BỘYTẾ mưỜKG ĐAI HOC Dươc HÀ NỒI • • • • BÙI THỊ MAI SƯƠNG NGHIỄN cứu PHU0NG PHẤP BÂN TỔNG HỌP ARTESUNAT ■ (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ợ c SỸ KHOÁ 1999 - 2004) Người hướng dẫn PGS.TS. ĐỖ HỮU NGHỊ Nơi thực BỘ MÔN CÔNG NGHIỆP DƯỢC PHÒNG THÍ NGHIỆM GMP 2004 -15/05/2004 - Thời gian thực hiêỊỊ^ £>/ / íỳ v -f > Tĩiịr-VIỆNị* \v t ' . '77" Hà Nội, - 2004 LỜI CẢM ƠN Vói lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tớ i: PGS. T S . ĐỖ HỮU NGHỊ Thầy tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực nghiệm khoa học. Dưới hướng dẫn thầy, em học hỏi nhiều điều có ích không cho việc hoàn thành khoá luận mà cho công việc tương lai em. Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo Nguyễn Đình Luyện thầy cô giáo, kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em nhiều thời gian nghiên cứu thực nghiệm. Hà Nội, tháng năm 2004 Sinh viên: Bùi Thị Mai Sương MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỂ . PHẦN 1- TỔNG QUAN 1.1- Vài nét phát triển thuốcchống sốt ré t 1.2- Nguồn gốc, tính chất Artemisinin 1.2.1- Nguồn gốc . 1.2.2- Tính chất Artemisinin . 1.3- Đại cương Artesunat 1.3.1- Đặc điểm hoá học vật lý . 1.3.2- Tác dụng chế tác dụng . 1.3.3- Liên quan cấu trúc tác dụng .10 1.3.4- Dược động h ọc 10 1.3.5- Lâm sàng 11 1.3.6- Tương tác thuốc . 12 1.3.7- Độc tính . 12 1.3.8- Chế phẩm cách dùng artesunattrong điều trị .12 1.3.9- Các phương pháp định lượng artesunat 13 1.4- Bán tổng hợp artesunat 14 PHẦN 2-THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18 2.1- Nguyên vật liệu,thiết bị phương pháp thực nghiệm . 18 2.1.1- Nguyên liệu . 18 2.1.2- Thiết b ị 18 2.1.3- Phương pháp thực nghiệm . 19 2.2- Kết thực nghiệm nhận xét . 23 2.2.1- Khảo sát ảnh hưởng số xúc tác phản ứng bán tổng hợp Artesunat . 23 2.2.2- Khảo sát ảnh hưởng nồng độ xúc tác thời gian phản ứng chất lượng Artesunat 27 2.2.3- Ảnh hưởng dung môi đến tạo thành artesunat . 30 2.2.4- Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới phản ứng ester hóa . 34 2.3- Bàn luận . 36 2.3.1- Cơ chế phản ứng bán tổng hợp Artsunat ảnh hưởng chất xúc tá c .36 .3 .2 - Ảnh hưởng dung môi, tỷ lệ xúc tác, nhiệt độ thời gian phản ứng 36 2.3.3- Phổ hồng ngoại 38 PHẦN - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 39 3.1- Kết lu ận . 39 3.2- Đề xuất . 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT DHA Dihydroartemisinin 4-DMAP 4- Dimethylaminopyridin KST Ký sinh trùng HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao IR Phổ hồng ngoại P. Plasmodium p Tinh khiết pA Tinh khiết phân tích ĐẶT VÂN ĐỂ Việc đưa Artemisinin dẫn xuất vào sử dụng tiến lớn điều trị sốt rét. Các công trình nghiên cứu giới Việt Nam cho thấy nhóm artemisinin khỏi đầu tác dụng nhanh, diệt ký sinh trùng cắt sốt cổ hiệu quả. Nhóm thuốc WHO khuyến cáo sử dụng điều trị sốt rét, đặc biệt vùng có chủng p. falciparum kháng Chloroquin. Artesunat dẫn xuất Artemisinin dùng phổ biến nhiều điều trị sốt rét nước giới. Artesunat bán tổng hợp đưa vào sản xuất với quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, quy trình tổng hợp Artesunat sử dụng xúc tác pyridin, 4DMAP chất đắt tiền độc hại. Việc nghiên cứu tìm chất xúc tác góp phần hạ giá thành Artesunat đồng thời giảm độc hại cho trình sản xuất cần thiết. Natri bicarbonat natri carbonat chất kiềm yếu, sử dụng làm xúc tác cho phản ứng ester hóa DHA thành Artesunat. Trên sở đó, tiến hành đề tài “Nghiên cứu bán tổng hợp Artesunat” với mục tiêu : 1. Bán tổng hợp artesunat với xúc tác N aH C03và Na2C 3. 2. Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng hợp artesunat, từ tìm điều kiện phản ứng thích hợp để có hiệu suất cao. PHẦN - TỔNG QUAN 1.1- VÀI NÉT VỂ Sự PHÁT TRIỂN CỦA CÁC THUỐC CHỐNG SỐT RÉT Các vị thuốc chữa sốt rét cao hoa vàng, canh ki na sử dụng từ lâu đời, tới đầu kỷ XIX, nghiên cứu hoá học thuốc sốt rét thực bắt đầu. Năm 1834, Quinin người châu Âu phân lập sử dụng. Đây thuốc dùng trị sốt rét sớm dạng hoạt chất tinh khiết. Nó có tác dụng với thể phân liệt, tác dụng với thể giao bào độc. Năm 1926, Primaquin tổng hợp Đức. Dẫn xuất nhóm - Aminoquinolin có tác dụng diệt thể giao bào thể ngủ gan, dùng để điều trị tiệt căn, chống tái phát xa với p. vivax. Năm 1944, Chloroquin, dẫn xuất thuộc nhóm -Aminoquinolin tổng hợp. Đây thuốc chống sốt rét lý tưởng nhiều năm, vừa có tác dụng p.falciparum p.vivax, vừa dùng dự phòng lại độc thuốc chống sốt rét khác thời đó. Năm 1948, nhóm thuốc kháng folic đời, Proguanil Chloroguanin có tác dụng tốt độc quinin. Năm 1951, Pyrimethamin tổng hợp, có chế kháng folic độc hơn. Hiện nay, thuốc dùng bị kháng cao. Năm 1972, Mefloquin đem vào sử dụng rộng rãi ưu điểm diệt thể phân liệt mạnh thải trừ chậm. Cũng vào năm 1972, Artemisinin phân lập từ cao hoa vàng Trung Quốc. Artemisinin có tác dụng mạnh KST sốt rét tác dụng với chủng kháng đa thuốc. Artemisinin dùng làm thuốc chữa sốt rét làm nguyên liệu bán tổng hợp dẫn xuất khác, tạo nhóm thuốc điều trị sốt rét có triển vọng [2 ]. Do artemisinin có nhược điểm tan dầu nước, tỷ lệ tái phát cao, nên nhà khoa học nghiên cứu bán tổng hợp dẫn xuất artemisinin để cải thiện đặc điểm dược lý dược động học. Phần lớn dẫn xuất ether ester DHA. DHA ____ *------------ -• V c dẫn suất hình thành khử hóa nhóm >C=Q carbonyl artemisinin thành nhóm >CH ÕỈĨỒ Các dẫn xuất ether, ẹster có chứa nhóm thân nước thân dầu, nên cải thiện khả hoà tan so với artemisinin. Dẫn xuất tan nước điển hình natri artesunat (muối natri -DHA- hemi succinat) natri artelinat (muối natri - P" DHA- hydroxy- methylbenzoat ether) với hoạt tính chống sốt rét cao artemisinin 2-5 lần. Các dẫn xuất tan dầu artemether (P~ DHA- methyl ether) arteether (ị3- DHAethylether) với tác dụng mạnh artemisinin khoảng lần [21,24]. Ngoài ra, có số dẫn xuất íluoro alkyl ether có hiệu lực cao, đặc tính điều trị tốt tiếp tục nghiên cứu hoá học sinh học [3]. CH, R Hoat chất =0 Artemisinin -OH Dihydroartemisinin -O O Ỉ3 Artemether -0 Q H , Arteether -0(C=0)(CH2)2C00Na Natri artesunat -OCH2C6H4COONa Natri artelinat 2.2- NGUỔN GỐC, TÍNH CHẤT CỦA ARTEMISININ 2.2.1- Nguồn gốc Artemisinin hoạt chất có tác dụng chống sốt rét chiết xuất từ cao hoa vàng (Artemisia annua L. Asteraceae). Cây trồng nhiều Trung Quốc, Việt Nam, có nhiều nơi khác Ấn Độ, châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Mỹ . Hàm lượng Artemisinin khô từ 0,011,00% phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý, thời điểm thu hái [6,13]. Hàm lượng Artemisinin cao phần vào thời điểm trước hoa[ll]. 1.2.2- Tính chất Artemisinin. 1.2.2.1- Đặc điểm vật lý [20] - Cấu trúc hoá học: - Tên khoa học : (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-decahydro-3,6,9- trimethyl-3, 12 -epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-l ,2-benzodioxepin-10-on. - Công thức phân tử : C15H220 - Nhiệt độ nóng chảy : 151-153°c - Năng suất quay cực : [a]D20= +66,3° (C=l,64% chloroform) - Tính ch ấ t: Artemisinin có dạng tinh thể không màu bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng, tan nước, dầu; tan ethanol, aceton, dễ tan chloroform ethylacetat. 1.2.2.2- Các phản ứng hoá học artemisinin [9,14,23,24] Artemisinin serquiterpen lacton có cầu nối peroxid nội đặc trưng. Do cầu peroxid liên kết dễ bị phân huỷ nên artemisinin bị biến đổi điều kiện khác thành hợp chất mà đa số không giữ khung ban đầu. Trong môi trường trung tính, artemisinin bền vững. Trong môi trường kiềm mạnh hay acid mạnh, artemisinin bị hoạt tính cầu peroxid bị phá huỷ[14]. > Phản ứng với kiềtn Artemisinin dễ bị phân huỷ kiềm thành sản phẩm khác nhau. NaOH loãng 3.2- ĐỂ XUẤT 1. Tiến hành kiểm tra Artesunat tổng hợp tất tiêu có chuyên luận nguyên liệu Artesunat Dược điển Việt Nam III Dược điển Quốc tế. 2. Cần tiếp tục nghiên cứu sản xuất Artesunat quy mô công nghiệp sử dụng NaHC03, Na2C 03làm xúc tác cho phản ứng tổng hợp Artesunat từ DHA anhydrid succinic 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng V iệt: 1. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB Y học Hà Nội. 2. Bùi Đại, Hoàng Tuấn(2002), Bệnh học truyền nhiễm, NXB Y học HN 3. Nguyễn Văn Hân(2003), Nghiên cứu bán tổng hợp số dẫn xuất fluoroalkyl ether dihydroartemisinin, Luận văn thạc sỹ dược học, Đại học Dược Hà Nội. 4. Nguyễn Trần Giáng Hương(1997), Nghiên cứu độc tính natri artesunat ảnh hưởng tới chuyển hoá qua gan số thuốc khác động vật thí nghiệm, Luận án tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội. 5. Hoàng Kim Huyền (1996), sử dụng thuốc điều trị sốt rét - tủ sách sau Đại học -Chuyên đề dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội. . Đỗ Tất Lợi (1999), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 640642. 7. Nguyễn Nghiêm Luật cộng (1995), ảnh hưởng sodium artesunat số trình sinh học chuột nhắt trắng, Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Bộ, BộY tế. . Đỗ Hữu Nghị (1996).Nghiên cứu chiết xuất, bán tổng hợp đưa vào sản xuất số hợp chất tự nhiêncố tác dụng điều trị sốt rét từ nguồn dưọc liệu Việt Nam, Luận án phó tiến sỹ dược học,Trường đại học Dược Hà Nội. 9. Đỗ Hữu Nghị (2001), Giáo trình chiết xuất, Tài liệu sau đại học, Trường đại học Dược Hà Nội. 10.Nguyễn Duy Sĩ cộng sự(1994), “Tác dụng invitro p.falciparum artesunat công ty dược liệu Trung ương I sản xuất”, Tạp chí dược học,{ 2),tr.l4. 11. Nguyễn Đức Tào (1993), Cây hao hoa vàng, chiết xuất gieo trồng làm thuốc chữa sốt rét, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội. 12. Nguyễn Đức Tào cộng (1994). “Những kết ban đầu đánh giá giá tác dụng dược lý lâm sàng artesunat công ty Dược liệu trung ương I sản xuất”, Tạp chí Dược học, (2),tr.l 1. 13. Viện Dược liệu(2004).Cậy thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập 2,tr.820-825. Tài liệu tiếng Anh : 14. China Cooperative Researsh Group on Qinghaosu and its derivatives as antimalarials (1982), ’’The chemistry and synthesis of qinghaosu derivatives”. J. Trad. Chin.Med.2(l),p.9-16. 15. Edlund P.O., Westerlund D., Carlqvist J., Wu B., Jin Y. (1984),’’Determination of artesunate and dihydroartemisinin in plasma by liquid chromatography with post column derivatization and UVdetection”, Acta.Pham.Suec.,21(4),p.223-234. 16. Herman J.W., Charles B.L and Niesko p. (1990),’’Artemisia annua L.: a source of novel antimalarial drugs”, Pharm. Week.Sicen.,12(5),p.169-181. 17. Li Q.G. et al.(1998), “The pharmacokinetic and bioavailability of dihydroartemisinin, artemether, arteether, artesunic acid and artelinic acid in rat ”, J.pharm.Pharmacol, 50(6),p.l71-182 18. Li R, Liao.T.Y, Huang.K.Y, Chon L .(1982), ’’Pharmacokinetic study of sodium Quinghaosu hemisuccinate invivo”, Chun Tao Yao, 12, p.20-22 19. Mahidol University - Faculty of tropical Medicine (1993), “Clinical pharmacology of artemisinin compounds”, Clinical pharmacology of antimalarials, p.263-295. 20. Merck &CO.INC.(1996). The Merck Index, Twelfth Edition, 138. 21. Vries P.J. et al.(1996), “Clinical pharmacology and therapeutic potential of artemisinin and its derivatives in the treatment of malaria”, Drugs, 52(6),p.818-835. 22. WHO (2003), The International pharmacopoeia,vol.5,Third Edition, WHO. Pharm. 23. Zeng M., Li L.,Liang X.(1985). ’’Reaction mechanism for UV spectrophotometric quantitation of quinghaosu ”, Yaowu Fenxi Zazhi, 5(5), p.268-271. 24. Ziffer H., Highet R.J. and Klayman D.L. (1997), Artemisinin : an endoperoxidic antimalarial from Artemisia annua L., SpringerWien NewYork, Austria. 25. Zeng M.(1984), ”A modified iodometric method in determination of organic bridged peroxides - iodometric determination Quinghaosu”, Yaowu Fenxi Zazhi, 4(6),p.327-329. PHỤ LỤC 1. Phổ IR Artesunat sản phẩm (phản ứng dung môi dichloromethan) 2. Phổ IR Artesunat sản phẩm (phản ứng dung môi aceton) 3. Phổ IR Artesunat chuẩn 4. Phổ IR DHA 5. Sắc ký đồ HPLC Artesunat sản phẩm 6. Sắc ký đồ HPLC Artesunat chuẩn 1. Phổ IR Artesunat sản phẩm. (Phản ứng dung môi dichloromethan) » * ^ PERKIN ELMER 04/05/12 10:43 Phor>9 TNTT-DH Duoc Y: scan, 4.0cm-l, flat, smooth Samp.09-Artesuna/D ic1or.-Pro.Ngh i ị 1500 I 1000 errr1 500 % 2. Phổ IR Artesunat sản phẩm (Phản ứng dung môi aceton) PERKIN ELMER 04/05/12 10:37 Phong TNTT-DH Duoc X: scan, 4.0cm-l, flat, smooth Samp.28-Artesunat/flce.-Prof.Ngh i 3. Phổ IR Artesunat chuẩn < -o 4. Phổ IR DHA mAU SAC KY DO HPLC CUA ARTESUNAT SAN PHAM. mAU SẮC KÝ ĐỔ HPLC CỦA ARTESUNAT CHUAN [...]... hoá, detector khúc xạ kế 1.4- Bán tổng hợp artesunat Artesunat được bán tổng hợp từ artemisinin qua giai đoạn trung gian là DHA 1.4.1- Giai đoạn I : Bán tổng hợp DHA [8,14] Cho đến nay, phương pháp hiệu quả nhất để khử hoá chọn lọc nhóm - c= 0 lacton của artemisinin thành nhóm -OH bán acetal trong DHA là dùng tác nhân khử NaBH4 trong methanol ở nhiệt độ thấp Trên cơ sở phương pháp này, A.Brossi đã điều... Dược Hà Nội 18 2.1.3- Phương pháp thực nghiệm 2.1.3.1- Phương pháp tổng hợp Artesunat - Bán tổng hợp artesunat bằng phản ứng ester hoá DHA với anhydrid succinic, xúc tác NaHC0 3 và Na2C 03 - Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dung môi, nồng độ chất xúc tác, nhiệt độ, thời gian đến phản ứng bán tổng hợp, từ đó tìm ra các điều kiện phản ứng thích hợp để có hiệu suất cao, chất lượng artesunat tốt - Theo... Các phương pháp định tính, định lượng artesunat 1.3.9.1- Các phương pháp hoá học > Phương pháp acid - base : Phân tử artesunat có một nhóm chức acid tự do nên có thể định lượng trực tiếp artesunat bằng dung dịch NaOH chỉ thị phenolphtalein Căn cứ vào lượng kiềm tiêu thụ để tính ra lượng chất thử cần định lượng Phương pháp này khá đơn giản, thưòng dùng để định lượng nguyên liệu artesunat 1 3.9.2- Các phương. .. (dm) c : nồng độ phần trăm của artesunat trong dung dịch 22 2.2- KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 2.2.1- Khảo sát ảnh hưởng của một số xúc tác đối vối phản ứng bán tổng hợp artesunat Các công trình nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất ester từ DHA thưòng sử dụng các amin bậc ba như pyridin, triethylamin, 4-DMAP hoặc hỗn hợp các xúc tác này T.s Đỗ Hữu Nghị đã tiến hành tổng hợp artesunat từ DHA và anhydrid... I.3.9.3 Các phương pháp sắc ký [15,25] > Phương pháp sắc ký lớp mỏng : Phương pháp sử dụng hệ dung môi khai triển phù hợp để tách hỗn hợp thành các vết riêng rẽ, rồi hiện màu bằng các thuốc thử đặc hiệu Sau đó quan sát màu sắc và so sánh Rf của vết thử với vết đối chiếu > Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được ứng dụng ngày càng nhiều để định lượng artesunat. .. phương pháp quang [15] > Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại: Artesunat thuỷ phân trong môi trường kiềm, đun nóng tạo ra sản phẩm Q289 có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 28 nm, do đó có thể định lượng artesunat trong nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ của sản phẩm thuỷ phân này trên máy quang phổ tử ngoại ở bước sóng 289nm > Phương pháp đo quang phổ hấp thụ khả kiến : Nhóm chức ester của artesunat. .. ôas CH3 : 1452,8 V -C-O- (vòng) :1151,7 V -O-O-(peroxyd): 874,4 ; 834,8 Dữ liệu phổ IR cho thấy artesunat tổng hợp được hoàn toàn phù hợp với phổ của Artesunat chuẩn 26 2 2 2 - Ảnh hưởng của nồng độ xúc tác đối với thời gian phản ứng và chất lượng Artesunat Chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng bán tổng hợp artesunat ở các nồng độ xúc tác khác nhau trong hai loại dung môi dichloromethan và aceton ❖ Thí... chế DHA được ester hoá thành artesunat khi cho tác dụng với anhydrid succinic, xúc tác là một amin bậc ba: 4 -dimetylaminopyridin (4-DMAP) Khi 15 sử dụng acid succinic làm tác nhân acyl hóa thì phải dùng hỗn hợp 4-DMAP và dicyclohexyl carbodiimid (DCC) [14] T.s Đỗ Hữu Nghị đã nghiên cứu quy trình bán tổng hợp artesunat từ DHA và anhydrid succinic sử dụng xúc tác là hỗn hợp pyridin, 4-DMAP và đưa vào... phản ứng theo nguyên tắc trên nhưng giảm 6 lần lượng chất khử và dung môi, cải tiến phương pháp tinh chế thu được DHA với hiệu suất trên 90% 14 1.4.2- Giai đoạn I I : Bán tổng hợp artesunat [9,14] Các dẫn xuất ester được tổng hợp theo nguyên tắc cho DHA tác dụng vói tác nhân acyl hóa tương ứng, có mặt xúc tác thích hợp Tác nhân acyl hoá có thể là chlorid acid, anhydrid acid hoặc acid carboxylic Xúc... artesunat tốt - Theo dõi phản ứng ester hoá bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng đánh giá nhanh sự hình thành sản phẩm một cách định tính - Tinh chế sản phẩm thu được bằng phương pháp kết tinh phân biệt - Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và đo quang phổ hấp thụ tử ngoại để định lượng artesunat trong sản phẩm, từ đó tính hiệu suất phản ứng Sản phẩm artesunat được định tính bằng phổ hồng ngoại, . khúc xạ kế. 1.4- Bán tổng hợp artesunat Artesunat được bán tổng hợp từ artemisinin qua giai đoạn trung gian là DHA. 1.4.1- Giai đoạn I : Bán tổng hợp DHA [8,14] Cho đến nay, phương pháp hiệu quả. tác cho phản ứng ester hóa DHA thành Artesunat. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu bán tổng hợp Artesunat với mục tiêu : 1. Bán tổng hợp artesunat với xúc tác NaHC03và Na2C. cách dùng artesunat trong điều trị 12 1.3.9- Các phương pháp định lượng artesunat 13 1.4- Bán tổng hợp artesunat 14 PHẦN 2-THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18 2.1- Nguyên vật liệu,thiết bị và phương pháp thực