m Bộ Y Tê TRƯỜNG ĐAI HOC Dươc HÀ NÔI BÙI THU HUÊ ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI PARACETAMOL VÀ ACID MEFENAMIC TRONG VIÊN NÉN BAO PHIM PAMESIC BANG p h n g p h p HPLC ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999-2Í Ặ /ị.itS Ịr ù ỉh , ỉ \ẵ Người hướng dẫn: TS. Thái Phan Quỳnh TS. Thái Duy Thìn Nơi thực hiện: - Phòng Hoá Lý 1- Viện Kiểm nghiệm - Bộ môn Hoá dược- Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: Tháng 10/2003 - 5/2004 Hà Nội - 5/2004 'ÍX.LC » . . . / & réé- LỜI CẢM ƠN Khoá luận thực hoàn thành phòng Hoá lý - Viện kiểm nghiệm môn Hoá dược - Trường đại học Dược Hà Nội thời gian từ tháng 10/2003 đến tháng 5/2004 . Trong trình thực khoá luận nhận giúp đỡ tận tình thầy cô hướng dẫn, thầy cô môn Hoá dược cán phòng Hoá lý - Viện kiểm nghiệm. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đối với: - TS . Thái Phan Quỳnh Như (Trưởng phòng Hoá lý 1-Viện kiểm nghiệm) - TS . Thái Duy Thìn (Phó chủ nhiệm môn Hoá dược-Trường đại học Dược Hà Nội) trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ trình thực khoá luận. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Hoá dược cán kỹ thuật phòng Hoá lý - VKN giúp đỡ hoàn thành tốt khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn thư viện trường đại học Dược Hà Nội cung cấp tài liệu có liên quan. Hà nội, tháng 5/2004 Sinh viên Bùi Thu Huê MỤC LỤC Trang Đặt vấn đ ề Phần 1. Tổng quan 1.1. Paracetamol 1.2. Acid meíenamic . 1.3. Kỹ thuật HPLC 1.3.1. Khái niệm b ản .6 1.3.2. Các đại lượng đặc trưng 1.3.3. Hệ thống HPLC . 11 1.3.4. Pha tĩnh .12 1.3.5. Pha động .13 1.3.6. Cách đánh giá pic 14 1.3.7. Cách tính kết . 14 Phần 2. Thực nghiệm kết 16 2.1. Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 16 2.1.1. Hoá chất - Thiết b ị 16 2.1.2. Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu .17 2.2. Kết thực nghiệm nhận x ét . 19 2.2.1 . Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký . 19 2.2.2. Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 22 2.2.3. Khảo sát độ tuyến tính phương pháp 24 2.2.4. Khảo sát độ xác phương pháp . 28 2.2.5. Khảo sát độ phương pháp .31 2.2.6. ứng dụng chương trình sắc ký xây dựng để định tính định lượng đồng thời paracetamol acid meíenamic hai mẫu (mẫu mẫu 4) viên nén bao phim Pamesic 34 2.3. Bàn luận . 37 Phần 3. Kết luận đề xuất 39 1.Kết luận 39 2. Đề xuất .40 Tài liệu tham khảo 41 CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT AM Acid meíenamic cox Cyclooxygenase HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao mcg Microgam NSAID Thuốc chống viêm giảm đau phi steroid PA Paracetamol PG Prostaglandin STT Số thứ tự TB Trung bình THF Tetrahy drofuran VKN Viện Kiểm Nghiệm ĐẶT VẤN ĐỂ Ngày nhu cầu chăm sóc bảo vệ sức khoẻ ngày tăng, với phát triển khoa học kỹ thuật, đặc biệt lĩnh vực dược, nhà công nghiệp dược hướng tới mục tiêu nâng cao hiệu điều trị giảm bớt tác dụng không mong muốn dược phẩm. Từ nhiều dược chất khác phối hợp dạng bào chế . Nhómthuốc chống viêm - hạ nhiệt - giảmđau dạng phối hợp sản xuất, lưuhành sử dụng ngày rộng rãi, với nhiều biệt dược khác nhau, phần lớn gồm paracetamol phối hợp với nhiều dược chất khác như: clorpheniramin maleat, phenylpropanolamin hydroclorid, dextromethorphan hydrobromid, quinin sulíat, cafẹin, codein Gần kết hợp nhằm làm tăng tác dụng giảm đau bổ sung tác dụng chống viêm cho chế phẩm sản V/ xuất với công thức: Paracetamol : 500 mg Acid meíenamic : 250 mg Biệt dược thuốc nước viên nén bao phim Pamesic công ty dược vật tư y tế Tiền Giang. Trong dược điển [1, 12, 15, 16, 17] chưa có chuyên luận cho dạng thuốc có chứa hai thành phần này. Do độ tan hai chất tương tự :đều có tính acid nên dễ tan kiềm, khó tan nước, không tan dung môi hữu cloroform, ether, tan ethanol; khó chiết tách để định lượng riêng biệt đo quang hay chuẩn độ acid-kiềm, n itrit . Việc quản lý, kiểm tra chất lượng thuốc đòi hỏi tất yếu cho việc đảm bảo chất lượng thuốc đảm bảo hiệu điều trị. Vì phải có phương pháp kiểm nghiệm nhanh chóng, xác thuận tiện, phù hợp với điều kiện trang thiết bị đa số phòng trung tâm kiểm nghiệm. Trước yêu cầu tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định tính định lượng đồng thời paracetamol acid mefenamic phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)” với mục tiêu : - Xây dựng chương trình sắc ký định tính định lượng đồng thời paracetamol aeid meíenamic . - Góp phần xây dựng tiêu chuẩn viên nén bao phim Pamesic cho sở sản xuất. Phầnl. TỔNG QUAN 1.1. PARACETAMOL [1, 4, 8,12, 13, 14, 15,16,17] ■ Công thức cấu tạo : HO-----( ( ) ) -----NH----- COCH3 C8H9N (M = 156,16) Tên khoa học : N - acetyl- para- amino phenol hoặc: para- hydroxy - acetanilid Tên khác : Acetaminophen ■ Tính c h ấ t: - Tinh thể bột kết tinh trắng, không mùi, vị đắng nhẹ - Nhiệt độ nóng chảy : 168 - 172°c - Độ tan : tan nước lạnh (1/70), tan nhiều nước nóng, tan ethanol từ 1/7 đến 1/10. Rất tan cloroíorm, hoàn toàn không tan ether. Tan hoàn toàn dung dịch kiềm tạo muối phenolat. - Có khả hấp thụ quang, cực đại hấp thụ dung môi methanol 245 nm, môi trường kiềm 257 nm. ■ Tác dụng dược lý : Paracetamol ức chế enzym tổng hợp prostaglandin, nên làm giảm nhạy cảm với chất trung gian gây đau, có tác dụng giảm đau. Giảm tổng hợp PGEị, PGE2 làm tăng thải nhiệt giảm sản nhiệt, nên có tác dụng hạ sốt. Paracetamol tác dụng chống viêm chống ngưng kết tiểu cầu. - Chỉ định : Hạ sốt nguyên nhân gây sốt (sốt virus, sốt xuất huyết .)• Giảm đau, sử dụng cho đau nhẹ, đau ngoại vi. - Thận trọng : Quá liều paracetamol gây hoại tử tế bào gan. Không uống rượu thuốc gây độc cho gan thời gian dùng thuốc. - Liều dùng : Người lớn : 300 đến 500 mg/lần X - lần/ngày. Tối đa : không g /ngày Trẻ em : 60 - 325 mg/lần x3 - lần/ngày ■ Các dạng bào c h ế : Viên nén, viên nén phân tán, viên nén hoà tan, viên nang, viên đạn, dung dịch uống, hỗn dịch uống, dạng bào chế phối hợp . Các phương pháp áp dụng đ ể định lượng paracetam ol - Phương pháp đo quang [1, 12, 15, 16, 17] Nguyên tắc : Paracetamol có khả hấp thụ tử ngoại, cực đại hấp thụ paracetamol dung môi methanol 245 nm, môi trường kiềm 257 nm. Kết tính toán dựa vào giá trị mật độ quang đo độ hấp thụ riêng so sánh với chuẩn. - Phương pháp chuẩn đô nitrit [8] Nguyên tắc : Thuỷ phân paracetamol môi trường acid (HC1 10%) nhiệt độ tạo thành amin thơm bậc một. Chuẩn độ dung dịch natri nitrit (NaN02) môi trường acid tạo hợp chất diazoni (phản ứng diazo hoá), nhận biết điểm kết thúc thị tropeolin điện kế. - Phương pháp chuẩn đỏ bàng ceri IV n , 12] Nguyên tắc : Trong dung dịch acid, paracetamol sau thuỷ phân chất khử, ceri IV chất oxy hoá bị khử (nhận thêm electron) chuyển thành ceri III, phát điểm kết thúc íerroin (phức chất sắt o-phenatrolin). sắt phức sắt II sắt III, phức chất sắt II có màu đỏ, phức chất sắt III có màu xanh. Tại điểm tương đương bắt đầu thừa ceri IV, phức chất sắt II chuyển thành sắt III, làm dung dịch đổi màu từ đỏ sang xanh. - Phương pháo Kieldahl [8] Nguyên tắc : Phân huỷ hợp chất chứa nitơ cách đun với H2S04(đặc) với có mặt kali hay natri sulphat. Khi nitơ bị vô hoá kết hợp với H2S04 thành (NH4)2S04. Thêm NaOH vào hỗn hợp phản ứng cất kéo NH3 giải phóng vào dung dịch chuẩn H2S04 0,1N dư. Chuẩn độ H2S04 dư NaOH 0,1N. - Phương pháp HPLC [9, 10, 11, 17] Nguyên tắc : Dựa vào phân bố khác paracetamol pha tĩnh pha động, paracetamol sau qua cột tách chuyển đến detector cho tín hiệu định lượng diện tích chiều cao pic. 1.2. ACID MEFENAMIC [4, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17] ■ Công thức cấu tạo : COOH CH^ C15H 15N (M = 241,29) Tên khoa học :Acid [ ( 2,3 - dimethyl phenyl) amino Hoặc: ■ ]benzoic Acid N - (2,3 - xylyl) anthranilic. Tính ch ấ t: - Bột kết tinh trắng đến trắng ngà, không mùi, để lại vị đắng nhẹ. - Nhiệt độ nóng chảy : 230 - 231°c - Độ tan : Rất khó tan nước, tan cloroíorm (1/25), tan ether (1/80). Tan hoàn toàn dung dịch kiềm - Có khả hấp thụ quang, cực đại hấp thụ môi trường acid 279 nm, môi trường kiềm 285 nm. ■ Tác dụng dược lý : Tác dụng giảm đau , hạ sốt tương tựparacetamol. Ngoài giống NSAID khác, acid meíenamic có tác dụng chống viêm tốt ức chế enym c o x . Paracetamol Diện tích pic 4500 50 100 150 200 250 Nồng độ (mcg/ml) Hình : Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic paracetamol Hình : Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic acid mefenamic 27 2.2.4. Khảo sát độ xác phương pháp Khảo sát độ xác phương pháp hai mẫu (mẫu mẫu 2) viên nén bao phim Pamesic. Tiến hành : - Pha dung dịch chuẩn : Tiến hành tương tự cách pha dung dịch hỗn hợp chuẩn phần khảo sát tính thích hợp hệ thống. Dung dịch chuẩn có nồng độ paracetamol khoảng 80 |ug/ml acid meíenamic khoảng 40 M-g/ml. - Pha dung dịch thử : Với mẫu làm thí nghiệm Cân 20 viên , xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn. Cân xác lượng bột viên tương ứng với khối lượng khoảng 1/5 viên cho vào bình định mức 50,0 ml , thêm ml THF , lắc để hoà tan, thêm dung môi pha động, lắc siêu âm để hoà tan 15 phút, thêm dung môi pha động đến vạch , lắc, lọc. Hút xác 1,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 25,0 ml. Thêm dung môi pha động đến vạch, lắc , lọc qua màng lọc 0,45 |Lim. Với mẫu làm lần (với lần cân khác nhau). Đem đo HPLC so sánh diện tích pic dung dịch thử dung dịch chuẩn điều kiện . Hàm lượng có mẫu thử tính theo công thức : . STXc r X50 X25XM X(mg/viên) = —---- ---------------s c xm Trong - X : Là lượng hoạt chất (mg) có viên - Sr, sc : Là diện tích pic dung dịch mẫu thử mẫu chuẩn - Cc : Là nồng độ dung dịch mẫu chuẩn (tính theo mg/ml) - M : Là khối lượng trung bình viên (tính g) - m : Là khối lượng cân bột viên (tính g). 28 Dưới số liệu nồng độ diện tích pic dung dịch thử dung dịch chuẩn : Bảng : Nồng độ diện tích pic dung dịch chuẩn Lượng cân Nồng độ (g) (|xg/ml) 0,1045 83,60 1526,45 0,0509 40,58 1731,75 Chất chuẩn Paracetamol Acid meíenamic Diện tích pic Bảng7: Lượng cân bột viên diện tích pic dung dịch mẫu thử và2. Mẫu thử STT Lượng cân bột viên(g) Mẫu thử Diện tích pic Paracetamol Lượng cân bột Acid meíenamic viên(g) Diện tích pic Paracetamol Acid meíenamic 0,1818 1558,6 1761,9 0,1721 1442,1 1725,2 0,1815 1545,9 1760,5 0,1712 1425,5 1697,9 0,1760 1494,4 1712,3 0,1755 1485,4 1729,1 0,1750 1477,9 1718,2 0,1768 1451,5 1755,1 0,1757 1468,6 1704,2 0,1717 1407,2 1712,2 0,1764 1494,7 1719,4 0,1702 1436,1 1693,2 Kết khảo sát độ xác phương pháp hai mẫu 2, sau xử lý thống kê trình bày bảng sau : 29 Bảng : Kết khảo sát độ xác phương pháp mẫu Paracetamol STT Acid meíenamic Hàm lượng Hàm Số liệu thống kê (mg/viên) lượng Số liệu thống kê (mg/viên) 511,79 x = 506,08 247,54 x = 248,55 508,46 s = 4,20 247,75 s = 1,22 506,95 sx = 1,71 248,50 sx = 0,49 504,15 í % = 0,87% 250,78 e% = 0,51% 499,32 n = 6; a = 0,05 247,75 n = ; a = 0,05 505,83 ta = 2,571 248.97 ta = 2,571 Bảng : Kết khảo sát độ xác phương pháp mẫu 2. Paracetamol STT Acid meíenamic Hàm lượng Hàm Số liệu thống kê (mg/viên) lượng Số liệu thống kê (mg/viên) 498,21 x = 495,61 255,02 x = 252,88 495,07 s = 6,75 252,31 s = 1,46 503,25 sx = 2,75 250,63 sx = 0,60 488,13 e% = 1,42% 252,55 e% = 0,61% 487,30 n = 6; a = 0,05 253,68 n = ; a = 0,05 501,71 ta = 2,571 253,08 ta = 2,571 ♦> Nhận x é t: Từ kết cho thấy với chương trình sắc ký xây dựng, phương pháp định lượng đồng thời paracetamol acid meíenamic có độ xác 30 cao với sai số tương đối hàm lượng paracetamol 0,87% (trên mẫu 1) 1,42% (trên mẫu 2). Sai số tương đối hàm lượng acid mefenamic 0,51% (trên mẫu 1) 0,61% (trên mẫu 2). Với kết chứng tỏ phương pháp có độ xác cao cho phép áp dụng chương trình sắc ký xây dựng để định lượng chế phẩm có chứa hai thành phần trên. 2.2.5. Khảo sát độ phương pháp Khảo sát độ hai phương pháp: phương pháp thêm phương pháp mẫu tự tạo . a. Phương pháp thêm (tiến hành mẫu 1) : Thêm vào mẫu thử xác định hàm lượng lượng xác chất chuẩn paracetamol acid meíenamic khoảng 20% lượng có mẫu thử cho tổng nồng độ chúng nằm khoảng tuyến tính khảo sát. Độ phương pháp xác định từ tỷ lệ thu hồi chất chuẩn thu (tính từ kết định lượng) so với lượng chất chuẩn thêm vào. - Dung dịch chuẩn gốc : Tiến hành pha tương tự phần khảo sát độ tuyến tính. Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ paracetamol khoảng mg/ml acid mefenamic khoảng mg/ml. - Dung dịch chuẩn : Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng dung môi pha động để dung dịch chuẩn có nồng độ paracetamol khoảng 80 n-g/ml acid meíenamic khoảng 40 |Lig/ml. - Dung dịch thử : Cân xác lượng bột viên tương ứng với khối lượng khoảng 1/5 viên, cho vào bình định mức 50,0 ml, thêm ml THF, thêm xác 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên. Thêm dung môi pha động, lắc siêu âm 10 phút để hoà tan. Thêm dung môi pha động đến thể tích, lọc. Hút xác 1,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm dung môi pha động đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 ịim. Được dung dịch thử đem đo HPLC điều kiện với dung dịch chuẩn. 31 Dựa vào hàm lượng paracetamol acid meíenamic biết mẫu thử, lượng chất chuẩn thêm vào vào diện tích pic dung dịch thử dung dịch chuẩn tính lượng chất chuẩn tìm thấy mẫu thử tỷ lệ thu hồi lượng chuẩn tìm thấy so với lượng chuẩn thêm vào. Kết khảo sát độ phương pháp thêm trình bày bảng sau : Bảng 10 : Kết khảo sát độ phương pháp thêm chuẩn. Lượng STT bột viên Lượng có Chuẩn thêm sẵn (mg) vào (mg) Chuẩn tìm Tỷ lệ thu thấy (mg) hồi (%) 20,09 98,9 (g) 0,1718 Paracetamol 103,19 20,32 0,1709 99,18 20,32 19,97 98,3 0,1763 102,32 20,32 20,25 99,7 Trung bình 98,9 Acid mefenamic 0,1778 50,68 9,99 9,76 97,7 0,1709 48,71 9,99 9,77 97,8 0,1763 50,25 9,99 9,88 98,9 Trung bình b. 98,2 Phương pháp mẫu tự tạo : Dựa vào công thức pha chế chế phẩm, tự tạo mẫu thử cách cân xác lượng paracetamol acid meíenamic nguyên liệu chuẩn với lượng tá dược với công thức cho 10 viên, đem nghiền 32 mịn, trộn coi bột viên, sau cân lượng bột viên tương ứng với khối lượng khoảng 1/5 viên, đem tiến hành định lượng phần khảo sát độ xác (với lần cân). Kết định lượng thử nghiệm so với lượng chất tạo mẫu ban đầu độ phương pháp. Kết khảo sát độ phương pháp mẫu tự tạo trình bày bảng 11: Bảng 11: Kết khảo sát độ phương pháp mẫu tự tạo STT Lượng cân Lượng hoạt chất bột viên (g) biết (mg) Lượng hoạt chất tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hồi (%) Paracetamol 0,1720 99,02 100,21 101,2 0,1765 101,61 100,09 98,5 0,1745 100,46 98,25 97,8 Trung bình 99,2 Acid meíenamỉc 0,1720 49,34 48,45 98,2 0,1765 50,63 49,36 97,5 0,1745 50,06 49,71 99,3 Trung bình ♦> 98,3 Nhận x é t : Từ kết bảng 10 bảng 11 cho thấy tỷ lệ tìm lại paracetamol acid mefenamic đạt từ 98,2 đến 98,9% theo phương pháp thêm chuẩn từ 98,3 đến 99,2% theo phương pháp mẫu tự tạo. Như hai phương pháp: phương pháp thêm phương pháp mẫu tự tạo cho thấy phương pháp định lượng có độ tốt. 33 2.2.6. ứng dụng chương trình sắc ký xây dựng để định tính định lượng đồng thời paracetamol acid meíenamỉc hai mẫu (mẫu mẫu 4) viên nén bao phim Pamesic Chúng tiến hành định tính định lượng đồng thời paracetamol acid meíenamic hai mẫu viên nén bao phim Pamesic. Trên sở điều kiện sắc ký lựa chọn, chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn mẫu thử có nồng độ nằm khoảng tuyến tính khảo sát. Tiến hành tương tự phần khảo sát độ xác, với lần cân mẫu thử. Tiêm sắc ký dung dịch mẫu thử điều kiện với chuẩn . Kết định tính chất đánh giá dựa số liệu thu thời gian lưu chất Kết định lượng tính toán phương pháp ngoại chuẩn , nghĩa so sánh diện tích pic dung dịch thử dung dịch chuẩn điều kiện sắc ký, từ tính hàm lượng paracetamol acid meíenamic chế phẩm cần phân tích theo công thức : V S T x Cr X5 x x M --------X(mg/viên) = -ĩ----- co s c xm Trong - X : Là lượng hoạt chất (mg) có viên - Sp, sc : Là diện tích pic dung dịch mẫu thử mẫu chuẩn - Cc : Là nồng độ dung dịch mẫu chuẩn (tính theo mg/ml) - M : Là khối lượng trung bình viên (tính g) - m : Là khối lượng cân bột viên (tính g). Dưới kết định tính dựa giá trị thời gian lưu chất sắc ký đồ dung dịch mẫu thử mẫu chuẩn. 34 Bảng 12: Kết địnli tính mẫu viên nén bao phim Pamesic Dung dịch thử mãu Dung dich chuẩn Dung dịch thử mẫu STT PA AM PA AM 7,003 2,235 6,923 2,289 6,956 2,278 6,947 2,275 Thời gian lưu (phút) Hoạt chất (trung bình lần tiêm) PA 6,990 6,985 2,296 7,075 2,315 AM 2,276 TB 6,982 2,269 6,981 2,293 mAU I 160 £ 140 120 Hình 6: sắc kỷ đồ dung dịch mẫu chuẩn co c5 h' 100 80 60 40 j 20 I - J ' - . . J~ V ---- - ~ T ----------- ẻ () ơ) & cJ I mAU ị 160 140 Hình 7: sắc ký đồ dung dịch mẫu thử 120 CO hơ) c1 100 c 80 60 I 40 \ 20 i __ ( 'v. / l I> t .5 . . 35 J Kết định lượng mẫu trình bày bảng 13 14 sau đây: Bảng 13: Kết định lượng mẫu Hoạt chất Paracetamol Acid meíenamic Hàm lượng Hàm lượng so Hàm lượng Hàm lượng so (mg/viên) với nhãn (%) (mg/viên) với nhãn (%) 501,8 100,4 254,8 101,7 498,8 99,8 252,4 100,9 505,2 101,2 245,8 98,3 501,9 100,5 251,0 100,3 STT Trung bình Bảngl4: Kết định lượng mẫu Hoạt chất Paracetamol Acid meíenamic Hàm lượng Hàm lượng so Hàm lượng Hàm lượng so (mg/viên) với nhãn (%) (mg/viên) với nhãn (%) 499,2 99,8 249,1 99,6 497,5 99,5 251,7 100,7 501,2 100,2 250,9 100,4 499,5 99,8 250,6 100,2 STT Trung bình ♦> Nhận x é t : Kết bảng 12 từ hình 6,7 cho thấy giá trị thời gian lưu chất hai mẫu so với chuẩn tương đương nhau, kết luận hai mẫu chế phẩm đạt tiêu chuẩn mặt định tính. 36 Kết bảng 13 14 cho thấy hàm lượng paracetamol so với nhãn mẫu 100,5% mẫu 99,8% . Kết định lượng cho thấy hàm lượng acid meíenamic so với nhãn mẫu 100,3 % mẫu 100,2% . Như hai mẫu chế phẩm đem định lượng đạt tiêu chuẩn hàm lượng paracetamol acid meíenamic. 2.3. BÀN LUẬN Phương pháp HPLC phương pháp phân tích đại với ưu điểm bật có độ chọn lọc cao, ổn định, độ lặp lại độ tốt đồng thời lại có phương pháp xử lý mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh. Với ưu điểm HPLC trở thành phương pháp phân tích công cụ có hiệu cao. Chương trình sắc ký xây dựng cho phép tách hai chất paracetamol acid mefenamic tốt, sắc ký đồ pic tách hoàn toàn, thời gian lưu paracetamol khoảng 2,3 phút acid meíenamic khoảng phút. Như thời gian cho mẫu phân tích không dài. Kết khảo sát cho thấy tính thích hợp hệ thống cao, với sai số tương đối thời gian lưu từ 0,19 đến 0,21% diện tích pic từ 0,17 đến 0,26%, đại lượng đặc trưng khác số đĩa lý thuyết, độ cân xứng pic độ phân giải hai pic nằm giới hạn cho phép. Điều chứng tỏ hệ thống có độ thích hợp tốt. Kết khảo sát cho thấy phương pháp có tính tuyến tính khoảng nồng độ rộng với hệ số tương quan tuyến tính gần 1, chứng tỏ tương quan chặt chẽ nồng độ diện tích pic chất khảo sát, đồng thời cho phép ứng dụng chương trình sắc ký xây dựng để định lượng chế phẩm phối hợp có chứa hai thành phần với tỷ lệ hặm lượng khác nhau. Kết khảo sát độ xác cho thấy phương pháp có độ xác cao với sai số tương đối hàm lượng mẫu từ 0,51 đến 0,87% mẫu từ 0,61 đến 1,42%. Khảo sát độ hai phương pháp, với phương pháp thêm, tỷ lệ tìm thấy chuẩn đạt từ 98,1 37 đến 98,9%, với phương pháp mẫu tự tạo, tỷ lệ tìm thấy chuẩn đạt từ 98,3 đến 99,2%. Điều chứng tỏ phương pháp có độ tốt. Thực tế việc trang bị máy móc, thiết bị cho phương pháp phổ biến phòng trung tâm kiểm nghiệm, việc áp dụng vào thực tế phương pháp khả thi. 38 Phần 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 1. Kết luận Trong qua trình thực khoá luận thu kết sau : > Biết cách tiến hành nghiên cứu hoàn thành đề tài, biết cách tra cứu tìm hiểu tài liệu tham khảo phục vụ cho trình thực đề tài nghiên cứu khoa học. > Hiểu sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC). > Xây dựng chương trình sắc ký định tính định lượng đồng thời paracetamol acid mefenamic sau: - Máy sắc ký lỏng hiệu cao - Cột Lichrosorb RP18 ( 250x4 mm; 5|^m) cột tương đương. - Detector u v đặt bước sóng 279 nm. - Pha động : Acetonitril - nước - tetrahydrofuran(3 : : 9) điều chỉnh đến pH 2,2 acid phosphoric. - Tốc độ dòng 1,0 ml/phút. - Thể tích mẫu tiêm : 20 ỊJ,1. - Nhiệt độ phòng. Kết khảo sát cho thấy hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, phương pháp định lượng xây dựng có độ tuyến tính khoảng nồng độ rộng, có độ xác cao độ tốt. > ứng dụng chương trình sắc ký xây dựng để định tính định lượng đồng thời paracetamol acid meíenamic hai mẫu chế phẩm viên nén 39 bao phim Pamesic cho kết hai mẫu đạt tiêu chuẩn định tính định lượng. 2. Đề xuất Vì thời gian nghiên cứu không cho phép, xin đề xuất số ý kiến sau: - Tiếp tục nghiên cứu định lượng hai thành phần phương pháp : toàn phổ, quang phổ đạo hàm . để sở lựa chọn sử dụng phù hợp với điều kiện mình. - Tiếp tục nghiên cứu, hoàn chỉnh phương pháp đề nghị đưa vào Dược Điển Việt Nam lần xuất tới. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB Y Học Hà Nội, tr. 207, PL- 84,85. 2. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An (1998), Hoá phân tích, Trường đại học Dược Hà Nội, tập 2, chương V, VI. 3. Trần Việt Hùng, Thái Phan Quỳnh Như, Trịnh Văn Quỳ (1999), “ Định lượng pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat, chlopheniramin maleat panthenol số thuốc nhỏ mắt phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” , Tạp chí dược học, số 3, tr. 18-21. 4. Hoàng Tích Huyền, Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông (1999), Dược lý học, Đại học Y Hà Nội, NXB YHHN, tr. 183-187 5. Nguyễn Tiến Khanh (1995), Thông kê ứng dụng công tác dược, Tủ sách sau đại học, Trường đại học Dược Hà Nội. 6. Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc kỷ lỏng hiệu cao, Trường đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 7. Thái Phan Quỳnh Như (2001), ứng dụng phương pháp chia tách kiểm nghiệm thuốc, Viện kiểm nghiệm, Bộ y tế 8. Thái Duy Thìn, Nguyễn Văn Thục (1998), Hoá dược, Trường đại học Dược Hà Nội, tập 1, tr. 90, 91, 97, 98. 9. Thái Duy Thìn (2003), ‘‘Định tính định lượng đồng thời paracetamol quinin sulphat viên nén Antigrip F phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)” , Tạp chí dược học, số 7, tr. 19-21. 10. Ngô Thị Thuỷ (2001), “ Góp phần nghiên cứu định lượng paracetamol, chlopheniramin maleat, phenylpropanolamin.HCl dextromethorphan. HBr chế phẩm viên nén hạ nhiệt giảm đau phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” , Luận văn thạc sĩ dược học khoá IV, Trường đại hoc dươc Hà Nội. 41 11. Dương Văn Trung (2000), “ Định lượng paracetamol, vitamin BI chlopheniramin maleat viên Paraíort- B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” Thông báo kiểm nghiệm, số 4, tr. - 10. 12. British Pharmacopoeia (2001), tr. 1060, 1246, 2222, 2294 - 2297. 13. Clarke’s Isolation and Identiíication (1986), The Pharmaceutical Press, London, tr. 201 đến 220, 727, 849. 14. Martindale 32th (1999), voll, tr. 51, 51, 72, 73, 74. 15. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (1997), vol2 , tr. 363, 444, 445. 16. The Japanese Pharmacopoeia 14 th (2001), tr. 219, 220, 592. 17. The United States Pharmacopoeia 24 (2000), tr. 17 - 40, 1030, 1920 1925. 42 [...]... đúng của phương pháp Khảo sát độ đúng bằng hai phương pháp: phương pháp thêm và phương pháp mẫu tự tạo a Phương pháp thêm (tiến hành trên mẫu 1) : Thêm vào mẫu thử đã được xác định hàm lượng một lượng chính xác chất chuẩn paracetamol và acid meíenamic bằng khoảng 20% lượng có trong mẫu thử sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Độ đúng của phương pháp được xác định. .. hành: Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký - Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất Khảo sát độ chính xác của phương pháp (tiến hành trên mẫu 1 và mẫu 2) 17 Khảo sát độ đúng bằng hai phương pháp : Phương pháp thêm chuẩn (tiến hành trên mẫu 1) và phương pháp mẫu tự tạo ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng, định tính và định lượng đổng thời paracetamol và acid meíenamic... bào c h ế : Viên nang , viên nén, viên đạn Các phương pháp đ ã được áp dụng đ ể định lượng acid mefenamic: - Phương pháp acid - base r12, 16] Nguyên tắc : Acid meíenamic được hoà tan trong dung môi ethanol (ethanol trước đó đã được trung tính hoá), sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1M với chỉ thị phenolphtalein - Phương pháp HPLC [17] Nguyên tắc : Dựa vào sự phân bố khác nhau của acid meíenamic... dựng, phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và acid meíenamic có độ chính xác 30 cao với sai số tương đối về hàm lượng của paracetamol là 0,87% (trên mẫu 1) và 1,42% (trên mẫu 2) Sai số tương đối về hàm lượng của acid mefenamic là 0,51% (trên mẫu 1) và 0,61% (trên mẫu 2) Với kết quả này chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao và cho phép áp dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định lượng. .. xác định chiều cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic 1.3.7 Cách tính kết quả • Phương pháp ngoai chuán : Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện Kết quả của chất chưa biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn • Phương pháp nôi chuán : Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng. .. tĩnh ở thời điểm cân bằng • Thừa số dung lương Thừa số dung lượng là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng k'= Q - = K x ^ Qm vm Trong đó Qs, Qm là lượng chất tan có trong pha tĩnh và pha động vs, VM là thể tích pha tĩnh và pha động Có thể tính k... và diện tích pic của paracetamol Hình 5 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính nồng độ và diện tích pic của acid mefenamic 27 2.2.4 Khảo sát độ chính xác của phương pháp Khảo sát độ chính xác của phương pháp trên hai mẫu (mẫu 1 và mẫu 2) của viên nén bao phim Pamesic Tiến hành : - Pha dung dịch chuẩn : Tiến hành tương tự cách pha dung dịch hỗn hợp chuẩn trong phần khảo sát tính thích hợp của hệ... của một chất T h ì: t R= tR—10 Trong đó: t’Rlà thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh) t0 là thời gian chết (thời gian không lưu giữ) 8 Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn , thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tuỳ thuộc vào bản chất, cấu tạo và tính chất của chất đó VI vậy thời gian lưu là đại lượng định tính các chất Khi pha động chảy... sắc ký có tính thích hợp tốt 2.2.3 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ các chất cần định lượng trên các chất chuẩn paracetamol và acid meíenamic Tiến hành pha một dãy dung dịch hỗn hợp chuẩn có nồng độ của paracetamol biến thiên trong khoảng 20 -> 200 |Lig/ml và của acid meíenamic biến thiên trong 24 khoảng 10 -> 100 |ig/ml Xác định sự... mẫu tự tạo ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng, định tính và định lượng đổng thời paracetamol và acid meíenamic trên mẫu 3 và mẫu 4 của viên nén Pamesic bằng phương pháp ngoại chuẩn c Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu sử dụng trong khoá luận là phương pháp HPLC Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký cho phép tách hai chất được tốt nhất, sau đó thông qua việc xử lý thống kê . ĐAI HOC Dươc HÀ NÔI m BÙI THU HUÊ ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI PARACETAMOL VÀ ACID MEFENAMIC TRONG VIÊN NÉN BAO PHIM PAMESIC BANG ph ư ơ n g p h á p HPLC ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ. số các phòng và trung tâm kiểm nghiệm. 1 Trước yêu cầu đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định tính và định lượng đồng thời paracetamol và acid mefenamic bằng phương pháp sắc ký. hiệu năng cao (HPLC) ” với mục tiêu : - Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời paracetamol và aeid meíenamic . - Góp phần xây dựng tiêu chuẩn viên nén bao phim Pamesic cho