TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN HỮU TÀI KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN PHỤ PHẨM CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) BẰNG ENZYME NEUTRASE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN HỮU TÀI KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN PHỤ PHẨM CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) BẰNG ENZYME NEUTRASE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM CÁN BỘ HƢỚNG DẪN TS. NGUYỄN CÔNG HÀ ThS. PHAN NGUYỄN TRANG 2014 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Sau tháng thực luận văn tốt nghiệp phòng thí nghiệm, đề tài “Khảo sát trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius hyphophthalmus) enzyme Neutrase” hoàn thành thời hạn với giúp đỡ, dẫn chia sẻ cán hướng dẫn, cán quản lý phòng thí nghiệm tập thể anh chị bạn làm việc phòng thí nghiệm. Nhân đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Công Hà cô Phan Nguyễn Trang tận tình dẫn truyền đạt kinh nghiệm góp ý quý báu suốt thời gian học tập thực nghiệm vừa qua. Bên cạnh đó, em xin cảm ơn anh Tạ Hùng Cường, chị Nguyễn Tố Mai tập thể anh chị Cao học, bạn lớp Công nghệ Thực phẩm khóa 37. Đồng thời, em xin cảm ơn chị Nguyễn Phụng Tiên cán quản lý phòng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi có thể, cho em lời động viên giúp em hoàn thành tốt đề tài này. Hơn nữa, Em xin cảm ơn anh chị phòng thí nghiệm Sinh học Đất hỗ trợ giúp đỡ em tận tình lúc sử dụng thiết bị, máy móc phòng thí nghiệm. Em biết ơn giúp đỡ anh chị bạn. Em xin cảm ơn người nhiều. Sau em, xin cảm ơn Ban quản lý Công ty CP XNK Thủy sản Cần Thơ (CASEAMEX) hỗ trợ nguyên liệu cho em để thực đề tài này. Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Hữu Tài Ngành Công nghệ Thực phẩm i Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Nhằm khảo sát trình thủy phân chất phụ phẩm cá tra enzyme Neutrase, từ tìm thông số động học Km, Vmax enzyme ảnh hưởng thời gian phản ứng nồng độ enzyme chất lên hiệu suất thủy phân, đề tài tiến hành với nội dung:  Xác định thông số động học Km Vmax enzyme Neutrase chất phụ phẩm cá tra, tìm tỷ lệ khối lượng enzyme: chất (mg enzyme : g protein) tốc độ phản ứng enzyme lớn (trong thể tích cố định dịch đệm phosphate pH 6,5 10 mL).  Khảo sát tác động việc tăng tuyến tính đồng thời khối lượng enzyme chất, dựa tỷ lệ khối lượng enzyme: chất tìm (trong thể tích cố định dịch đệm phosphate pH 6,5 10 mL) lên hiệu suất thủy phân enzyme Neutrase.  Sau đó, đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu suất thủy phân Neutrase, nhằm tìm thời gian tối ưu để hiệu suất thủy phân đạt cao nhất. Và qua trình thực nghiệm, đề tài thu kết sau:  Enzyme Neutrase hoạt động chất phụ phẩm cá tra với thông số động học Vmax = 0,190 μmol tyrosine/phút, Km = 0,254 g protein, với tỷ lệ khối lượng enzyme: chất = 0,5 mg enzyme: 0,694 protein tốc độ phản ứng enzyme lớn nhất.  Việc tăng đồng thời khối lượng enzyme chất (với thể tích phản ứng cố định) sở tỷ lệ khối lượng enzyme: chất tối ưu gây ức chế hoạt động enzyme nên cặp khối lượng enzyme : chất thích hợp chọn 0,5 mg E : 0,694 g Pro.  Khi thời gian phản ứng kéo dài từ 30 đến 240 phút, hiệu thủy phân tăng nhanh vào giai đoạn đầu sau tăng chậm lại đạt mức cao 240 phút (6,359 % theo tyrosine 3,244 % theo phương pháp OPA) nên thời gian thủy phân hiệu chọn 240 phút. Ngành Công nghệ Thực phẩm ii Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp khác. Cần Thơ, ngày Cán hướng dẫn TS. Nguyễn Công Hà năm 2014 Người viết ThS. Phan Nguyễn Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm tháng iii Nguyễn Hữu Tài Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT . ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC . iv DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii Chƣơng GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Chƣơng LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU . 2.1 Sơ lược cá tra 2.2 Thành phần hóa học cá tra . 2.2.1 Protein . 2.2.2 Thành phần trích ly chứa nitơ phi protein 2.2.3 Enzyme . 2.2.4 Lipid 2.2.5 Carbohydrate . 2.2.6 Vitamin khoáng chất 2.2.7 Phụ phẩm chế biến cá tra . 2.3 Sơ lược protein 2.3.1 Biến tính protein . 2.4 Sơ lược enzyme 10 2.4.1 Cấu trúc enzyme . 10 2.4.2 Động học enzyme . 10 2.4.3 Cơ chế thủy phân enzyme 11 2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác enzyme . 12 2.4.5 Enzyme Neutrase 16 2.5 Máy quang phổ 17 2.6 Thuốc thử Folin-Ciocalteu . 17 2.7 Trichloroacetic acid (TCA) 18 2.8 Phương pháp OPA . 19 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Phương tiện nghiên cứu . 20 3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 20 3.1.2 Nguyên liệu . 20 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ . 20 3.1.4 Hóa chất 21 3.2 Phương pháp nghiên cứu . 21 3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu 21 3.2.2 Phương pháp thủy phân protein enzyme 22 3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm 22 3.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số . 22 3.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng lipid 22 Ngành Công nghệ Thực phẩm iv Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng tyrosine tổng số . 22 3.2.7 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân theo lượng tyrosine sinh 23 3.2.8 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân theo hàm lượng đạm amine . 23 3.2.9 Phương pháp xử lý số liệu 23 3.3 Nội dung bố trí thí nghiệm . 23 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định thông số động học enzyme Neutrase chất phụ phẩm cá tra . 23 3.3.2 Thí nghiệm : Xác định khối lượng enzyme tối ưu dựa tỷ lệ enzyme : chất tối ưu 25 3.3.3 Thí nghiệm : Xác định thời gian thủy phân tối ưu . 27 Chƣơng KẾT QUẢ THẢO LUẬN 30 4.1 Thành phần hóa học nguyên liệu 30 4.2 Các thông số động học của enzyme Neutrase chất phụ phẩm cá tra 31 4.3 Xác định khối lượng enzyme : chất tối ưu dựa tỷ lệ khối lượng enzyme : chất tối ưu Neutrase chất phụ phẩm cá tra 32 4.4 Xác định thời gian phản ứng tối ưu trình thủy phân enzyme Neutrase . 34 Chƣơng KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Đề nghị . 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 39 PHỤ LỤC 41 Ngành Công nghệ Thực phẩm v Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Phần trăm phần thu chế biến cá tra (Pangasius hypophthalmus) phi lê Bảng 4.1 Thành phần hóa học nguyên liệu . 30 Bảng 4.2 Thành phần hóa học cá tra (Pangasius hypophthalmus) phi lê . 31 Bảng 4.3 Thành phần hóa học phụ phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) 31 Bảng 4.4 Hiệu suất thủy phân (tính theo hàm lượng tyrosine) Neutrase hệ số nhân khác . 33 Bảng 4.5 Hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) Neutrase hệ số nhân khác . 33 Bảng 4.6 Hiệu suất thủy phân Neutrase theo thời gian phản ứng . 34 Bảng 5.1 Công thức hóa chất để xây dựng đường chuẩn tyrosine 43 Bảng 5.2 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân (tính theo tyrosine) theo cặp enzyme: chất khác 48 Bảng 5.3 Kiểm định LSD Hiệu suất thủy phân theo cặp enzyme: chất khác . 48 Bảng 5.4 Phân tích phương sai hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) theo cặp enzyme: chất khác . 49 Bảng 5.5 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) theo cặp enzyme: chất khác . 49 Bảng 5.6 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân tính theo tyrosine theo thời gian phản ứng _ thí nghiệm . 49 Bảng 5.7 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân theo tyrosine theo thời gian phản ứng _ thí nghiệm 49 Bảng 5.8 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân tính theo pp OPA theo thời gian phản ứng 50 Bảng 5.9 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân theo pp OPA theo thời gian phản ứng . 50 Ngành Công nghệ Thực phẩm vi Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Sản phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) nguyên . Hình 2.2 Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) Hình 2.3 Cá Ba sa (Pangasius bocourti) . Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis-Menten . 11 Hình 2.5 Phản ứng xúc tác đơn giản enzyme 12 Hình 2.6 Ảnh hưởng nồng độ chất đến tốc độ phản ứng. 13 Hình 2.7 Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng enzyme vào nhiệt độ 14 Hình 2.8 Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng enzyme vào pH . 15 Hình 2.9 Trichloroacetic acid 19 Hình 2.10 Phản ứng theo phương pháp OPA 19 Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 25 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm (với thuốc thử Folin-Ciocalteu) . 27 Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm (với thuốc thử Folin-Ciocalteu) . 28 Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tốc độ phản ứng vào lượng chất 32 Hình 4.2 Hiệu suất thủy phân Neutrase theo thời gian phản ứng . 35 Hình 4.3 Ảnh chụp gel chạy điện di dịch protein thủy phân Neutrase 35 Hình 5.1 Đường chuẩn tyrosine . 44 Ngành Công nghệ Thực phẩm vii Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Chƣơng GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong năm gần đây, cá tra trở thành mặt hàng chế biến xuất vượt trội nhiều so với loài thủy sản khác nước ta. Con cá tra góp phần giải vấn đề việc làm cho người lao động với xuất ngày nhiều nhà máy, xí nghiệp chế biến xuất mặt hàng thủy sản này. Tuy nhiên, bên cạnh thu cho đất nước nguồn thu từ việc xuất cá tra phi lê sản phẩm khác từ cá tra, tăng lên lĩnh vực nuôi trồng lẫn chế biến cá tra xuất đồng thời tạo lượng phụ phẩm, phần lại sau thu lấy phần phi lê cá để xuất khẩu, lớn. Do đó, quy mô sản xuất chế biến mặt hàng cá tra ngày mở rộng, lượng phụ phẩm thải ngày nhiều hơn. Nếu lượng phụ phẩm không xử lý cách gây ô nhiễm nặng nề cho môi trường. Mặt khác, nguồn phụ phẩm giá trị dinh dưỡng tương đối cao. Nếu tận dụng nguồn phế liệu tạo nguồn thu nhập cho người sản xuất, giảm thiểu lãng phí tăng hiệu suất thu hồi chất dinh dưỡng sản xuất, chế biến sản phẩm từ cá tra. Về hướng xử lý phụ phẩm mặt hàng thủy sản, sử dụng phần bỏ sau chế biến cá tra phi lê để chế biến bột cá dùng chăn nuôi, bong bóng cá dùng làm thực phẩm, dầu cá giàu dinh dưỡng không chứa cholesterol, nhiên liệu sinh học (biodiesel), … Tuy nhiên, hướng xử lý chưa tận dụng nguồn protein lại cách hiệu quả. Gần hướng xử lý quan tâm chế biến sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm cá, tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, sử dụng thực phẩm. Tuy nhiên, nghiên cứu hướng xử lý loài cá khác phổ biến cá tra hạn chế. Vì vậy, đề tài “Khảo sát thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) enzyme Neutrase” tiến hành. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài “Khảo sát trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) enzyme Neutrase” tiến hành nhằm mục tiêu tìm thông số tối ưu cho trình thủy phân tỷ lệ khối lượng enzyme: chất, khối lượng enzyme chất tối đa sử dụng (trên thể tích phản ứng) thời gian thủy phân tối ưu để thu hiệu suất thủy phân cao nhất. Ngành Công nghệ Thực phẩm Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Qua kết điện di cho thấy, Neutrase thủy phân protein từ phụ phẩm cá tra thời gian 30 phút 90 phút chưa triệt để trường hợp enzyme với chất thịt dè cá tra thí nghiệm Tạ Hùng Cường (2014). Ban đầu protein chưa bị thủy phân mạch peptide có trọng lượng phân tử lớn từ 30 đến 250 kDa. Qua trình thủy phân Neutrase, enzyme với đặc tính phân cắt protein liên kết hình thành amino acid kỵ nước, tạo đoạn peptide ngắn (Hou and Zhao, 2011) với khoảng thời gian thủy phân 30 phút, sản phẩm thủy phân chủ yếu peptide mạch ngắn ban đầu với trọng lượng phân tử 50 kDa. Và sau đó, với khoảng thời gian thủy phân 90 phút, peptide mạch ngắn amino acid với trọng lượng phân tử 30 kDa sản sinh nhiều hơn. Mặc khác, so với trình thủy phân enzyme Papain (trong đề tài nhóm thực Thái Văn Trọng) Bromelain (Nguyễn Thị Bích Phương, đề tài nhóm) chất phụ phẩm cá tra, Neutrase tỏ thích hợp việc ứng dụng vào việc sản xuất peptide mạch ngắn amino acid thời gian thủy phân 30 90 phút. Chúng thủy phân chưa triệt để Papain Bromelain. Bên cạnh đó, từ Hình 4.2 cho thấy hiệu suất thủy phân tính theo tyrosine tăng dần theo thời gian phản ứng. Tuy nhiên, hiệu suất thủy phân tăng nhanh giai đoạn khoảng 120 phút đầu (từ 2,702% 30 phút lên 5,228% 120 phút) sau tăng chậm đến hiệu suất thủy phân đạt cao 240 phút phản ứng (6,359%). Thời gian thủy phân dài, hiệu suất thủy phân tăng lúc chậm. Điều giải thích trình thủy phân sinh peptide mạch ngắn amino acid hòa tan vào dung dịch phản ứng. Do tăng lên ngày nhiều peptide mạch ngắn amino acid ức chế hoạt tính enzyme nên thời gian thủy phân dài hoạt tính enzyme giảm (Nguyễn Xuân Trình ctv., 2009). Mặt khác, theo nghiên cứu Cao Xuan Thuy et al.(2011) sử dụng enzyme Alcalase 2.4 L để thủy phân phụ phẩm từ cá tra cho thấy thời gian thủy phân dài, sản phẩm trình thủy phân có peptide mạch ngắn sản sinh nhiều. Tuy nhiên, phản ứng xảy với tốc độ tương đối lớn giai đoạn đầu, khoảng từ 30 đến 120 phút thủy phân, thể qua tăng lên đáng kể số phần trăm peptide hình thành (Peptide form yield) từ 12,87 đến 22,10%. Nhưng sau đó, thời gian thủy phân kéo dài đến 150 phút tốc độ phản ứng chậm lại kèm theo Ngành Công nghệ Thực phẩm 36 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ số phần trăm peptide hình thành thay đổi không đáng kể, từ 22,10% 150 phút tăng lên đến 22,20% 210 phút. Hiện tượng tác giả giải thích kéo dài thời gian thủy phân, lượng chất ngày giảm lượng sản phẩm hình thành ngày nhiều. Chính sản phẩm trình thủy phân ức chế hoạt động enzyme, làm cho tốc độ phản ứng bị giảm. Cũng chất phụ phẩm cá tra enzyme sử dụng Alcalase 2,4 L, Nguyen Phuoc Minh (2014) khảo sát khoảng thời gian thủy phân 210 phút thông qua hàm lượng nitrogen amino acid sinh (g/L). Kết cho thấy hàm lượng nitrogen amino acid sinh nhanh giai đoạn đầu (4,60 g/L 30 phút lên đến 6,62 120 phút) thời gian thủy phân kéo dài 180 phút, trình sản sinh nitrogen amino acid chậm lại (6,92 g/L 180 phút 6,90 g/L 210 phút). Do đó, thời gian thủy phân hiệu enzyme Neutrase chọn 240 phút. 4.5 Ngành Công nghệ Thực phẩm 37 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Chƣơng KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Theo kết từ khảo sát, đề tài rút kết luận sau :  Hằng số phân ly hiệu Km tốc độ phản ứng cực đại Vmax enzyme Neutrase xác định 0,254 g protein 0,190 μmol tyrosine/phút  Tỷ lệ enzyme : chất để tốc độ phản ứng thủy phân enzyme đạt cực đại 0,5 mg enzyme : 0,694 g protein phụ phẩm cá tra 10 mL dung dịch đệm phosphate.  Thời gian thủy phân để enzyme cho hiệu suất thủy phân cao 240 phút. 5.2 Đề nghị Do điều kiện thời gian có phần hạn chế nên để đề tài hoàn thiện hơn, xin đề nghị nghiên cứu tiến hành thực khảo sát sau :  Kiểm tra hoạt tính enzyme sau thời gian bảo quản phòng thí nghiệm  Cải thiện hiệu kinh tế cách tìm p0hương pháp để sử dụng lại nhiều lần nguồn enzyme.  Khảo sát hiệu suất thủy phân thời gian phản ứng dài hơn. Ngành Công nghệ Thực phẩm 38 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Blainski, A., G.C. Lopes and J.C.P.D. Mello, 2013. Application and analysis of the Folin Ciocalteu Method for the determination of the total phenolic content from Limonium Brasiliense L. 2. Folin, O. and V., Ciocalteu, 1927. On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. J. Biol. Chem., 73: 627-650. 3. Folin, O. and W., Denis, 1912a. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J. Biol. Chem., 12: 239-243. 4. Folin, O. and W., Denis, 1912b. Tyrosine in proteins as determined by a new colorimetric method. J. Biol. Chem., 12: 245-251. 5. Hoàng Kim Anh, 2007. Hóa học thực phẩm. Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật. Hà Nội. 384 trang. 6. Lê Ngọc tú, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu Nguyễn Trọng Cẩn, 2003. Hóa học thực phẩm. Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật. Hà Nội. 292 trang. 7. Nguyễn Công Hà Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011. Giáo trình Kỹ thuật Thực phẩm (Quá trình sinh hóa chế biến thực phẩm). Nhà xuất Đại học Cần Thơ. Cần Thơ. 108 trang. 8. Nguyễn Huỳnh Quang Diệu, 2013. Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất bột đạm amine từ đầu tôm bromelain vỏ khóm. Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ. Cần Thơ. 9. Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2013. Tìm hiểu cấu tạo, nguyên tắc hoạt động ứng dụng máy quang phổ. Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Sư phạm Vật lý, Đại học Cần Thơ. Cần Thơ. 10. Nguyen Thi My Huong, K.S.B., Sylla, Z., Randriamahatody, C., DonnayMoreno, J., Moreau, Tran Thi Luyen and J.P., Bergé, 2011. Enzymatic hydrolysis of yellowfin Tuna (Thunnus albacares) by-products using protamex protease. Food technol. Biotechnol., 49 (1): 48-55. 11. Nguyễn Thị Thu Thủy Nguyễn Công Hà, 2009. Giáo trình thực tập hóa học thực phẩm. Tủ sách Đại học Cần Thơ. 24 trang. 12. Nguyễn Thị Thu Thủy, 2009. Giáo trình hóa học thực phẩm. Tủ sách Đại học Cần Thơ.104 trang. 13. Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011. Bài giảng hóa học thực phẩm. Tủ sách Đại học Cần Thơ. 138 trang. 14. Nguyễn Văn Mùi, 2001. Thực hành hóa sinh học. Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội. Hà Nội. 176 trang. 15. Nielsen, P.M., D., Petersen and C., Dambmann, 2001. Improved method for determininng food protein degree of hydrolysis. Journal of Food Science, 66(5): 642-646. 16. Ovissipour, M., M., Taghiof, A., Motamedzadegan, B., Rasco. and A.E., Molla, 2009. Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins of beluga sturgeon Huso huso using Alcalase. Int Aquat Res, 1: 31-38. Ngành Công nghệ Thực phẩm 39 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ 17. Pagán, J., A., Ibarz, V., Falguera and R., Benítez, 2013. Enzymatic hydrolysis kinetics and nitrogen recovery in the protein hydrolysate production from pig bones. Journal of Food Engineering, 119(3): 655659. 18. Phan Thị Thanh Quế, 2006. Giáo trình công nghệ chế biến thủy hải sản. Tủ sách Đại học Cần Thơ. 114 trang. 19. Tran Trung Tuan, 2010. Tra catfish (Pangasius hypophthalmus) residue meals as protein sources for growing pigs. MSc. thesis. Department of Animal Husbandry and Veterinary Science, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Angiang University (AGU), Angiang Province, Vietnam. 20. Hou, Y. and X.H., Zhao, 2011. Limited hydrolysis of two soybean protein products with trypsin or neutrase and the impacts on their solubility, gelation and fat absorption capacity. Biotechnology, 10(2): 190-196. 21. Nguyễn Xuân Trình, Trần Hải Yến Trần Thị Anh Thư, 2009. Nghiên cứu công nghệ sản xuất dịch đạm, bột cá từ phụ phẩm cá tra cá basa. Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại học Công nghệ Sài Gòn. Thành phố Hồ Chí Minh. 22. Cao Xuan Thuy, Tran Bich Lam and Ha Thanh Toan, 2011. Hydrolysis of Pangasius hypophthalmus by-product to peptide form. Food Bioprocess Technol, 8/2011 23. Nguyen Phuoc Minh, 2014. Utilization of Pangasius hypophthalmus byproduct to produce protein hydrolysate using alcalase enzyme. Journal of Harmonized Research in Applied Sciences, 2(3): 250-256. 24. Tạ Hùng Cường, 2014. Nghiên cứu chế biến bột protein thủy phân từ thịt dè cá tra. Luận văn Cao học ngành Công nghệ Thực phẩm Đồ uống khóa 19. Trường Đại học Cần Thơ. Cần Thơ. Tài liệu website tham khảo https://voer.edu.vn/m/ca-tra/121677d6. Truy cập ngày 19/10/2014. http://www.caseamex.com.vn/Images/Product/casemexProductFull_d1h.jpg. Truy cập ngày 19/10/2014. http://www.pangasius-vietnam.com/Uploads/image/Nguyen-Thi-NgocThuy/image/cau%205.JPG. Truy cập ngày 19/10/2014. http://www.pangasius-vietnam.com/Uploads/image/Nguyen-Thi-NgocThuy/image/cau%205_1.JPG. Truy cập ngày 19/10/2014. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2e/Trichloroacetic_ acid_structure.svg/512px-Trichloroacetic_acid_structure.svg.png. Truy cập ngày 29/11/2014. http://en.wikipedia.org/wiki/Trichloroacetic_acid. Truy cập ngày 29/11/2014. http://www.worthington-biochem.com. Truy cập ngày 10/08/2014. Ngành Công nghệ Thực phẩm 40 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC A. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LIPID TRONG THỰC PHẨM DẠNG RẮN THEO PHƢƠNG PHÁP SOXHLET: Nguyên tắc Dựa khả hòa tan lipid dung môi hữu không phân cực, dùng dung môi hữu (petroleum ether) để trích ly lipid có mẫu thực phẩm nghiền nhỏ. Bằng cách xác định chênh lệch khối lượng bình cầu chứa mẫu khảo sát trước sau trích ly hết lipid, ta tính hàm lượng lipid có mẫu nguyên liệu ban đầu. Tiến hành 1. Sấy khô nguyên liệu nghiền nhuyễn đến khối lượng không đổi; 2. Cân g nguyên liệu cân phân tích gói mẫu lại giấy lọc, buộc lại sợi; 3. Đặt gói giấy chứa mẫu vào trụ chiết hệ thống Soxhlet cho điểm cao gói mẫu không vượt đầu ống chảy tràn; 4. Bôi trơn đầu trụ chiết lắp trụ vào bình cầu (đã sấy khô đến khối lượng không đổi xác định khối lượng). Tương tự, bôi trơn đầu ống sinh hàn lắp ống vào trụ chiết; 5. Cho dung môi petroleum ether vào trụ chiết cho lượng dung môi chảy xuống khoảng nửa bình cầu lại lượng trụ chiết vừa đủ ngập mẫu. 6. Mở nước ống sinh hàn 7. Đặt hệ thống Soxhlet lên bếp cách thủy điều chỉnh nhiệt độ cho chu kỳ hoàn lưu dung môi đạt từ đến lần giờ. Trích ly khoảng đến 12 trích ly hết toàn lipid. (Thử thời điểm kết thúc trình trích ly cách lấy vài giọt ether từ đầu cuối trụ chiết cho lên mặt kính đồng hồ sạch; mặt kính đồng hồ không để lại vết loang sau dung môi bay hết xem lipid trích ly hoàn toàn) 8. Sau trích ly xong, lấy bình cầu gói giấy chứa mẫu khỏi trụ chiết. Lắp bình cầu vào để cất thu hồi ether. 9. Sấy bình cầu có chứa lipid đến khối lượng không đổi nhiệt độ 80-90 C 45-50 phút. Cân để xác định khối lượng. Công thức tính Hàm lượng lipid tính theo công thức sau Ngành Công nghệ Thực phẩm 41 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ X  Với a  b  100 m X : hàm lượng lipid (% khô) a : khối lượng bình cầu chứa lipid sau sấy đến khối lượng không đổi (g) b : khối lượng bình cầu không sấy đến khối lượng không đổi (g) m : khối lượng mẫu sấy kiệt nước ban đầu (g) XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN TỔNG SỐ TRONG THỰC PHẨM THEO PHƢƠNG PHÁP KJELDAHL Nguyên tắc Hàm lượng protein tổng số thực phẩm xác định thông qua lượng NH3 tạo thành, từ trình oxi hóa hợp chất có chứa nitơ mẫu thực phẩm khảo sát dung dịch H2SO4 đậm đặc xúc tác thích hợp. NH3 sau giải phóng từ trình oxi hóa liên kết với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4. Tiếp theo, dùng kiềm mạnh (NaOH) điều kiện đun nóng đẩy NH3 muối (NH4)2SO4 thành dạng tự lôi nước. Hơi nước mang theo NH3 cất sang bình có chứa dung dịch boric acid hỗn hợp thuốc thử. NH 2 SO4  2NaOH  2NH 4OH  Na2 SO4 t NH OH  NH  H O NH  4H BO3  NH 2 B4 O7 Cuối cùng, lượng ammonium tetraborate tạo thành định lượng dung dịch H2SO4 0,1 N theo phản ứng sau NH 2 B4O7  H SO4  5H 2O  NH 2 SO4  4H BO3 Tiến hành 1. Cân xác 0,5 g mẫu cân phân tích cho vào bình tam giác 50 mL với 0,5 g xúc tác đốt đạm (khối lượng K2SO4: khối lượng CuSO4: khối lượng Se = 100: 10: 1); 2. Thêm vào bình mL dung dịch H2SO4 đậm đặc. Đặt bình lên bếp đun sôi nhẹ tủ hút khoảng đến đến dung dịch bình suốt; 3. Để nguội. Kiểm tra thời điểm kết thúc trình đun cách cho vào bình lượng nhỏ nước cất lắc nhẹ tráng thành bình; thấy hạt muội đên li ti được; 4. Cho mẫu vô hóa vào hệ thống chưng cất. Tiếp tục thêm khoảng 30 mL dung dịch NaOH 30% vào hệ thống; Ngành Công nghệ Thực phẩm 42 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ 5. Hút xác 20 mL dung dịch boric acid 2% có chứa hỗn hợp thuốc thử vào bình tam giác 250 mL; 6. Tiến hành chưng cất khoảng 45 phút. (Dùng giấy quỳ để kiểm tra thời điểm kết thúc trình chưng cất cách nhỏ giọt nước đầu cuối ống sinh hàn lên giấy quỳ, giấy quỳ không bị chuyển sang màu xanh trình lôi kết thúc) 7. Rửa đầu ống sinh hàn nước cất. Lấy bình hứng tiến hành chuẩn độ dung dịch H2SO4 0,1 N đến dung dịch bình hứng chuyển từ màu xanh sang màu hồng nhạt. Công thức tính Hàm lượng nitơ mẫu tính theo công thức sau Hàm lượng nitơ tổng số = (0,0014 x VH SO4 x 100)/m Với (%) m: khối lượng nguyên liệu đem phân tích (g) 0,0014: số g nitơ tương đương với mL dung dịch H2SO4 0,1 N Từ đó, hàm lượng protein tổng số tính theo công thức Hàm lượng protein (%) = hàm lượng nitơ tổng số (%) x H Trong đó, H hệ số trung bình thô, phụ thuộc vào loại nguyên liệu sử dụng. Hệ số H thực phẩm có nguồn gốc động vật 6,25. XÁC ĐỊNH LƢỢNG TYROSINE SINH RA THEO PHƢƠNG PHÁP ANSON Xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine 1. Chuẩn bị 10 ống nghiệm sạch, khô. Đồng thời, pha dung dịch tyrosine chuẩn μM μM; 2. Pha loãng dung dịch tyrosine chuẩn μM dung dịch HCl 0,2 N vào ống nghiệm từ đến thành dung dịch tyronsine có nồng độ 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16 0,2 μM . Sau đó, từ dung dịch tyrosine chuẩn μM, pha vào ống nghiệm từ đến 10 dung dịch tyrosine có nồng độ 0,4; 0,6; 0,8 μM dung dịch HCl 0,2 N; 3. Thêm vào ống nghiệm chứa mL dung dịch 10 mL dung dịch NaOH 0,5 N mL thuốc thử Folin-Ciocalteu (đã pha loãng lần với nước cất); 4. Lắc ống nghiệm. Sau 10 phút, đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 660 nm; 5. Ống nghiệm số ống đối chứng, ống lại ống thí nghiệm. Dựng đồ thị biểu diễn phụ thuộc biến thiên mật độ quang (giữa mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng) theo nồng độ tyrosine có dung dịch. Bảng 5.1 Công thức hóa chất để xây dựng đường chuẩn tyrosine Hóa chất Ngành Công nghệ Thực phẩm Ống nghiệm 43 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ 10 Lượng tyrosine chuẩn (mL) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0,4 0,6 0,8 1,0 Nồng độ tyrosine tương ứng (μmole/mL) 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 Lượng HCl 0,2 N (mL) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 4,6 4,4 4,2 4,0 Lượng NaOH (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Lượng FolinCiocalteu (mL) Đường chuẩn tyrosine xây dựng có dạng hình sau Đƣờng chuẩn tyrosine Mật độ quang bước sóng 660 nm 2.5 y = 2.2335x + 0.0639 1.5 R2 = 0.9932 0.5 0 0.5 Nồng độ tyrosine (μmol/mL) 1.5 Hình 5.1 Đường chuẩn tyrosine Đối với mẫu thủy phân enzyme, sau lọc, 0,5 mL dịch lọc bổ sung thêm mL dung dịch NaOH 0,5 N 0,3 mL thuốc thử FolinCiocalteu. Lắc đều, để yên dung dịch 10 phút đo độ hấp thụ ánh sáng dung dịch bước sóng 660 nm. Mẫu đối chứng tiến hành tương tự dung dịch TCA 5% thêm vào trước bổ sung enzyme vào chất phụ phẩm cá tra. Ngành Công nghệ Thực phẩm 44 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Như vậy, từ biến thiên mật độ quang (độ hấp thụ ánh sáng) đường chuẩn có , tính vận tốc phản ứng theo lượng tyrosine sinh theo công thức sau: v ( x  0,063)  V pu 2,233  t μmol tyrosine/phút Trong đó: x : biến thiên mật độ quang mẫu thủy phân mẫu đối chứng Vpu: thể tích tổng dung dịch phản ứng, 15,5 mL (10 mL dung dịch đệm phosphate + 0,5 mL enzyme + mL TCA 5%) t: thời gian thủy phân (30 phút) XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT THỦY PHÂN THEO HÀM LƢỢNG TYROSINE SINH RA Hiệu suất theo hàm lượng tyrosine sinh tính theo công thức sau: H Tyr  Tyrtp Tyrts (%) Với: Tyrtp: khối lượng tyrosine sinh 100 g chất khô nguyên liệu, Tyrtp  ( x  0,063)  V pu  181,19  10 6 2,233  (1  0,6346)  m  100 (g tyrosine/100 g chất khô nguyên liệu) Tyrts: khối lượng tyrosine tổng số sinh 100 g chất khô nguyên liệu, Tyrts  ( x  0,063)  V pu  181,19  10 6 2,233  (1  0,6346)  m  100  k (g tyrosine/100 g chất khô nguyên liệu) x : biến thiên mật độ quang mẫu thủy phân mẫu đối chứng Vpu: thể tích tổng dung dịch phản ứng (15,5 mL với mẫu thủy phân enzyme, 50 mL với mẫu thủy phân hoàn toàn acid) 181,19: khối lượng phân tử tyrosine 0,6346: độ ẩm nguyên liệu (căn ướt) m: khối lượng nguyên liệu k: hệ số pha loãng, 30 XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT THỦY PHÂN THEO HÀM LƢỢNG ĐẠM AMINE SINH RA DỰA TRÊN PHƢƠNG PHÁP OPA Pha dung dịch mẹ Hòa tan 25,4 g Borax 667 mg SDS nước cất thành 500 mL dung dịch. Ngành Công nghệ Thực phẩm 45 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Pha dung dịch OPA (chỉ pha đo)  Cân xác 40 mg OPA 44 mg DTT (dithiothreitol).  Sau đó, hòa tan hoàn toàn hỗn hợp mL ethanol.  Tiếp tục thêm 37,5 mL dung dịch mẹ pha loãng nước cất để 50 mL dung dịch. Pha serine chuẩn Cân 10 mg serin sau pha thành 100 mL dung dịch bình định mức, dung dịch với nồng độ 0,1 mg/mL Đo mẫu Hút 200 μL dung dịch serine chuẩn + 1,5 mL dung dịch OPA (mẫu serine chuẩn) Hút 200 μL nước cất + 1,5 dung dịch OPA (mẫu không) Hút 200 μL dung dịch thủy phân pha loãng + 1,5 dung dịch OPA (mẫu thật) Để yên mẫu phút đo độ hấp thụ bước sóng ánh sáng 340 nm máy quang phổ. Công thức tính Hàm lượng đạm amine tính theo công thức M N  CS  VS 14,2   k (mg N/g) 1000 m Trong đó: MN: hàm lượng đạm amine (mg N/g) CS  ODS  ODO  0,9516 (mmol/L) ODSD  ODO 0,9516: 0,9516 mmol/L serine (tương đương 0,9516 mmol/L Nitơ) VS: thể tích dịch thủy phân (mL) m: khối lượng mẫu (g) k: hệ số pha loãng ODS, ODO, ODSD: độ hấp thụ bước sóng ánh sáng 340 nm mẫu thật, mẫu không mẫu serine chuẩn. Từ đó, hiệu suất thủy phân = MN/MN(tổng số) Với MN(tổng số)= 0,1736  1000 (mg N/g) 6,25 Trong đó: 0,1736: hàm lượng protein tổng số nguyên liệu (Nguyễn Huỳnh Quang Diệu, 2013) Ngành Công nghệ Thực phẩm 46 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ PHƢƠNG PHÁP CHẠY ĐIỆN DI Nguyên tắc Phương pháp chạy điện di dựa nguyên tắc phần tử tích điện có tốc độ di chuyển khác điện trường phụ thuộc vào kích thước, hình dạng, điện tích lực điện trường. Trong đó, phần tử mang điện tích dương di chuyển phía cực âm điện trường ngược lại, phần tử mang điện tích ẩm bị hút phía cực dương điện trường. Hóa chất Dung dịch acrylamide 30% Các dung dịch đệm: Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 Tris-HCl 1,0 M pH 6,8 Amonium persulfat (APS) 10% Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% Dung dịch tetramethylethylenediamine (TEMED) 15 mL dung dịch chuẩn bị mẫu có chứa: Tris-HCl 0,6 M pH 6,8 mL SDS 10% mL Glycerol 98% mL Β-mercaptoethanol mL Nước cất mL Bromophenol blue 0,5% so với thể tích L dung dịch chạy điện di có chứa: g Tris, 14,4 g glycerine, g SDS 100 mL dung dịch nhuộm gel: 0,1 g Comassie blue R-250 50 mL methanol 40 mL nước cất L acetic acid 100% 830 mL nước cất B. CÔNG THỨC PHA CÁC HÓA CHẤT SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM Dung dịch NaOH 0,5 N 1. Cân xác 20 g NaOH khan cho vào cốc thủy tinh 100 mL; 2. Sau đó, hòa tan nước cất, khuấy đũa thủy tinh chuyển hết vào bình định mức 1000 mL. Tráng cốc thủy tinh nhiều lần nước cất cho vào bình định mức; 3. Đợi dung dịch nguội, thêm nước cất tới vạch 1000 mL. Dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 5% Ngành Công nghệ Thực phẩm 47 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ 1. Cân xác 50 g TCA khan cho vào cốc thủy tinh 100 mL; 2. Sau đó, hòa tan nước cất, khuấy đũa thủy tinh chuyển hết vào bình định mức. Tráng cốc thủy tinh nhiều lần nước cất cho vào bình định mức; 3. Thêm nước cất tới vạch 1000 mL. Dung dịch đệm phosphate 1/15 M pH 6,5 1. Cân xác 9,072 g KH2PO4 sau pha loãng thành L dung dịch nước cất bình định mức. 2. Tiếp theo, cân xác 23,8 g Na2HPO4.12H2O pha loãng thành L dung dịch với nước cất bình định mức. 3. Sau đó, trộn dung hai dung dịch vào chỉnh pH 6,5 cách thêm từ từ dung dịch vào dung dịch pha trộn. C. BẢNG SỐ LIỆU THỐNG KÊ Bảng 5.2 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân (tính theo tyrosine) theo cặp enzyme: chất khác ANOVA Table for Hieu suat thuy phan theo Tyr by Cap enzyme: co chat_mgE_gPro Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.18367 0.727889 48.91 0.0000 Within groups 0.119056 0.014882 Total (Corr.) 2.30272 11 Bảng 5.3 Kiểm định LSD Hiệu suất thủy phân theo cặp enzyme: chất khác Multiple Range Tests for Hieu suat thuy phan theo Tyr by Cap enzyme: co chat_mgE_gPro Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups 0,8 mg E: 1,111 g Pr 1.51033 X 0,7 mg E: 0,972 g Pr 1.88333 X X 0,6 mg E: 0,833 g Pr 2.27367 X 0,5 mg E: 0,694 g Pr 2.652 Contrast Sig. Difference +/- Limits 0,5 mg E: 0,694 g Pr - 0,6 mg E: 0,833 g Pr * 0.378333 0.229692 0,5 mg E: 0,694 g Pr - 0,7 mg E: 0,972 g Pr * 0.768667 0.229692 0,5 mg E: 0,694 g Pr - 0,8 mg E: 1,111 g Pr * 1.14167 0.229692 0,6 mg E: 0,833 g Pr - 0,7 mg E: 0,972 g Pr * 0.390333 0.229692 0,6 mg E: 0,833 g Pr - 0,8 mg E: 1,111 g Pr * 0.763333 0.229692 0,7 mg E: 0,972 g Pr - 0,8 mg E: 1,111 g Pr * 0.373 0.229692 * denotes a statistically significant difference. Ngành Công nghệ Thực phẩm 48 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 5.4 Phân tích phương sai hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) theo cặp enzyme: chất khác ANOVA Table for Hieu suat thuy phan_theo pp OPA by Cap enzyme: co chat_ mg E_g Pro Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.017763 0.005921 4.32 0.0436 Within groups 0.010972 0.0013715 Total (Corr.) 0.028735 11 Bảng 5.5 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) theo cặp enzyme: chất khác Multiple Range Tests for Hieu suat thuy phan_theo pp OPA by Cap enzyme: co chat_ mg E_g Pro Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups 0,8 mg E: 1,111 g Pro 0.498 X 0,5 mg E: 0,694 g Pro 0.553 XX 0,6 mg E: 0,833 g Pro 0.577 X 0,7 mg E: 0,972 g Pro 0.602 X Contrast 0,5 mg E: 0,694 g Pro - 0,6 mg E: 0,833 g Pro 0,5 mg E: 0,694 g Pro - 0,7 mg E: 0,972 g Pro 0,5 mg E: 0,694 g Pro - 0,8 mg E: 1,111 g Pro 0,6 mg E: 0,833 g Pro - 0,7 mg E: 0,972 g Pro 0,6 mg E: 0,833 g Pro - 0,8 mg E: 1,111 g Pro 0,7 mg E: 0,972 g Pro - 0,8 mg E: 1,111 g Pro Sig. Difference -0.024 -0.049 0.055 -0.025 * 0.079 * 0.104 +/- Limits 0.069729 0.069729 0.069729 0.069729 0.069729 0.069729 * denotes a statistically significant difference. Bảng 5.6 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân tính theo tyrosine theo thời gian phản ứng _ thí nghiệm ANOVA Table for Hieu suat % theo tyrosine by Thoi gian thuy phan_phut Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 89.3866 14.8978 2491.01 0.0000 Within groups 0.0837287 14 0.00598062 Total (Corr.) 89.4703 20 Bảng 5.7 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân theo tyrosine theo thời gian phản ứng _ thí nghiệm Multiple Range Tests for Hieu suat % theo tyrosine by Thoi gian thuy phan_phut Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups X 0.0 30 2.70233 X X 60 3.54267 Ngành Công nghệ Thực phẩm 49 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 90 120 180 240 3 3 4.821 5.228 6.05567 6.35933 Contrast Sig. Difference - 30 * -2.70233 - 60 * -3.54267 - 90 * -4.821 - 120 * -5.228 - 180 * -6.05567 - 240 * -6.35933 30 - 60 * -0.840333 30 - 90 * -2.11867 30 - 120 * -2.52567 30 - 180 * -3.35333 30 - 240 * -3.657 60 - 90 * -1.27833 60 - 120 * -1.68533 60 - 180 * -2.513 60 - 240 * -2.81667 90 - 120 * -0.407 90 - 180 * -1.23467 90 - 240 * -1.53833 120 - 180 * -0.827667 120 - 240 * -1.13133 180 - 240 * -0.303667 Trường Đại học Cần Thơ X X X X +/- Limits 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 0.135429 * denotes a statistically significant difference. Bảng 5.8 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân tính theo pp OPA theo thời gian phản ứng ANOVA Table for Hieu suat thuy phan % theo OPA by Thoi gian thuy phan_phut Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 22.9752 3.8292 450.85 0.0000 groups Within groups 0.118905 14 0.00849324 Total (Corr.) 23.0941 20 Bảng 5.9 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân theo pp OPA theo thời gian phản ứng Multiple Range Tests for Hieu suat thuy phan % theo OPA by Thoi gian thuy phan_phut Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean 30 3 0.0 0.854333 Homogeneous Groups X X Ngành Công nghệ Thực phẩm 50 Khoa Nông nghiệp SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 60 90 120 180 240 3 3 1.17333 1.65167 2.121 2.80033 3.24467 Trường Đại học Cần Thơ X X X X X Contrast Sig. Difference +/- Limits - 30 * -0.854333 0.16139 - 60 * -1.17333 0.16139 - 90 * -1.65167 0.16139 - 120 * -2.121 0.16139 - 180 * -2.80033 0.16139 - 240 * -3.24467 0.16139 30 - 60 * -0.319 0.16139 30 - 90 * -0.797333 0.16139 30 - 120 * -1.26667 0.16139 30 - 180 * -1.946 0.16139 30 - 240 * -2.39033 0.16139 60 - 90 * -0.478333 0.16139 60 - 120 * -0.947667 0.16139 60 - 180 * -1.627 0.16139 60 - 240 * -2.07133 0.16139 90 - 120 * -0.469333 0.16139 90 - 180 * -1.14867 0.16139 90 - 240 * -1.593 0.16139 120 - 180 * -0.679333 0.16139 120 - 240 * -1.12367 0.16139 180 - 240 * -0.444333 0.16139 * denotes a statistically significant difference. Ngành Công nghệ Thực phẩm 51 Khoa Nông nghiệp SHƯD [...]... N-oxide (DMAO), creatine, các amino acid tự do, nucleotide, urea (có nhiều trong cá sụn), … (Phan Thị Thanh Quế, 2006) 2.2.3 Enzyme Enyme tham gia vào quá trình trao đổi chất ở tế bào, quá trình tiêu hóa thức ăn và quá trình tê cứng ở cá Sau khi cá chết, enzyme vẫn còn hoạt động nên gây ra quá trình tự phân giải của cá Trong nguyên liệu cá có nhiều enzyme khác nhau Các nhóm enzyme chính ảnh hưởng đến... giữa enzyme và cơ chất Muốn vậy, có thể làm nhỏ kích thước cơ chất trước khi thủy phân, đồng thời, thời gian thủy phân do đó cũng được rút ngắn (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011) 2.4.5 Enzyme Neutrase Enzyme Neutrase có mã số EC là 3.4.24.28 Neutrase, một sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis, được phân lập lần đầu tiên vào những năm 1950 từ loài này 2.4.5.1 Đặc tính của enzyme Neutrase Neutrase... chăn nuôi, mỡ cá, xăng sinh học (biodiesel), bao tử cá, bong bóng cá, vây cá, … Thế nhưng, những nhà máy chế biến phụ phẩm vẫn còn hạn chế và những sản phẩm trên vẫn chưa phát huy hết được tiềm năng vốn có của phụ phẩm từ con cá tra Hiện nay, những sản phẩm từ quá trình thủy phân phụ phẩm cá là xu hướng mới đang được quan tâm 2.3 Sơ lƣợc về protein Các amino acid bên cạnh tồn tại ở dạng tự do còn liên... trí thí nghiệm 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định các thông số động học của enzyme Neutrase trên cơ chất là phụ phẩm cá tra 3.3.1.1 Mục đích Thí nghiệm được tiến hành nhằm mục đích tìm ra các thông số động học Vmax, Km của enzyme Neutrase đối với cơ chất là phụ phẩm cá tra Đồng thời, xác định tỷ lệ khối lượng enzyme : cơ chất protein sử dụng (mg enzyme (E): g protein (Pro)) tại đó vận tốc phản ứng đạt cực... khi thủy phân bằng enzyme ở điều kiện khảo sát và lượng tyrosine tổng số của nguyên liệu Sau đó, hiệu suất thủy phân tính theo lượng tyrosine sinh ra bằng lượng tyrosine sinh ra do thủy phân bằng enzyme so với lượng tyrosine tổng số ở cùng một đơn vị khối lượng cơ chất 3.2.8 Phƣơng pháp xác định hiệu suất thủy phân theo hàm lƣợng đạm amine Hiệu suất thủy phân theo hàm lượng đạm amine của mẫu khảo sát. .. tyrosine/phút) sau khi thủy phân cơ chất phụ phẩm cá tra 3.3.2 Thí nghiệm 2 : Xác định khối lƣợng enzyme và cơ tối ƣu dựa trên tỷ lệ enzyme : cơ chất tối ƣu 3.3.2.1 Mục đích Xác định khối lượng enzyme và cơ chất tại đó hiệu suất thủy phân đạt cao nhất dựa trên tỷ lệ khối lượng enzyme cơ chất tối ưu đã xác định được cho phản ứng thủy phân phụ phẩm cá tra 3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm Từ tỷ lệ enzyme : cơ chất... liệu Nguyên liệu chính được sử dụng trong thí nghiệm gồm có phụ phẩm cá tra và enzyme thủy phân thương mại :  Phụ phẩm cá tra được vận chuyển từ nhà máy Công ty CP XNK Thủy sản Cần Thơ (CASEAMEX), KCN Trà Nóc II, quận Ô Môn, Tp Cần Thơ về phòng thí nghiệm D106 của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm  Enzyme thủy phân thương mại được chọn sử dụng là Neutrase (Trung Quốc) 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ  Tủ lạnh (SANAKY,... 900, với khối lượng phân từ tương ứng từ 10 đến trên 100 kDa Về phân loại, các protein có thể được phân loại dựa vào tính đồng thể (homoprotein và heteroprotein) hay dựa vào chức năng của chúng trong các bộ phận, các cơ quan sinh học (protein cấu trúc, protein chức năng và protein dự trữ) Enzyme là những protein chức năng Bên cạnh các protein chỉ có các amino acid trong thành phần (protein đơn giản),... và da Phần thịt cá tách được được đem xay nhuyễn bằng máy xay và cho vào những túi nhựa có ghép miệng Lượng mẫu được cấp đông ở - 20 0C cho đến khi sử dụng Ngành Công nghệ Thực phẩm 21 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.2 Phƣơng pháp thủy phân protein bằng enzyme Động học của enzyme neutrase được khảo sát bằng phản ứng thủy phân protein theo phương... cá tra và cá trê càng thêm tối nghĩa vì hai nhóm cá này có nhiều điểm khác biệt Bên cạnh đó, trong phân loại khoa học chúng thuộc 2 họ khác nhau là Pangasiidae và Clariidae Cá thuộc họ Pangasiidae (họ cá Tra) với tên Việt có những loài sau : Helicophagus waandersii – cá Tra Chuột Pangasius gigas – cá Tra Dầu Pangasius kunyit – cá Tra Bần Pangasius hypophthalmus – cá Tra nuôi Pangasius micronema – cá . Đề tài Khảo sát quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) bằng enzyme Neutrase được tiến hành nhằm mục tiêu tìm ra các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân như. này trên các loài cá khác là khá phổ biến nhưng trên cá tra vẫn còn hạn chế. Vì vậy, đề tài Khảo sát sự thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) bằng enzyme Neutrase đã. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN PHỤ PHẨM CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) BẰNG ENZYME NEUTRASE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM CÁN BỘ HƢỚNG