dịch lên men theo thời gian giữ -20°c xác định hàm lượng xylitol phương pháp sác ký lỏng hiệu cao HPLC. Kết thu được trình bày bảng 1 hình , 7, , 9. 32 Bảng 11. Nồng độ xylitol tạo thành theo thời gian Nồng độ xilytol(%) Chủng 72 24 NRRLY12968 . KFP 252 . 3.04 2.224 2.4 1.568 6.24 0.704 3.04 NRRLY17677 05/30/2004 11:06:14 AM C:\Tuan data\PHUsugar\Xylitol0,05% RT: 0.00-10.00 SM: 15G NL: 2.98E3 100-1 Base Peak F: {0,2} -c ESI corona sid det=1200.00 SIMms [ 150.75-151,25@100.00] MS ICIS Xylitol0,05% 90z 80 ~ Q> 70~- (ù 50— 40- 30^ 20 RT:5.10 RT: 5.53 0afl I r»Ịiin ố RT:7.03 RT:7.84 RT:8.62 T Time (min) Xylitol0,05% #1478 RT: 3.48 AV: NL: 3.23E3 F: {0,2} - c ESI corona sid det=1200.00 SIMms [ 150.75-151.25@100.00] 100 q 90“ 80“ 70: i 50- H 40 30i 20-Ẽ 10 ĩ 150.8 15085 50.9 150.90 150.95 151.00 m/z T ' 151.05 T 151.10 51.15 151.20 15-1.2 Hình . Sắc ký đồ HPLC dung dịch xylitol 0,05% chuẩn. Detector surveyor MSQ. 33 C:\Tuan data\PHUsugar\Xylose0,05% 05/30/2004 10:24:42 AM RT: .00-7.14 SM: 15B NL1.03E3 Base Peak F: {0,1}- c ESI corona sid det=1200.00 SIMms [ 148.75-149.25@100.00] MS ICIS Xylose0,05% Time (min) Xylose0,05% #1337 RT:3.15 AV: NL: 9.48E2 F: {0,1} - c ESI corona sid det=1200.00 SIM ms [ 148.75-149.25@100.00] 100-Ị1 9Q— _ 70- : 60f c < 50- > ro 0) z 02 3Ch (H 1[...]... độ và áp suất cao Xu thế hiện nay là thay thế phản ứng này bằng xúc tác sinh học Quá trình này đã được thử nghiệm thành công ở Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ, Phần Lan Rất nhiều loại nấm men có thể khử xylose thành xylitol với hiệu xuất khác nhau Chủng nấm men có khả năng chuyển hoá cao nhất hiện nay có thể đạt hiệu suất chuyển hoá là 80% và ở nồng độ 200g/l Phương pháp chuyển hoá xylose thành xylitol nhờ... phân ngoài xylose và các đường khử khác còn có các sản phẩm phụ được tạo ra trong quá trình thủy phân đó là acid acetic, fufural Các sản phẩm phụ này có khả năng ức chế quá trình sinh trưởng của nấm men Thực tế là các chủng trong bộ sưu tập giống không có khả năng phật triển trên môi trường có nồng độ đường khử trong dịch thủy phân cao hơn 10 % Trong lên men, việc chủng giống có khả năng lên men ở nồng... tổng hợp hóa học, xylitol được sản xuất từ nguyên liệu là xylose nhờ enzyme D - xylose reductase Trong tế bào vi sinh vật, quá trình chuyển hóa xylose thành xylitol diễn ra theo sơ đồ sau: N D+ xylitol AP 1 ND+ f A HH D-xylulose Chú thích: XR : D - xylose reductase Một số sinh vật có chứa enzyme D - xylose reductase nên có thể chuyển xylose thành xylitol như: các loại nấm sợi, một số nấm men: Candida... ethanol 0 15 0,3 2 Qua các số liệu trình bày ở bảng 14 8 chúng tôi đi đến kết luận: + Phương pháp xác định xylitol bằng enzyme mà chúng tôi xây dựng có thể thay thế phương pháp HPLC với độ chính xác cao Sử dụng phương pháp này chúng tôi đã chon tiến hành chọn lọc các chủng nấm men đã phân lập được và chọn được 1 1 chủng có khả năng chuyển hóa xylose thành xylitol với hiệu suất cao (Xyl-2, Xyl-7, Xyl-14,... (++-) .có mọc và có hiện tượng chết( +-) mọc nhưng chết nhiều ( - ) không mọc Sau một thời gian nuôi cấy chúng tôi đã chọn được các chủng chịu được nồng độ đường trong dịch thủy phân lên tới 15% đến 20%, trong đó đặc biệt là các chủng NRRLY 12968, NRRLY 17677 và KFP 252 có khả năng mọc tốt hơn cả Đa số các chủng này ban đầu không có khả năng mọc trên môi trường có nồng độ đường khử lớn hơn 10% Các chủng. .. còn có nhược điểm đó là chưa xác định được xylitol có trong dịch lên men của các chủng nấm men được nuôi cấy trên môi trường dịch thủy phân và vẫn có phản ứng chéo với một số chất khác (glucose, ethanol) Các vấn đề này sẽ được chúng tôi khắc phục trong các nghiên cứu tiếp theo 2.3.4 Tìm một sô điều kiện lên men xylitol thích hợp Chon chủng siốns và nồng đô đường khử trong môi trường lên men Trong thành. .. thời được giữ lạnh sâu để sử dụng các thí nghiệm lên men sau này Xác định thời gian lên men thích hơp: Trong thí nghiệm này chúng tôi đã chọn 3 chủng nấm men NRRLY 12968, NRRLY 17677 và KFP 252 đã được thích nghi ở thí nghiệm trên để lên men Các chủng nấm men được nhân giống trong môi trường nhân giống cấp 1 và được chuyển vào môi trường lên men có chứa 10% đường khử Các chủng được nuôi cấy ở 28 °c, tốc... Thực phẩm Các chủng được nhân giống trong môi trường nhân giống cấp 1 trong 24h sau đó được chuyển vào môi trường lên men có chứa 5% đường khử Nuôi cấy lắc trong ống nghiệm ở nhiệt độ 28°c, tốc độ lắc 150 vòng/phút Sau 5 ngày lấy dịch lên men soi trên kính hiển vi để xem xét khả năng mọc của nấm men Sau đó chuyển 0.1 ml dịch lên men vào 3ml môi trường có chứa 7.5% đường khử Làm tiếp như vậy với các nồng... Khi đó, năng suất mà xylitol đạt được là 0,74 g/g Tinh chếxỵỊữol từ dịch ịên men Để tinh chế xylitol từ dịch lên men có các phương pháp sau: dùng nhựa trao đổi ion, dùng than hoạt tính và phương pháp sắc ký cột ^ Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion Xylitol có ái lực cao với nhựa trao đổi cation và có ái lực kém với nhựa trao đổi anion Người ta dùng cả nhựa trao đổi cation và anion để tinh chế 14 xylitol. .. trao đổi ion thu được các phân đoạn xylose có độ tinh khiết cao Sản phẩm sau đó được hydro hoá với sự có mặt của xúc tác và một lần nữa được tinh khiết bằng sắc ký trao đổi ion để thu hồi xylitol Ngoài ra, xylitol còn có thể được sản xuất theo một số cách sau đây: + Sản xuất xylitol từ bã mía Viện nghiên cứu Đường Đài Loan đã nghiên cứu khả năng ứng dụng thương mại quá trình sản xuất xylitol từ bã mía . xuất xylitol bằng con đường lên men nhờ vi sinh vật, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Nâng cao hiệu suất các chủng nấm men có khả năng chuyến hóa xylose thành xylitol& quot; với các. nghiệm thành công ở Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ, Phần Lan. Rất nhiều loại nấm men có thể khử xylose thành xylitol với hiệu xuất khác nhau. Chủng nấm men có khả năng chuyển hoá cao nhất hiện nay có. NỘI NGUYỄN HUY THANH NÂNG CAO HIỆU SUẤT CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG CHUYỂN HOÁ XYLOSE THÀNH XYLITOL ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999-2004) Giáo viên hướng dẫn: TS. Vũ Nguyên Thành CN. Nguyễn