BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Mã số: 62720410 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh- Năm 2015 Công trình hoàn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học : 1. PGS.TS. TRẦN HÙNG 2. PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN Phản biện 1: PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ Hội Đồng Dược Điển Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS. Trần Việt Hùng Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương Phản biện 3: PGS.TS. Hoàng Minh Châu Đại Học Y-Dược TP.HCM Luận án bảo vệ hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp :……………………………………………………. Vào lúc :……giờ………ngày…….tháng…….năm………. Có thể tìm hiểu luận án : - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh - Thư viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ 1. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Nghiên cứu thành phần alkaloid tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae)”, Tạp chí Y học Tp.HCM, Tập 15 phụ số 1, 2011, 606 - 611. 2. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Xây dựng qui trình định lượng neferin cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae) HPLC với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học Tp.HCM, Tập 15 phụ số 1, 2011, 628 - 632. 3. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Lữ Thiện Phúc, Mạch Khắc Duy (2012), “Xây dựng qui trình định lượng, định tính điểm số alkaloid có tâm sen Việt Nam (Nelumbo nucifera Gaertn) kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học thực hành, số 852+853, 303-307. 4. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Tường Vi, Nguyễn Thị Phương Cúc (2012), “Xây dựng qui trình chiết cao chuẩn alkaloid sen (Nelumbo nucifera Gaertn)”. Tạp chí Y học thực hành, số 852+853, 315-319. 5. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Xuân Thương, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2012), “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin quercetin 3-O-βD-glucuronid sen phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học số 32012, 17-21. 6. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner (2012), “Quantitative determination of phenolic compounds in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves by capillary zone electrophoresis”, Planta Medica, 78, 1796-1799. 7. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner (2013), “Analysis of alkaloids in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves by non aqueous capillary electrophoresis using ultraviolett and mass spectrometric detection”, Journal of Chromatography A, 1302, 174-180. 8. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Tô Yến Ngọc, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2013), “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời nuciferin, pronuciferin, o-nornuciferin isoliensinin sen phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học số 5-2013, 27-31. 9. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner (2013), “Analysis of alkaloids in lotus (nelumbo nucifera gaertn.) embryo by non-aqueous capillary electrophoresis using ultraviolet and mass spectrometric detection”, Proceeding of the eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh city, Vietnam, December 4-5, 2013, 316-321. 10. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Huỳnh Phương Thảo, Trần Hùng (2014). “Nghiên cứu phân lập alkaloid có tác dụng sinh học sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)”. Tạp chí Y học thực hành, số 944-2014, 49-52. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae) thuốc quí, có giá trị sinh cao, sử dụng phổ biến dạng thuốc hay thực phẩm chức để điều trị ngủ, cao huyết áp, giảm cân, điều hòa đường huyết, .Các hoạt tính sinh học chứng minh liên quan đến diện thành phần alkaloid flavonoid có lá, tâm Sen. Trên giới có nhiều công trình nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học tâm Sen. Tuy nhiên, nghiên cứu lĩnh vực kiểm nghiệm nhiều hạn chế mà nguyên nhân chủ yếu hai thành phần có tác dụng sinh học lá, tâm Sen alkaloid flavonoid chưa nghiên cứu công bố toàn diện; chưa có công trình khoa học khẳng định chất đánh dấu nguyên liệu hoàn toàn chưa có chất đối chiếu có nguồn gốc từ dược liệu phân phối thị trường. Do đó, việc nghiên cứu thành phần alkaloid flavonoid, phân lập thiết lập chất đối chiếu phục vụ cho việc định tính, định lượng alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học lá, tâm Sen. Nhằm nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu sử dụng rộng rãi, ứng dụng công tác đảm bảo chất lượng dược liệu chế phẩm từ Sen việc làm cấp thiết. Với lý trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen chế phẩm” thực với nội dung nghiên cứu sau: 1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ tâm Sen phương pháp sắc ký phổ nghiệm. 2. Thiết lập xây dựng tiêu chuẩn số alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm. 3. Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời số alkaloid, flavonoid có lá, tâm Sen phương pháp HPLC CE. 4. Áp dụng qui trình để đánh giá thành phần, hàm lượng alkaloid flavonoid lá, tâm Sen thu hái từ tỉnh, thành khác chế phẩm từ Sen có thị trường. 2. Tính cấp thiết đề tài: Lá tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae) sử dụng phổ biến thị trường dạng thuốc, thực phẩm chức để điều trị hỗ trợ điều trị bệnh lý khó ngủ, béo phì, mỡ máu cao, cao huyết áp, loạn nhịp tim… Tuy nhiên, công tác đảm bảo chất lượng cho nguồn nguyên liệu chế phẩm chưa thực chặt chẽ mà nguyên nhân nghiên cứu toàn diện, chi tiết hai thành phần alkaloid, flavonoid hạn chế việc kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu thông qua việc định tính, định lượng thành phần đánh dấu sinh học chưa thực khan chất đối chiếu từ dược liệu này. Do đó, việc nghiên cứu chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc nhóm alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học lá, tâm Sen nhằm thiết lập chất đối chiếu ứng dụng cho việc nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Sen chế phẩm từ Sen cần thiết, có ý nghĩa khoa học có giá trị thực tiễn. 3. Những đóng góp luận án: Luận án đạt số kết mới, đóng góp vào công trình nghiên cứu cho Sen sau: 3.1. Thành phần hóa học Phân lập 35 hợp chất (21 alkaloid 14 flavonoid) với 28 cấu trúc xác định từ tâm Sen. Trong có: - 02 alkaloid hợp chất (EN-4 EN-5), lần công bố phân lập từ thực vật, cấu trúc xác định đề nghị đặt tên isoliensinin N2’-oxyd isoliensinin N2-oxyd. - 05 hợp chất công bố có dược liệu khác lần phân lập từ Sen: 02 alkaloid (pronuciferin N-oxyd apoglaziovin); 03 flavonoid (calycosin, scutellarein 7-O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin). - 02 alkaloid lần phân lập từ Sen (isoliensinin, norarmepavin); 03 alkaloid (nuciferin, armepavin, norarmepavin) 03 flavonoid (isorhamnetin, quercitrin, quercetin 3-O-β-DGlcA) lần công bố từ tâm Sen. 3.2. Thiết lập chất đối chiếu Thiết lập 06 chất đối chiếu (nuciferin, o-nornuciferin, liensinin, isoliensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA) Hiện tại, CĐC chưa phân phối hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia. 3.3. Quy trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alcaloid, flavonoid có lá, tâm Sen Xây dựng thẩm định đạt yêu cầu 08 quy trình phân tích đồng thời alkaloid hay flavonoid phương pháp HPLC-PDA CE-PDA-MS. Các quy trình chưa công bố công trình nước giới Các qui trình định tính, định lượng sau thẩm định áp dụng để kiểm soát chất lượng 32 mẫu nguyên liệu Sen 32 mẫu nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) thu hái vào mùa thu hái khác từ ba vùng miền khác Việt Nam chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen lưu hành thị trường. Xây dựng sắc ký đồ, điện di đồ dấu vân tay phương pháp SKLM, HPLC-PDA, CE-PDA/MS giúp xác định đặc tính điểm chỉ, nhận dạng lá, tâm Sen vùng miền Việt Nam. 4. Bố cục luận án: có 131 trang chính: Đặt vấn đề (2); chương 1: Tổng quan tài liệu (24); chương 2: Phương pháp nghiên cứu (22); chương 3: Kết nghiên cứu (62), chương 4: Bàn luận (23); kết luận (3); kiến nghị (1). Danh mục công trình (2); Tài liệu tham khảo (9). NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Thực vật học TNHC Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn, họ Sen - Nelumbonaceae. 1.2. Hóa học Sen Có 15 alkaloid, 16 flavonoid Sen 12 alkaloid, flavonoid tâm Sen công bố. Các alkaloid thuộc khung aporphin, proaporphin, benzylisoquinolin bisbenzylisoquinolin. Các flavonoid có khung euflavonoid thuộc nhóm flavonol. Các nghiên cứu chiết xuất- phân lập- xác định cấu trúc - Các alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen chiết phương pháp: ngâm lạnh, ngấm kiệt, chiết hỗ trợ vi sóng, chiết siêu tới hạn. - Các hợp chất tinh khiết phân lập phương pháp sắc ký: sắc ký pha thuận, rây phân tử, sắc ký ngược dòng tốc độ cao. - Cấu trúc hợp chất phân lập biện giải phép phổ nghiệm: UV, IR, MS, NMR. Các nghiên cứu định tính, định lượng Thành phần alkaloid, flavonoid tâm Sen: sử dụng phương pháp HPLC-PDA-MS/MS CE-PDA. 1.3. Tác dụng sinh học Các tác dụng an thần, hạ cholesterol, hạ đường huyết, hạ huyết áp, loạn nhịp tim, kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi hóa kích thích miễn dịch. 1.4. Phương pháp thiết lập chất đối chiếu: hướng dẫn ASEAN. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: đối tượng nghiên cứu alkaloid flavonoid lá, tâm Sen. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp chiết xuất: Chiết ngâm lạnh, chiết với hỗ trợ sóng siêu âm: nghiên cứu điều kiện dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu. 2.2.2. Phương pháp phân lập, xác định độ tinh khiết, cấu trúc hợp chất tinh khiết: Sử dụng phương pháp sắc ký cột pha thuận, pha đảo Sephadex LH-20, sắc ký lỏng bán điều chế, sắc ký phân bố ly tâm nhanh. Xác định độ tinh khiết phương pháp SKLM, HPLC/PDA, quét nhiệt vi sai. Biện giải cấu trúc phép phổ nghiệm: UV, IR, MS, NMR. 2.2.3. Qui trình định tính, định lượng alkaloid, flavonoid phương pháp HPLC, CE Qui trình định lượng: phải đạt yêu cầu thẩm định theo hướng dẫn ICH. - Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid flavonoid từ lá, tâm Sen (dung môi chiết, số lần chiết) dung môi pha mẫu. - Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ pH pha động, kỹ thuật rửa giải. - Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độ đệm, pH dung dịch đệm .); loại chất diện hoạt, nồng độ chất diện hoạt; điều kiện đầu dò: bước sóng phân tích với đầu dò PDA; kiểu ion hóa, áp suất khí bao, nhiệt độ buồng ion hóa, áp dụng, chất lỏng bao với đầu dò MS. Định tính điểm chỉ: Phương pháp SKLM: khảo sát dung môi để xác định đặc trưng hai nhóm hoạt chất alcaloid flavonoid lá, tâm Sen qua hệ số Rf màu sắc vết đặc trưng. Phương pháp HPLC CE: dựa sắc ký đồ (SKĐ), điện di đồ (ĐDĐ) xác định thời gian lưu (tR-HPLC) hay thời gian dịch chuyển (tM-CE) diện tích đỉnh pic tỷ lệ diện tích pic pic alkaloid flavonoid mẫu nguyên liệu. 2.2.4. Phương pháp thiết lập CĐC: Thực theo hướng dẫn WHO, ASEAN, ấn quy trình thiết lập CĐC. 2.2.5. Ứng dụng qui trình định tính, định lượng Đánh giá đặc tính điểm hàm lượng alkaloid flavonoid có nguyên liệu lá, tâm Sen thu hái từ vùng thu hái khác thổ nhưỡng, khí hậu chế phẩm thuốc hay thực phẩm chức bào chế từ hai nguyên liệu này. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ tâm Sen Chiết cao cồn: dược liệu làm ẩm dung môi khoảng giờ. Cho dung môi ngập dược liệu 1- cm, ngâm khoảng 48 giờ. Rút dịch chiết đến âm tính với thuốc thử (TT) Dragendorff FeCl3 1%. Tỷ lệ dung môi/dược liệu (10:1). Gộp dịch chiết, lọc cô đến cao đặc. Chiết flavonoid: cao cồn acid hóa H2SO4 2% đến pH 1-2. Loại tạp n-hexan, sau lắc với ethyl acetat đến âm tính với TT FeCl3 1%. Gộp dịch chiết ethyl acetat, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa flavonoid tủa F từ Sen cao EF từ tâm Sen. Chiết alcaloid: dịch acid sau chiết flavonoid kiềm hóa amoniac 25% theo gradient pH. Lắc với cloroform đến âm tính với TT Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alkaloid A1, A2, A3 từ Sen NP5, NP8, P n-Bu từ tâm Sen tương ứng. Từ tủa B thu trình thu hồi dung môi để thu cao cồn acid hóa H2SO4 2% cho phản ứng đặc hiệu với TT Bertrand, tủa thu rửa loại tạp với CHCl3, EtOAc, sau hòa NaOH 2% chiết CHCl3 để thu cao N. 3.2 Phân lập hợp chất tinh khiết từ cao chiết lá, tâm Sen Cao A2 tủa F tách phân đoạn sắc ký cột chân không; cao A3, cao N, NP5, NP8, EF tách phân đoạn cột pha thuận. Các phân đoạn tinh khiết thu tiếp tục phân lập sắc ký cột Sephadex LH-20, sắc ký lỏng bán điều chế pha đảo, sắc ký phân bố ly tâm nhanh để phân lập 35 hợp chất với 28 cấu trúc biện giải so sánh liệu phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR. với tài liệu công bố trình bày mục 3. Cấu trúc hóa học độ dịch chuyển hóa học C, H 16 alkaloid 12 flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen trình bày Hình 3.7-3.15. 3.3 Thiết lập chất đối chiếu (CĐC) 3.3.1. Xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập CĐC Các alkaloid, flavonoid lựa chọn để thiết lập CĐC hợp chất đại diện, chiếm hàm lượng lớn cây, khối lượng phân lập nhiều (> 500 mg) với độ tinh khiết sắc ký cao (> 95%) để thiết lập CĐC. 06 nguyên liệu chọn để thiết lập CĐC: nuciferin, 2-Onornuciferin, isoliensinin, liensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA. Bảng 3.49. Kết khảo sát hàm ẩm phương pháp TGA điểm nóng chảy, độ tinh khiết phương pháp DSC (n=3). Tên CĐC Nuciferin O-nornuciferin Isoliensinin Liensinin Neferin Quercetin-3-O-β-D-GlcA Điểm nóng chảy TB ( o C) Độ tinh khiết TB (%) Hàm ẩm TB (%) 163,0 173,5 70,5 74,5 93,0 147,0 99,64 97,65 97,91 98,84 99,91 100,0 0,415 0,542 0,392 0,186 0,825 1,007 Xác định độ tinh khiết HPLC/PDA Dựa cấu trúc hóa học hợp chất nghiên cứu, khảo sát thông số: chất pha tĩnh, pha động, pH, nhiệt độ, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện, nhằm tìm điều kiện sắc ký thích hợp xác định độ tinh khiết sắc ký mẫu nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu. Bảng 3.50. Tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết HPLC-PDA 06 CĐC. Tên CĐC Nuciferin 2-Onornuciferin Isoliensinin Liensinin Neferin Pha tĩnh Pha động ACN-TEA 0,1% Gemini C18 (150 mm x 4,6; 5µm) 52:48 50:50 64:36 64:36 60:40 Nhiệt độ cột (o C) 30 λ (nm) F (ml/phút) 272 272 1,0 1,0 285 285 285 0,8 0,8 0,8 10 Quercetin 3O-β-D-glcA ACN- acid formic 0,1 % (20:80) 254 1,0 Xác định tính phù hợp hệ thống: thông số sắc ký đạt yêu cầu qui định sau 06 lần tiêm liên tiếp, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống. Thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký nguyên liệu làm CĐC HPLC Tính đặc hiệu: SKĐ mẫu trắng tín hiệu vị trí thời gian lưu pic SKĐ mẫu thử CĐC. Bảng 3.52. Kết xác định tính tuyến tính, miền giá trị, độ đúng, độ xác qui trình phân tích nguyên liệu thiết lập CĐC. Yêu cầu thẩm định Phương trình hồi qui Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính Độ xác ngày RSD (%) (n=6) Độ đúng* (n=9) y= 1907x 0,9995 y= 7148x 0,9992 y= 10225x 0,9990 y= 6201x 0,9989 y= 1046x 0,9997 y= 1325x 0,9994 15,63-1000 (µg mL-1) 0,76 1,23 1,84 0,52 0,98 0,53 98,7102,3 101,5103,6 99,8102,8 98,3103,5 97,6102,2 98,8103,4 *: Tỉ lệ hồi phục trung bình (%). (1): nuciferin; (2): 2-O-nornuciferin; (3): isoliensinin (4): liensinin; (5): neferin; (6): quercetin-3-O-D-GlcA. Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết 06 nguyên liệu làm chất đối chiếu phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng, độ xác độ cao. Do áp dụng quy trình để tiến hành xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập CĐC. Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký 06 nguyên liệu thiết lập CĐC Bảng 3.53. Kết xác định độ tinh khiết sắc ký (%) nguyên liệu thiết lập CĐC. Tên CĐC Nuciferin O-nornuciferin Isoliensinin Độ tinh khiết TB (%) HPLC/PDA 99,20 96,60 96,80 RSD (n=3) 0,79 % 1,36 % 2,02 % Tạp (%) 0,38 2,86 2,81 11 Liensinin Neferin Quercetin 3-O-β-D-GlcA 96,10 96,03 98,01 1,15 % 1,34 % 0,64 % 3,71 1,82 1,58 3.2.2. Xây dựng TCCS đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC Dự kiến TCCS nguyên liệu làm chất đối chiếu hóa học hợp chất tự nhiên đặc trưng chiết từ dược liệu gồm tiêu, mức chất lượng đề nghị phương pháp thử tóm tắt Bảng 3.54. Bảng 3.54. Tóm tắt tiêu chất lượng phương pháp thử CĐC. Chỉ tiêu Mức chất lượng đề nghị 1. Tính chất 2. Hàm ẩm 3. Định tính Nhóm I: Phổ IR Dạng vô định hình, màu sắc, mùi vị, độ tan Không 1% Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hóa học nguyên liệu dùng thiết lập chất đối chiếu. Nhóm II: Điểm nóng chảy phải nằm khoảng điểm chảy Nhiệt độ nóng chảy lí thuyết chất ± 1oC phù hợp với điểm suât chảy liệu chuẩn. quay cực. Giá trị NSQC phải nằm khoảng lý thuyết chất ± 2oC phù hợp với NSQC liệu chuẩn. Nhóm III: UV, MS, Dữ liệu phổ UV phải có λmax đặc trưng NMR MS phải có số khối đặc trưng chất. Dữ liệu phổ NMR (13C, 1H, COSY, HSQC, HMBC) phù hợp với liệu chuẩn, liệu phổ công bố. 4. Định lượng Không thấp 95 % tính theo chế phẩm nguyên trạng. 5. Tạp chất Không vượt % tính theo chế phẩm nguyên trạng, loại pic có S/N < 2/1. Phương pháp thử Theo TCCS PL- 3.11 3.2.3 Đánh giá đồng lọ Mỗi lọ đóng 10 mg, tổng số lọ đóng 30 lọ. Sau đóng, ống bảo quản nhiệt độ từ 2-8 oC. Số lọ đánh giá: lọ. Mỗi lọ phân tích lần phương pháp thẩm định. Kết trình bày Bảng 3.55. 12 Bảng 3.55. Kết đánh giá đồng lọ sau đóng gói CĐC CĐC Mẫu thử Lọ số Nuciferin Hàm lượng % Lọ số 2-Onornuciferin Hàm lượng % Lọ số Isoliensinin Hàm lượng % Lọ số Liensinin Hàm lượng % Lọ số Neferin Hàm lượng % Quercetin 3- Lọ số O-β-D-GlcA Hàm lượng % 99,41 35 96,79 96,99 14 96,27 95,50 25 97,91 10 98,65 40 96,84 96,56 18 97,25 11 96,97 27 98,10 15 99,27 45 96,75 97,08 22 96,28 13 95,43 29 98,86 20 99,35 96,83 96,97 26 96,30 17 95,41 31 97,90 25 99,43 96,78 10 97,05 32 96,28 19 95,38 33 97,87 30 99,32 50 96,85 12 96,34 44 96,26 23 96,20 36 97,86 RSD 0,3% 0,4% 0,2% 0,4% 0,7% 0,5% Nhận xét: Độ lặp lại tương đối hàm lượng lọ lô sản xuất có RSD 1,0%. Do đó, lọ thành phẩm lô sản xuất có hàm lượng đồng nhất. Từ kết luận điều kiện đóng gói ổn định phù hợp. 3.2.4. Đánh giá liên phòng thí nghiệm Các lọ CĐC đánh giá 2-3 phòng thí nghiệm đạt GLP ISO 17025: - Khoa Thiết lập chất chuẩn & Chất đối chiếu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. HCM (PTN-1). - Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm - Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. HCM (PTN-2). - Trung tâm kiểm nghiệm thuốc- mỹ phẩm- thực phẩm Tp. Cần Thơ (PTN-3). Mỗi PTN nhận lọ chất đối chiếu quy trình phân tích. Độ đồng liên PTN đánh giá phép thống kê ANOVA yếu tố 18 kết định lượng 2-3 PTN tham gia đánh giá. Bảng 3.56. Kết đánh giá liên PTN thống kê Anova nguyên liệu thiết lập CĐC. 13 CĐC Nuciferin 2-O-nornuciferin Isoliensinin Liensinin Neferin Quercetin 3-O-β-D-glcA Ftn 2,39 2,68 3,47 1,66 0,20 0,52 Flt 3,68 Nhận xét Kết trung bình ba PTN giống Nhận xét: giá trị Ftn CĐC nhỏ Flt = 3,682. Do đó, độ tinh khiết sắc ký CĐC không phụ thuộc vào PTN tham gia đánh giá. Các lọ CĐC đồng độ tinh khiết sắc ký hàm lượng (%) nguyên liệu thiết lập CĐC không phụ thuộc vào PTN tham gia đánh giá. 3.2.5. Xác định giá trị ấn định giá trị công bố Bảng 3.57. Kết giá trị ấn định CĐC sau đóng gói STT Nguyên liệu thiết lập CĐC Nuciferin O-nornuciferin Isoliensinin Liensinin Neferin Quercetin 3-O-β-D-GlcA Hàm lượng (%) công bố nhãn theo nguyên trạng 99,34 96,54 96,72 96,23 95,94 97,88 Nhận xét: 06 nguyên liệu dùng thiết lập CĐC đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng xác định 95% tất mẫu tính theo trạng, CĐC bảo quản nhiệt độ 2- oC, tránh ánh sáng. 3.3. Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng alkaloid, flavonoid tâm Sen phương pháp HPLC-PDA CE-PDA/MS 3.3.1. Qui trình chiết alkaloid, flavonoid toàn phần có mẫu nguyên liệu Sen tâm Sen: alkaloid thực theo Sơ đồ chiết 3.2; flavonoid thực theo Sơ đồ chiết 3.3. 14 3.3.2. Thăm dò điều kiện sắc ký thích hợp Qui trình định lượng đồng thời 07 alkaloid Sen CE-PDA-MS Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica nung chảy, 62 cm x50 µm i.d, đệm amoni acetat 100 mM MeOH/ACN/Nước (70/25/5) với 0,6 % acetic băng, nhiệt độ mao quản 30 oC; điện 25 kV, bước sóng phát 225 nm, kiểu tiêm thủy động học. Thứ tự pic: caaverin (1), isoliensinin (2), armepavin (3), nor-armepavin (4), nuciferin (5), 2-O-nornuciferin (6), pronuciferin (7). Mẫu dịch chiết alkaloid Sen NN-1a Mẫu hỗn hợp chuẩn alkaloid Qui trình định lượng đồng thời 08 flavonoid Sen phương pháp CE-PDA 15 Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica nung chảy, 62 cm x 50 µm i.d, dung dịch đệm borax 30 mM hòa tan ACN-H2O (85:15) điều chỉnh pH 8.0 acid boric 5%, nhiệt độ mao quản 30 °C, điện 30 kV; bước sóng phát hiện: 210 nm, kiểu tiêm thủy động học. Thứ tự pic: 1: catechin, 2: isorhamnetin, 3: kaempferol, 4: rutin, 5: isoquercitrin, 6: hyperoside, 7: quercetin, 8: quercetin 3-O-β-D-GlcA. Qui trình định lượng đồng thời 04 alkaloid Sen HPLC-PDA Điều kiện sắc ký thích hợp: cột Phenomenex Gemini RP-C18 (150 mm x 4,6 mm, μm), pha động: ACN – dung dịch TEA 0,1% điều chỉnh đến pH 8,5 dung dịch acid acetic 30%, thể tích tiêm mẫu 2-O-nornuciferin nuciferin isoliensinin pronuciferin 20 μl, bước sóng phát hiện: 272 nm. Chương trình mẫu kiểu gradient. Qui trình định lượng đồng thời 06 flavonoid Sen phương pháp HPLC-PDA 16 Điều kiện sắc ký thích hợp: cột Phenomenex Synergi RP-Fusion (250 mm x 4,6 mm, μm), pha động: ACN- acid formic 0,1% điều chỉnh đến pH 8,5 dung dịch acid acetic 30%, thể tích tiêm kaempferol isorhamnetin quercetin Rutin Quercetin-3-O-D-gln catechin mẫu 20 μl, bước sóng phát hiện: 254 nm. Chương trình mẫu gradient. Qui trình định lượng đồng thời 09 alkaloid tâm Sen phương pháp CE-PDA-MS Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica, 62 cm x 50 µm i.d, đệm amoni acetat 100 mM MeOH/ACN/Nước (70/25/5) với 0,6% acetic băng; nhiệt độ mao quản 30 oC, điện 25 kV, bước sóng phát 225 nm. Tên pic theo thứ tự 1: neferin, 2: liensinin, 3: isoliensinin, 4: nor-armepavin, 5: armepavin, 6: nuciferin, 7: isoliensinin N2’-oxid, 8: isoliensinin N2’-oxid, 9: pronuciferin . Mẫu thử tâm Sen (NN-1a) Mẫu hỗn hợp 09 chuẩn alkaloid 17 Qui trình định lượng đồng thời 06 flavonoid tâm Sen phương pháp CE-PDA Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica (62 cm x 50 µm i.d); dung dịch đệm borax 50 mM hòa tan ACN-H2O (25:75) điều chỉnh pH 8.5 acid boric 5%, nhiệt độ mao quản 30 °C, điện 30 kV, bước sóng phát 210 nm. Thứ tự pic (1: isorhamnetin, 2: calycosin, 3: quercetin 3-O-β-D-glucuronid, 4: scutellarein 7-O-βD-glucuronid metyl ester, 5: vitexin, 6: quercitrin. Qui trình định lượng đồng thời 07 alkaloid tâm Sen phương pháp HPLC-PDA Điều kiện sắc ký thích hợp: cột Phenomenex Synergi RP-Fusion (250 mm x 4,6 mm, μm), pha động: ACN –TEA 0,1% điều chỉnh đến pH 9,0 dung dịch acid acetic 10%, thể tích tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát 282 nm. Mẫu theo chương trình gradient: Qui trình định lượng đồng thời 06 flavonoid tâm Sen phương pháp HPLC-PDA Điều kiện sắc ký thích hợp: cột Phenomenex Synergi RP-Polar (250 x 4,6 mm; μm), thể tích tiêm mẫu 20 μL, bước sóng phát hiện: 254 nm, nhiệt độ cột 35 chương trình gradient. o C, ACN- Acid formic 0,1% theo 18 3.3.3. Khảo sát tính phù hợp hệ thống: quy trình đạt yêu cầu. 3.3.3.4.Thẩm định quy trình phân tích: tiến hành theo hướng dẫn ICH. Tất quy trình đạt yêu cầu tính đặc hiệu; tính tuyến tính (R2 ≥ 0,999); độ xác (RSD kết định lượng ≤ 3,56%); độ với tỷ lệ phục từ 90-107%Error! Reference source not found 3.4. Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích đồng thời alkaloid, flavonoid có mẫu nguyên liệu chế phẩm từ lá, tâm Sen Áp dụng định tính định lượng đồng thời 07 alkaloid Sen 09 alkaloid tâm Sen phương pháp CE-PDS/MS; 08 flavonoid Sen 06 flavonoid tâm Sen CE-PDA; 04 alkaloid Sen 07 alkaloid tâm Sen; 06 flavonoid Sen 06 flavonoid tâm Sen phương pháp HPLC-PDA có 32 mẫu nguyên liệu lá, tâm Sen loài Nelumbo nucifera thu hái vào mùa thu hái khác từ ba vùng miền khác Việt Nam. Bảng 3.68. Kết xác định hàm lượng alkaloid (mg/100 mg) có mẫu nguyên liệu Sen loài Nelumbo nucifera phương pháp CE-PDA/MS HPLC-PDA. Alkaloid Phư ơng phá p caaverin CE CE iso-liensinin armepavin HP LC CE nor-armepavin CE nuciferin CE Mẫu Sen loài N. Nucifera NN-1a NN-1b 0,09 (2,16) 0,17 (1,52) 0,15 (2,05) 0,19 (1,33) 0,17 (2,52) 0,52 (3,21) 0,06 (1,82) 0,12 (1,34) 0,11 (1,12) 0,17 (2,34) 0,15 (2,12) 0,44 (2,57) NN-2a NN-2b - - 0,20 (1,45) 0,18 (1,45) 0,09 (2,21) 0,15 (2,32) 0,60 (3,45) 0,12 (1,89) 0,10 (1,64) 0,06 (1,76) 0,13 (2,60) 0,48 (2,80) NN-3a NN-3b 0,03 (3,29) 0,11 (2,43) 0,10 (0,76) 0,13 (2,36) 0,20 (2,14) 0,44 (3,56) 0,02 (2,31) 0,08 (1,45) 0,06 (0,98) 0,07 (1,67) 0,17 (3,40) 0,34 (3,42) 19 HP LC CE 2-O-nor nuciferin HP LC CE pronuciferin HP LC 0,50 (1,42) 0,21 (2,15) 0,23 (2,56) 0,10 (2,34) 0,11 (1,52) 0,43 (2,02) 0,13 (3,48) 0,09 (1,78) 0,06 (3,75) 0,07 (2,15) 0,42 (2,05) 0,07 (3,21) 0,07 (1,98) 0,03 (3,22) 0,03 (1,63) 0,55 (1,15) 0,14 (3,62) 0,15 (2,04) 0,06 (3,21) 0,09 (1,26) 0,38 (3,09) 0,16 (3,21) 0,15 (2,14) 0,01 (3,12) 0,02 (2,32) 0,28 (1,23) 0,03 (2,45) 0,08 3,25) - Bảng 3.70. Kết xác định hàm lượng flavonoid (mg/100 mg) có mẫu nguyên liệu Sen loài Nelumbo nucifera phương pháp CE-PDA HPLC-PDA. Flavonoid CE catechin HPLC CE isorhamnetin HPLC CE kaempferol HPLC CE rutin HPLC isoquercitrin CE hyperin CE CE quercetin HPLC quercetin O-β-D-GlcA Σ 3- CE HPLC NN-1a 0,16 (2,46) 0,15 (1,86) 0,08 (1,56) 0,09 (3,08) 0,14 (1,78) 0,14 (3,09) 0,19 (2,50) 0,17 (1,62) 0,31 (3,24) 0,35 (2,15) 0,09 (2,34) 0,14 (2,42) 1,68 (1,45) 1,60 (1,63) 3,14 Mẫu Sen loài N. Nucifera NN-1b NN-2a NN-2b NN-3a 0,09 0,13 0,09 0,21 (1,89) (3,15) (3,05) (5,09) 0,10 (1,53) 0,03 (1,69) 0,04 (2,87) 0,11 (2,12) 0,12 (2,82) 0,02 (4,14) 0,06 (1,76) 0,26 (4,57) 0,27 (3,48) 0,04 (3,75) 0,08 (4,32) 1,34 (2,16) 1,23 (1,97) 2,08 0,07 (1,49) NN-3b 0,05 (2,38) 0,19 (1,92) 0,04 (1,65) - - - - - - - - - - - - - - 0,13 (2,32) 0,11 (2,43) 0,33 (3,96) 0,46 (3,65) 0,08 (3,24) 0,09 (1,84) 1,30 (1,78) 1,34 (1,86) 2,26 0,08 (2,67) 0,05 (2,05) 0,21 (2,80) 0,28 (3,23) 0,03 (3,20) 0,03 (2,17) 0,54 (0,97) 0,55 (1,91) 0,89 0,18 (3,14) 0,19 (3,12) 0,39 (3,56) 0,53 (3,22) 0,21 (4,12) 0,18 (4,05) 0,80 (2,31) 0,76 (1,54) 1,01 0,15 (3,45) 0,10 (1,86) 0,12 (4,43) 0,23 (3,45) 0,12 (3,78) 0,09 (2,75) 0,44 (0,75) 0,41 (1,39) 0,72 - - 20 Chương 4: BÀN LUẬN 4.1. Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ tâm Sen Chiết xuất: Trong trình phân lập alkaloid lá, tâm Sen, chiết phân bố với CHCl3 (ở pH ≥ 8) để thu tủa alkaloid toàn phần gặp nhiều khó khăn tượng tạo nhiều nhũ. Đây trở ngại lớn trình nghiên cứu. Để khắc phục, thử nghiệm khảo sát với hai phương pháp chiết đặc hiệu cho alkaloid cách cho tạo cặp ion với acid màu hữu Helianthin chọn phương pháp tạo tủa alkaloid với thuốc thử Bertrand. Phương pháp thứ cho hiệu tốt thu đặc hiệu tất alkaloid từ phân cực đến phân cực, tạp tránh khó khăn việc tạo nhũ chiết với dung môi hữu môi trường kiềm. Phân lập: Kết nghiên cứu luận án sử dụng phương pháp sắc ký khác với nhiều loại pha tĩnh khác như: silica gel; Sephadex LH-20; silica gel ghép C-18, C-8; trao đổi cation cho việc phân lập alakloid, flavonoid lá, tâm Sen. Đặc biệt, phương pháp sắc ký phân bố ly tâm nhanh (FCPC) lần sử dụng để phân lập hai alkaloid EN-4 EN-5 (có độ phân cực mạnh) từ tâm Sen. Hai pha không đồng tan thích hợp lựa chọn CHCl3-MeOH-TEA 0,2 % (12:5:3) với pha động pha pha tĩnh pha trên, giúp phân lập thành công hai gen-alkaloid này. Bên cạnh đó, trình nghiên cứu thu isoliensinin (EN-1: 17,6 g) phương pháp kết tinh pH nhiệt độ phù hợp trình chiết phân bố lỏng-lỏng theo gradient pH nguyên liệu tâm Sen. Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, thu lượng 21 nhiều tinh chế lại cho độ tinh khiết cao mà phân lập phương pháp sắc ký gần không thực qui mô PTN. Xác định cấu trúc: Luận án góp phần xây dựng liệu phổ học gồm phổ UV, IR, MS, NMR 16 alkaloid, 12 flavonoid từ tâm Sen, sở liệu phổ học quan trọng cho công trình nghiên cứu thành phần hóa học Sen dấu hiệu đặc biệt giúp dễ dàng định danh alkaloid thuộc bốn khung aporphin, proaporphin, bisbenzylisoquinolin, benzylisoquinolin flavonoid nhóm flavonol, phân biệt chất khung. 4.2. Qui trình định tính định lượng alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen Các nghiên cứu định tính, định lượng luận án sử dụng hai phương pháp phân tích đại LC CE ghép nối với đầu dò PDA hay MS cho kết với độ tin cậy, tính đặc hiệu, độ xác, độ nhạy cao (ng/mL-pg/mL) khác biệt nhiều kết nghiên cứu hai phương pháp Việc phát triển phương pháp phân tích thực theo hướng dẫn ICH dựa hiểu biết tính chất lý hóa thành phần phân tích alkaloid, flavonoid chất pha tỉnh, pha động sắc ký điện di để khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến tách (As Rs) sắc ký như: loại dung môi, tỉ lệ dung môi pha động, pH, điều nhiệt cho cột, bước sóng phân tích,…hay tách điện di mao quản như: loại dung dịch đệm, nồng độ, pH dung dịch đệm, dung môi bổ trợ (ACN, MeOH, THF…), chất nồng độ chất diện hoạt, điện áp dụng, nhiệt độ mao quản,,… 4.3. Ứng dụng qui trình định lượng để xác định chất lượng nguồn nguyên liệu chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen 22 Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng alkaloid, flavonoid có lá, tâm Sen vào mùa thu hái Sen (tháng 6-9 năm) cao nghịch mùa thu hái (các tháng lại năm), kết góp phần khẳng định thời gian thu hái Sen theo dân gian hoàn toàn phù hợp. Điều kiện thổ nhưỡng khí hậu khác vùng thu hái (miền Nam nóng ẩm, mưa nhiều vùng đất phù sa; miền Trung nóng khô, đất cát biển; Cao Nguyên Trung Bộ khí hậu mát đến lạnh miền Bắc chủ yếu lạnh, khô .) ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng alkaloid, flavonoid có lá, tâm Sen. Góp phần đưa dẫn cho việc trồng trọt việc thu hái lá, tâm Sen để thu thành phần alkaloid, flavonoid mong muốn với chất lượng tốt nhất. KẾT LUẬN Luận án hoàn thành mục tiêu đề ban đầu: 1. Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid Luận án phân lập 35 hợp chất: 21 alkaloid 18 flavonoid. Từ Sen: 10 alkaloid: nuciferin, 2-O-nornuciferin, caaverin, asimilobin, apoglaziovin, norarmepavin, armepavin, pronuciferin, pronuciferin N-oxid, isoliensinin; 08 flavonoid: quercetin, isoquercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA, hyperin, isorhamnetin, kaempferol, rutin, catechin. Từ tâm Sen: 11 alkaloid: isoliensinin, liensinin, neferin, isoliensinin N2’ oxid, isoliensinin N2 oxid, norarmepavin, armepavin, N-methyl coclaurin, lotusin, nuciferin, pronuciferin; 06 flavonoid: calycosin, isorhamnetin, vitexin, scutellarein 7-O-β-D-GlcA methyl ester, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA. Trong số 28 cấu trúc xác định có: 23 - 02 alkaloid hợp chất (EN-4 EN-5), lần công bố phân lập từ thực vật, cấu trúc xác định đề nghị đặt tên isoliensinin N2’-oxid isoliensinin N2-oxid. - 05 hợp chất công bố có dược liệu khác lần phân lập từ Sen: 02 alkaloid (pronuciferin N-oxid apoglaziovin); 03 flavonoid (calycosin, scutellarein 7O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin). - 02 alkaloid lần công bố từ Sen (isoliensinin, norarmepavin); 03 alkaloid (nuciferin, armepavin, norarmepavin) 03 flavonoid (isorhamnetin, quercitrin, quercetin 3-O-β-DGlcA) lần công bố từ tâm Sen. 2. Thiết lập chất đối chiếu 06 chất đối chiếu, bao gồm: nuciferin, 2-O-nornuciferin, liensinin, isoliensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA có nguồn gốc từ cao chiết tâm Sen thiết lập công bố đạt yêu cầu CĐC hóa học thứ cấp với liệu chuẩn bao gồm điểm chảy, suất quay cực, phổ UV, IR, MS, NMR. 3. Quy trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alcaloid, flavonoid có lá, tâm Sen Xây dựng thẩm định đạt yêu cầu 08 quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời alkaloid hay flavonoid có nguyên liệu lá, tâm Sen phương pháp HPLC/PDA CE-PDA-MS. Các qui trình chưa công bố tác giả nào. 4. Ứng dụng qui trình định lượng để đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen Các qui trình định tính, định lượng ứng dụng để kiểm soát chất lượng 32 mẫu nguyên liệu Sen 32 mẫu nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) thu hái vào mùa thu hái khác từ ba vùng 24 miền khác Việt Nam chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen lưu hành thị trường. Xác định đặc tính điểm tâm Sen: xây dựng SKĐ điện di đồ dấu vân tay phương pháp SKLM, HPLC-PDA, CE-PDA/MS giúp xác định đặc tính điểm chỉ, nhận dạng lá, tâm Sen vùng miền Việt Nam. KIẾN NGHỊ Các kết đạt nêu sở khoa học để thực hướng nghiên cứu sâu cho dược liệu lá, tâm Sen: 1. Cơ sở khoa học góp phần nâng cấp “Chuyên luận dược liệu lá, tâm Sen” cho Dược điển Việt Nam lần xuất tới. 2. Tiến hành tối ưu hóa công thức bào chế viên nang chứa cao định chuẩn alkaloid, flavonoid co kiểm soát hàm lượng thành phần có tác dụng sinh học. 3. Tiến hành thử nghiệm in vivo tác dụng tâm tác dụng kháng khối u, kích thích miễn dịch alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có tâm Sen tác dụng hạ đường huyết alkaloid khung aporphin có Sen. [...]... Ứng dụng các qui trình định tính, định lượng để phân tích đồng thời các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm từ lá, tâm Sen Áp dụng định tính và định lượng đồng thời 07 alkaloid trong lá Sen và 09 alkaloid tâm Sen bằng phương pháp CE-PDS/MS; 08 flavonoid trong lá Sen và 06 flavonoid tâm Sen bằng CE-PDA; 04 alkaloid trong lá Sen và 07 alkaloid tâm Sen; 06 flavonoid trong lá Sen. .. thời các alcaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 08 quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời các alkaloid hay flavonoid có trong nguyên liệu lá, tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA và CE-PDA-MS Các qui trình này chưa từng được công bố bởi tác giả nào 4 Ứng dụng qui trình định lượng để đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu và các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen. .. lượng các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen Góp phần đưa ra các chỉ dẫn cho việc trồng trọt cũng như việc thu hái lá, tâm Sen để thu được thành phần alkaloid, flavonoid mong muốn với chất lượng tốt nhất KẾT LUẬN Luận án đã hoàn thành các mục tiêu đề ra ban đầu: 1 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid Luận án đã phân lập được 35 hợp chất: 21 alkaloid và 18 flavonoid Từ lá Sen: ... không có sự khác biệt nhiều về kết quả nghiên cứu giữa hai phương pháp Việc phát triển phương pháp phân tích được thực hiện theo hướng dẫn của ICH và dựa trên sự hiểu biết về tính chất lý hóa của thành phần phân tích alkaloid, flavonoid cũng như bản chất pha tỉnh, pha động trong sắc ký và điện di để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tách (As và Rs) trong sắc ký như: loại dung môi, tỉ lệ dung môi... Sen Các qui trình định tính, định lượng được ứng dụng để kiểm soát chất lượng 32 mẫu nguyên liệu lá Sen và 32 mẫu nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) được thu hái vào mùa thu hái khác nhau từ ba vùng 24 miền khác nhau của Việt Nam và các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen đang lưu hành trên thị trường Xác định đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen: xây dựng được các SKĐ và điện di đồ dấu vân tay bằng phương. .. luận án cũng đã sử dụng các phương pháp sắc ký khác nhau với nhiều loại pha tĩnh khác nhau như: silica gel; Sephadex LH-20; silica gel ghép C-18, C-8; trao đổi cation cho việc phân lập các alakloid, flavonoid trong lá, tâm Sen Đặc biệt, phương pháp sắc ký phân bố ly tâm nhanh (FCPC) lần đầu tiên được sử dụng để phân lập hai alkaloid mới EN-4 và EN-5 (có độ phân cực mạnh) từ tâm Sen Hai pha không đồng tan... phân tích, …hay sự tách trong điện di mao quản như: loại dung dịch đệm, nồng độ, pH của dung dịch đệm, dung môi bổ trợ (ACN, MeOH, THF…), bản chất và nồng độ chất diện hoạt, điện thế áp dụng, nhiệt độ mao quản,,… 4.3 Ứng dụng qui trình định lượng để xác định chất lượng nguồn nguyên liệu và các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen 22 Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng các alkaloid, flavonoid có trong lá,. .. mà khi phân lập bằng các phương pháp sắc ký gần như không thực hiện được ở qui mô PTN Xác định cấu trúc: Luận án đã góp phần xây dựng các bộ dữ liệu phổ học gồm phổ UV, IR, MS, NMR của 16 alkaloid, 12 flavonoid từ lá và tâm Sen, cơ sở dữ liệu phổ học quan trọng cho các công trình nghiên cứu thành phần hóa học của cây Sen và chỉ ra những dấu hiệu đặc biệt giúp dễ dàng định danh các alkaloid thuộc bốn... bisbenzylisoquinolin, benzylisoquinolin và flavonoid nhóm flavonol, phân biệt các chất trong cùng khung 4.2 Qui trình định tính và định lượng alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen Các nghiên cứu định tính, định lượng trong luận án đã sử dụng hai phương pháp phân tích hiện đại là LC và CE ghép nối với đầu dò PDA hay MS cho kết quả với độ tin cậy, tính đặc hiệu, độ chính xác, độ nhạy cao (ng/mL-pg/mL) và không có sự khác... LUẬN 4.1 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen Chiết xuất: Trong quá trình phân lập alkaloid lá, tâm Sen, khi chiết phân bố với CHCl3 (ở pH ≥ 8) để thu tủa alkaloid toàn phần sẽ gặp rất nhiều khó khăn do hiện tượng tạo quá nhiều nhũ Đây là một trở ngại rất lớn trong quá trình nghiên cứu Để khắc phục, thử nghiệm khảo sát với hai phương pháp chiết đặc hiệu . chế phẩm từ Sen là một việc làm cấp thiết. Với những lý do trên, đề tài Nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm Sen và các chế phẩm . VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN. trong lá, tâm Sen bằng phương pháp HPLC và CE. 4. Áp dụng qui trình để đánh giá thành phần, hàm lượng các alkaloid và flavonoid trong lá, tâm Sen được thu hái từ các tỉnh, thành khác nhau và