BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ NƢỚC THẢI LÀNG NGHỀ LÀM BÁNH PÍA SÓC TRĂNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ THANH BẢO NGỌC MSSV: 3103967 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36 Cần Thơ, tháng 4/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ NƢỚC THẢI LÀNG NGHỀ LÀM BÁNH PÍA SÓC TRĂNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ THANH BẢO NGỌC MSSV: 3103967 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36 Cần Thơ, Tháng 4/2014 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Lê Thanh Bảo Ngọc DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Trong trình tham gia học tập khóa học chuyên ngành Vi Sinh Vật Học– Trường Đại Học Cần Thơ đến hoàn thành khóa học đặc biệt trình làm luận văn, hỗ trợ mặt tinh thần vật chất từ gia đình, Thầy Cô bạn bè để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn đến: PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh Học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần thơ, thầy hướng dẫn đề tài tận tình dạy truyền đạt phương pháp nghiên cứu kinh nghiệm quý báu nghiên cứu. Quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần thơ giúp đỡ tạo điều kiện cho thực tốt đề tài luận văn. Cô Nguyễn Thị Pha quan tâm, động viên suốt thời gian làm cố vấn học tập. Các anh chị phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đặc biệt hai chị Nguyễn Thị Thúy Duy, Trần Trà My hết lòng giúp đỡ suốt trình tiến hành thí nghiệm. Gia đình, bạn lớp Vi Sinh Vật k36 bạn thực đề tài Thầy hướng dẫn động viên chia sẻ khó khăn giúp hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý thầy cô tất bạn bè tôi. Cần Thơ, ngày 09 tháng 04 năm 2014 Lê Thanh Bảo Ngọc Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Ô nhiễm nước thải vấn đề xã hội quan tâm nay. Hàm lượng tinh bột cao nước thải gây ảnh hưởng trực tiếp đến hệ sinh thái sức khỏe người sống khu vực đó. Việc xử lý ô nhiễm vi khuẩn phân hủy tinh bột chứng minh qua nhiều nghiên cứu nước. Đề tài nhằm mục đích phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột từ nước thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng. Từ ba mẫu nước thải thu làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng, mười tám dòng vi khuẩn phân lập môi trường chứa 1% tinh bột nguồn Carbon nhất. Kết khảo sát khả phân hủy tinh bột phương pháp xác định vòng phân hủy nhờ dung dịch thuốc thử lugol tìm dòng vi khuẩn có khả tiết enzyme amylase. Định danh kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp sử dụng công cụ Blast nucleotide ngân hàng gen NCBI cho thấy dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột triển vọng thuộc loài Bacillus fexus với độ tương đồng 97%. Từ khóa: Bánh Pía, vi khuẩn phân hủy tinh bột, vi khuẩn Bacillus. i Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ . TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG . v DANH SÁCH HÌNH . vi TỪ VIẾT TẮT . vii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU . 1.1. Đặt vấn đề . 1.2. Mục tiêu đề tài CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nghiên cứu nước 2.1.1. Tình hình nghiên cứu nước 2.1.2. Tình hình nghiên cứu giới 2.2. Nguyên liệu 2.2.1. Sơ lược nghề làm bánh Pía Sóc Trăng . 2.2.2. Đặc điểm nước thải công nghiệp 2.2.3. Tổng quan tinh bột . 2.2.3.1. Amylose 2.2.3.2. Amylopectin . 10 2.2.4. Quá trình phân hủy tinh bột . 11 2.2.5. Enzyme tham gia vào trình phân hủy tinh bột 12 2.2.6. Các vi sinh vật phân hủy tinh bột 16 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1. Phương tiện nghiên cứu 23 ii Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 3.1.1. Nguyên vật liệu địa điểm thực 23 3.1.2. Dụng cụ thiết bị 23 3.1.3. Hóa chất môi trường . 24 3.2. Phương pháp nghiên cứu 27 3.2.1. Phương pháp thu mẫu 27 3.2.2. Phương pháp làm môi trường 27 3.2.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn phân hủy tinh bột, xác định hình thái phản ứng sinh hóa vi khuẩn 27 3.2.3.1. Phương pháp phân lập 27 3.2.3.2. Xác định hình thái phản ứng sinh hóa vi khuẩn 28 3.2.4. Phương pháp tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột tốt . 33 3.2.5. Phương pháp xác định thời gian tăng trưởng tối ưu dòng vi khuẩn . 34 3.2.6. Định danh dòng vi khuẩn 35 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1. Kết phân lập vi khuẩn . .38 4.1.1. Phân lập vi khuẩn 38 4.1.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập 39 4.1.3. Đặc điểm tế bào vi khuẩn môi trường phân hủy tinh bột 42 4.2. Đặc tính sinh hóa dòng vi khuẩn phân lập 44 4.2.1. Thử nghiệm Catalase . 44 4.2.2. Thử nghiệm Methyl red . 45 4.2.3. Hoạt tính Lipase 46 4.3. Kết khảo sát hoạt tính Amylase . 48 4.4. Kết xác định thời gian tăng trưởng số dòng phân hủy tinh bột .51 4.5. Kết nhận diện dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột 52 iii Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 5.1. Kết luận 55 5.2. Đề nghị . 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 56 PHỤ LỤC . Phụ lục 1: Kết Phụ lục 2: Kết phân tích thống kê iv Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Các vi sinh vật có hệ enzyme amylase .17 Bảng 2. Thành phần môi trường bổ sung tinh bột .24 Bảng 3. Thành phần môi trường LB 25 Bảng 4. Công thức môi trường MSB .26 Bảng 5. Công thức môi trường MR-VP broth .26 Bảng 6. Các giai đoạn phương pháp nhuộm Gram .30 Bảng 7. Thành phần chất phản ứng PCR .36 Bảng 8. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA 36 Bảng 9. Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập được. .38 Bảng 10. Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn phân lập sau 24 cấy. .39 Bảng 11. Đặc tính dòng vi khuẩn phân lập 42 Bảng 12. Giá trị đo OD đo mực dầu dòng vi khuẩn 46 v Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Bánh Pía thành phẩm Hình 2. Nước thải từ sở sản xuất bánh Pía Tân Huê Viên (THV) Mỹ Trân (MT) Hình 3. Cấu trúc phân tử Amylose .9 Hình 4. Hồ tinh bột 10 Hình 5. Cấu trúc phân tử Amylopectin .10 Hình 6. Quá trình chuyển hóa tinh bột vi sinh vật 11 Hình 7. Cơ chế phân hủy tinh bột 12 Hình 8. MINIGADINE & NEOPEPTINE DROPS .15 Hình 9. Vi khuẩn Bacillus subtilis .20 Hình 10. Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens .22 Hình 11. Khuẩn lạc phát triển môi trường bổ sung tinh bột sau 24 41 Hình 12. Hình nhuộm Gram 43 Hình 13. Hiện tượng sủi bọt khí cho H2O2 tiếp xúc với bề mặt khuẩn lạc .44 Hình 14. Phản ứng màu dòng vi khuẩn nhỏ thuốc thử Methyl red 45 Hình 15. Các dòng vi khuẩn môi trường MSB bổ sung dầu ăn ủ ngày .47 Hình 16. Độ đục mực dầu dòng Q7 trước sau ủ ngày 37oC so với ống đối chứng (ĐC) .48 Hình 17. Khuẩn lạc tạo vòng phân hủy sau 24 .49 Hình 18. Đĩa nhuộm Lugol để thấy vòng phân hủy tinh bột sau 68 49 Hình 19. Biểu đồ so sánh tỉ lệ đường kính vòng phân hủy đường kính khuẩn lạc dòng vi khuẩn 50 Hình 20. Đĩa đếm khuẩn lạc hai dòng vi khuẩn phương pháp nhỏ giọt 51 Hình 21. Biểu đồ biểu diễn tương quan mật số tế bào thời gian nuôi cấy dòng vi khuẩn Q7 Q5 51 Hình 22. Phổ điện di sản phẩm PCR nhân lên từ đoạn 16S-rRNA 51 Hình 23. Mức độ tương đồng dòng Q7 so với dòng vi khuẩn khác sở liệu NCBI 51 vi Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 4.2.2. Thử nghiệm Methyl red Sau chủng 18 dòng vi khuẩn phân lập vào môi trường Glucose phosphate (MR-VP broth) ủ 37oC ngày, nhỏ 100µl thuốc thử Methyl red vào ống nghiệm. Hình 14. Phản ứng màu dòng vi khuẩn nhỏ thuốc thử Methyl red Ghi chú: ĐC ống đối chứng có môi trường MR-VP broth mà chủng vi khuẩn. Dựa vào thay đồi màu sắc ống nghiệm, quan sát ta thấy: pH: Trong 18 dòng vi khuẩn có dòng môi trường chuyển sang màu đỏ (chiếm 22,22%), màu cam dòng (chiếm 38,89%), màu vàng dòng (chiếm 33,33%) có dòng màu trắng ngà (chiếm 5,56%). Theo kết dòng vi khuẩn có môi trường chuyển sang màu đỏ cho phản ứng dương tính với thuốc thử Methyl red chứng tỏ acid tích lũy môi trường ngày nhiều hơn. Còn lại 14 dòng cho kết âm tính vi sinh vật chuyển hóa sản phẩm acid kết làm cho pH môi trường chuyển dần trung tính. 45 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 4.2.3. Hoạt tính Lipase Chỉ số OD dòng vi khuẩn để chủng vào môi trường dao động khoảng 0,055 – 0,075 đo bước sóng 610nm. Sau chủng 1ml dòng vi khuẩn vào ống chứa môi trường MSB có bổ sung 0,5ml dầu ăn ủ 37oC ngày, tiến hành đo mực dầu đo OD dòng vi khuẩn. Ghi nhận kết (Bảng 13). Bảng 12. Giá trị đo OD đo mực dầu dòng vi khuẩn STT Dòng vi khuẩn OD ban đầu OD sau ngày Đo mực dầu ủ 37oC (mm) ĐC 0,012 0,018 7,0 T6 0,063 0,044 7,0 T7 0,074 0,125 6,0 T10 0,060 0,094 7,0 M0 0,068 0,089 7,0 M4 0,069 0,114 6,5 M5 0,066 0,097 6,5 M10 0,064 0,109 6,5 M12 0,063 0,045 7,0 10 Q0 0,057 0,362 5,5 11 Q3 0,059 0,281 6,0 12 Q4 0,060 0,062 7,0 13 Q5 0,061 0,086 7,0 14 Q6 0,075 0,491 5,0 15 Q7 0,068 0,569 5,0 16 Q8 0,071 0,373 5,5 17 Q9 0,065 0,035 7,0 18 Q10 0,067 0,126 6,5 46 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 19 Q11 Trường ĐHCT 0,069 0,121 6,5 Ghi chú: ĐC ống đối chứng chứa môi trường MSB bô sung 0,5ml dầu ăn (mực dầu 7,0 mm) mà chủng vi khuẩn. Hoạt tính enzyme lipase dòng vi khuẩn kiểm định qua thử nghiệm kết hợp đo mực dầu đo số OD, kết sau:  Nhìn chung đa số dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme lipase 14 dòng vi khuẩn (Q7, Q6, Q8, Q0, Q3, T7, Q10, Q11, M4, M5, M10, T10, M0, Q5) chiếm tỉ lệ 77,78%. Trong dòng Q7 có hoạt tính enzyme lipase cao nhất.  Còn lại dòng vi khuẩn (M12, T6, Q4, Q9) hoạt tính enzyme lipase chiếm tỉ lệ 22,22%. Hình 15. Các dòng vi khuẩn môi trƣờng MSB bổ sung dầu ăn ủ ngày 37oC Ghi chú: ĐC ống đối chứng chứa môi trường MSB bô sung 0,5ml dầu ăn (mực dầu 7,0 mm) mà chủng vi khuẩn. Từ kết cho thấy dòng vi khuẩn Q7 có khả tăng trưởng nhanh làm đục môi trường MSB có bổ sung dầu ăn nên số OD tăng cao (0,068 - 0,569) mực dầu thấp so với lúc đầu (7 mm – mm) phân giải lượng lipid dầu ăn. Chứng tỏ dòng vi khuẩn Q7 có hoạt tính enzyme lipase cao so với dòng vi khuẩn lại (Hình 16). 47 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Ủ ngày Chủng VK 37oC Hình 16. Độ đục mực dầu dòng Q7 trƣớc sau ủ ngày 37oC so với ống đối chứng (ĐC) 4.3. Kết khảo sát hoạt tính Amylase Sau cấy ủ nhiệt độ phòng (30oC), khuẩn lạc phát triển sau 18 giờ. Sau 24 nhận diện rõ vòng sáng xung quanh khuẩn lạc (hay gọi vòng phân hủy) (Hình 17). Tuy nhiên, vòng phân hủy tinh bột nhận rõ đo làm tràn mẫu vi khuẩn với dung dịch Lugol (Hình 18). Phần môi trường chứa tinh bột chưa bị phân hủy enzyme amylase cho màu tím xanh với dung dịch Lugol, riêng vùng sáng tinh bột bị phân hủy không cho phản ứng màu với Lugol. Theo kết nghiên cứu Sasmita Mishra Niranjan Behera (2008), Sekar Sudharhsan et al. (2007) khuẩn lạc dòng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột tạo vòng sáng rộng xung quanh khuẩn lạc vòng sáng không cho phản ứng màu với dung dịch Lugol. Sự diện vòng phân hủy tinh bột bao quanh khuẩn lạc cho kết đánh giá ban đầu dòng vi khuẩn có hay khả phân hủy tinh bột. Tuy nhiên, đường kính vòng phân hủy tinh bột dòng vi khuẩn khác nhau, tùy thuộc vào khả phân hủy tinh bột chúng. Sau ngày chủng dòng 18 dòng vi khuẩn phân lập bắt đầu xuất vòng sáng tăng dần qua ngày. 48 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Q7 Q5 Hình 17. Khuẩn lạc tạo vòng phân hủy sau 24 ĐC ĐC Q7 Q9 M4 Q8 Q11 M12 ĐC Q5 Hình 18. Đĩa đƣợc nhuộm Lugol để thấy vòng phân hủy tinh bột sau 68 Ghi chú: (ĐC): dòng đối chứng dương VD2 49 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Khả dòng vi khuẩn khảo sát đánh giá sơ qua tỉ lệ đường kính vòng sáng xung quanh khuẩn lạc (D) đường kính khuẩn lạc (d). Các dòng Q7, Q5, Q9, Q6, M0, M10, T6 có đường kính trung bình vòng phân hủy cao từ 19 mm đến 52 mm có tỉ lệ D/d > 1,0. Các dòng vi khuẩn lại hầu hết có đường kính nhỏ với tỉ lệ D/d=1,0. Hình 19. Biểu đồ so sánh tỉ lệ đƣờng kính vòng phân hủy đƣờng kính khuẩn lạc dòng vi khuẩn Ghi chú: Trị trung bình có mẫu tự đầu cột giống biểu thị khác biệt ý nghĩa thống kê (P≤0,5). Qua hình 19 cho thấy với dòng vi khuẩn xét đến có tỉ lệ D/d cao hoạt tính enzyme amylase cao. Hoạt tính enzyme amylase dòng vi khuẩn khảo sát qua việc nhuộm Lugol, kết sau:  Dòng Q6 có hoạt tính enzyme amylase thấp với tỉ lệ D/d trung bình đạt 1,09 khác biệt có ý nghĩa so với dòng vi khuẩn khác.  Trong hoạt tính enzyme amylase cao dòng vi khuẩn Q7 với tỉ lệ D/d trung bình đạt 1,78 khác biệt có ý nghĩa so với dòng vi khuẩn lại. Ngoài ra, dòng Q7 Q5 hai dòng vi khuẩn có đường kính trung bình vòng phân hủy lớn tăng sinh khối nhanh. 50 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 4.4. Kết xác định thời gian tăng trƣởng số dòng phân hủy tinh bột Từ kết khảo sát hoạt tính enzyme amylase, hai dòng vi khuẩn có tỉ lệ D/d≥1,30 dòng Q7 dòng Q5 chọn lựa để khảo sát mật số tế bào sống chúng theo thời gian nuôi cấy môi trường dinh dưỡng MSB bổ sung tinh bột nguồn Carbon pH = 7,0. Chỉ số OD hai dòng vi khuẩn Q5 Q7 chủng vào môi trường 0,061và 0,068 đo bước sóng 610nm. Q5 Q7 Hình 20. Đĩa đếm khuẩn lạc hai dòng vi khuẩn phƣơng pháp nhỏ giọt sau 24 Mật số tế bào vi khuẩn (LogCFU/ml) 10.5 10 9.76 9.6 9.67 9.5 9.46 9.34 9.12 Dòng Q5 8.5 Dòng Q7 7.58 7.5 7.42 0h 24h 48h 72h Thời gian nuôi cấy Hình 21. Biểu đồ biểu diễn tƣơng quan mật số tế bào thời gian nuôi cấy dòng vi khuẩn Q7 Q5 51 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Khi nuôi cấy môi trường dinh dưỡng lỏng máy lắc, hai dòng vi khuẩn có đường cong tăng trưởng, thời gian mật số tế bào vi khuẩn đơn vị thể tích đạt cực đại tương ứng với thời gian tăng trưởng tối ưu hai dòng vi khuẩn có khác biệt sau:  Dòng vi khuẩn Q5 có mật số tế bào tăng lên sau chủng vào môi trường dinh dưỡng đạt giá trị cực đại 9,46 (LogCFU/ml) 24h, sau giảm dần sau 48h 72h.  Riêng dòng vi khuẩn Q7 lại có mật số tế bào tăng nhanh sau 24h tiếp tục tăng đạt cực đại 48h 9,76 (LogCFU/ml). Sau mật số tế bào giảm dần đến sau 72h. 4.5. Kết nhận diện dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột Dòng vi khuẩn Q7 có khả phân hủy tinh bột tốt, có khả phân hủy lipid nên chọn giải trình tự. Phổ điện di gel agarose cho thấy dòng vi khuẩn Q7 có băng (band) vị trí 1500bp so với thang chuẩn (Hình 22). 1500bp Hình 22. Phổ điện di sản phẩm PCR đƣợc nhân lên từ đoạn 16S-rRNA dòng vi khuẩn Q7 *Chú thích: (1) Dòng vi khuẩn Q7. (2) Đối chứng dương. (3) Thang chuẩn 100 bp. 52 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Tiến hành giải trình tự dòng vi khuẩn, sử dụng công cụ BLAST NCBI để so sánh mức độ tương đồng trình tự dòng vi khuẩn tuyển chọn với trình tự dòng vi khuẩn ngân hàng gen qua trang web: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/. Trình tự nucleotide dòng Q7: GGGGGGGGGCTGCCTTATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTT CTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGA CTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAACATTTTCTCTTGCATA AGAGAAAATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCA TTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTG AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT GAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTAC AAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTA CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGG GCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCA ACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGG AATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGA AGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAA CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAG AGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAG TACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC TCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGGGACAGGTGG GGCATGGTTGTCGTCCGCTCCGGGCCGGGGAAAGTTGGGGTAAAGTCTCCGCAA CAAGCGCCACCCTTGGAATTTAGTTGCCCCCATTTAAGTGGGGCACTCTAAGGGG CTGCGGGGGAAAAACCGAAGAAAGGGGGGGGAAGACGCCAAATAATTAAGGCC TCTTAAAAACGGGGGGGAACAACGGTCTACAATGGAGGGGGAAAAAGGGTTGC CAAAACCGGGGGGGGGGGCAGCCCCTAAAAACATTTCCCTTCTCGAATG Kết cho thấy trình tự dòng vi khuẩn Q7 có mức đồng hình 97% với 16S rRNA dòng vi khuẩn Bacillus flexus. Hình 23. Mức độ tƣơng đồng dòng Q7 so với dòng vi khuẩn khác sở liệu NCBI 53 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Đã có nhiều nghiên cứu khả phân hủy tinh bột lợi ích Bacillus flexus ứng dụng xử lý nước thải, công nghiệp. Bacillus flexus (XJU -3) sản xuất hàng loạt enzyme amylase ngoại bào có tính kiềm có nhiều tiềm ứng dụng công nghiệp (Jian et al., 2008). Gần vào năm 2013, theo nghiên cứu D H Tambekar V R Dhundale, 15 dòng vi khuẩn thu từ miệng núi lửa Lonar lựa chọn sở hoạt động phân hủy tinh bột, có Bacillus flexus. Cũng năm 2013, Kun Chen, Jing Yang Hua Zhao xác định dòng Bacillus flexus phân lập từ bùn đất gần nhà máy luyện dầu khí làm giảm COD nước thải hiệu quả. Ngoài ra, theo nghiên cứu Minh et al. (2010) cho thấy Bacillus flexus (F21) chủng thuộc loài có độ an toàn sinh học với hoạt tính probiotic cao, vừa có khả đối kháng với nhiều vi khuẩn thường gây bệnh cho động vật thủy, vừa có khả emzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase lipase),… 54 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ mẫu nước thải thu làng nghề sản xuất bánh Pía Sóc Trăng, sau giai đoạn phân lập thu 18 dòng vi khuẩn môi trường phân hủy tinh bột. Trong có dòng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột tốt, dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột yếu dòng khả tạo vòng sáng xung quanh khuẩn lạc nhỏ dung dich Lugol vào mẫu. Thời gian phát triển nhanh môi trường tinh bột tan (sau 20 giờ) nhiệt độ 37oC. Kết giải trình tự 16S rRNA, dòng vi khuẩn Q7 tương đồng 97% với dòng vi khuẩn Bacillus flexus. 5.2. Đề nghị Sử dụng dòng vi khuẩn giải trình tự để khảo sát khả phân hủy tinh bột điều kiện khác nhau. Cần bố trí thí nghiệm để đánh giá khả xử lý nước thải tinh bột dòng Q7 trước đưa ứng dụng xử lý môi trường làng nghề làm bánh Pía. 55 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp. 2008. Giáo trình thực tập môn Vi sinh vật đại cương, Trường Đại học Cần Thơ, trang 22-29. Lương Đức Phẩm. 2003. Công nghệ xử lý nước thải biện pháp sinh học, NXBGD, trang 58-316. Nguyễn Đức Lượng. 2003. Công nghệ sinh học môi trường - Công nghệ xử lý nước thải (tập 1), NXB ĐHQG TPHCM, trang 77-82. Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Thị Hải Lý. 2009. Phân lập dòng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột. Tạp chí Khoa học 2012:21a, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Đan Duy Pháp, Lai Phong Mỹ Lệ, Lại Thị Minh Lê, Nguyễn Thị Hồng Phương, Phạm Hùng Vân Nguyễn Văn Bảy. 2010. Phân lập sàng lọc số vi khuẩn tiềm làm probiotic nuôi trồng thủy sản từ trùn quế (Perionyx excavatus). Y Học TP. HCM, 15:182-188. Nguyễn Văn Phước Nguyễn Thị Thanh Phương. 2004. Hiện trạng ô nhiễm giải pháp xử lý nước thải cho làng nghề tinh bột Hoài Hảo – Tỉnh Bình Định. Trường Đại học Bách khoa TP.HCM. Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty Nguyễn Thị Kim Quy. 2002. Nghiên cứu hoạt tính amylase hai chủng Bacillus sp. H5-1 H5-4 dùng sản xuất phân bón hữu cơ. Tạp chí di truyền học ứng dụng, trang 41-46. Tiếng Anh Arlem Nascimento de Oliveira, Luiz Antonio de Oliveira, Jerusa Sousa Andrade, Aloisio Freitas Chagas Junior. 2007. Rhizobia amylase production using various starchy substances as carbon substrates. Brazilian Journal of Microbiology, 38:208-216. Bennasar A., Guasp C. and Lalucat J 1998. Molecularilar methods for the detection and identification of Pseudomonas stutzeri in pure culture and environmental samples. Microb Ecol, 35:22-33. Clark, W. M., and H. A. Lubs. 1915. The differentiation of bacteria of the colonaerogenes family by the use of indicators. J. Infect. Dis. 17:160-173. 56 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT D H Tambekar and V R Dhundale. 2013. Phylogenetic analysis of amylase producing bacilli from extremophillic environment. International Journal of Life Sciences Biotechnology and Pharma Research, 2:103-113. Glor.G.B., Miller.C.H. and Spandau.D.F. 1988. Degradation of starch and its hydrolytic products by Oral bacteria, J Dent Res, 67(1): 75-81. H. Weber, H. J. Schepers and W. Trfisch. 1990. Starch-degrading enzymes from anaerobic non-clostridial bacteria. Applied Microbiol Biotechnol, 33:602-606. Jian Zhao, Xiaojun Lan, Jun Su, Lei Sun and Erkin Rahman. 2008. Isolation and identification of an alkaliphilic Bacillus flexus XJU-3 and analysis of its alkaline amylase. Acta Microbiologica Sinica, 48(6):750-756. Kun Chen, Jing Yang and Hua Zhao. 2013. Isolation and characterization of a Bacillus strain for alkaline wastewater treatment. African Journal of Microbiology Research, 7:5119-5125. Motiram R. Dhawale. J. Jeffey Wilson, George G. Khachatourians and W. Mike Ingledew. 1982. Improved method for detection of starch hydrolysis. Appl and environmental microbiology, pp.747-750. Sasmita Mishra and Niranjan Behera. 2008. Amylase activity of a starch degrading bacteria isolated from soil receiving kitchen wastes. African Journal of Biotechnology, 7(18):3326-3331. Sekar Sudharhsan, Sivaprakasam Senthilkumar and Karunasena Ranjith. 2007. Physical and nutritional factors affecting the production of amylase from species of bacillus isolated from spoiled food waste, African Journal of Biotechnology Vol. (4), pp. 430-435. Shalini Aggarwal. 2006. Isolation and characterization of starch degrading lactic acid Bacteria, LVCH Deemed University, pp. 1-41. Sharmin F. and Rahman M. 2007. Isolation and characterization of protease producing Bacillus strain FS-1. Agricultural Engineering International, IX:1– 10. Swetha Sivaramakrishnan. 2006. α-amylases from Microbial Sources. An Overview on Recent Developments, Food Technol, Biotechol 44 (2):173-184. 57 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Trang web http://www.canthostnews.vn/?tabid=230&NDID=15973&keyword=Phan-lap-cacdong-vi-khuan-co-kha-nang-phan-huy-tinh-bot (ngày 27/07/2013). http://tai-lieu.com/tai-lieu/ (ngày 01/08/2013). http://www.soctrang.gov.vn/ (ngày 21/072013). http://dacsanviet.org/nguon-goc-banh-pia.html (ngày 21/07/2013). http://tanhuevien.com.vn/san-pham/c2-Banh-Pia.html (ngày 06/03/2013). http://banhpiasocsobai.blogspot.com (ngày 21/07/2013). http://vietnam.vnanet.vn/vnp/vi-vn/13/117/117/35293/default.aspx (ngày 21/07/2013). http://www.aseantraveller.net/tin-tuc/714_banh-pia-dac-san-soc-trang.html (ngày 21/07/2013). http://vi.wikipedia.org/wiki/Tinh_b%E1%BB%99t (ngày 23/7/2013). http://www.starch.dk/isi/starch/starch.asp (ngày 23/07/2013). http://www.duoclieu.org/2012/01/tinh-bot.html (ngày 25/07/2013). http://tai-lieu.com/tai-lieu/de-tai-nghien-cuu-tuyen-chon-mot-so-chung-vi-sinh-vat-cokha-nang-phan-huy-tinh-bot-va-ung-dung-trong-xu-ly-nuoc-thai-6991(ngày 25/07/2013). http://tudienthuoc.org (ngày 06/03/2014). http://www.quorumtech.com/image-gallery/low-angle-rotary-shadowing-images (ngày 06/03/2014). http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (ngày 29/3/2014). 58 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết 1. Số liệu kết khả phân hủy tinh bột dòng vi khuẩn phân lập. Đƣờng kính (mm) Dòng Lần STT vi khuẩn Lần Lần Vòng Khuẩn Vòng Khuẩn Vòng Khuẩn sáng (D) lạc (d) sáng (D) lạc (d) sáng (D) lạc (d) ĐC 45 35 43 33 47 36 M10 19 17 20 18 22 19 M0 42 36 35 30 38 33 T6 33 27 34 29 28 24 Q6 44 40 40 37 45 41 Q9 47 39 49 40 52 44 Q5 43 33 40 31 45 34 Q7 37 19 37 23 32 18 *Ghi chú: ĐC dòng đối chứng VD2. 2. Số liệu đếm mật số tế bào dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột. Mật số tế bào vi khuẩn (CFU/ml) STT Dòng vi khuẩn 0h 24h 48h 72h Q5 266,6 x 105 288,8 x 107 222,2 x 107 133,3 x 107 Q7 377,7 x 105 400,0 x 107 577,8 x 107 466,6 x 107 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Phụ lục 2: Kết phân tích thống kê Kết phân tích khả phân giải tinh bột dòng vi khuẩn One-way ANOVA: D/d versus Dòng vi khuẩn Source DF SS MS F P Dòng vi khuẩn 1,02712 0,14673 85,89 0,000 Error 16 0,00171 Total 23 1,05445 Grouping Information Using Fisher Method: 95,0 percent LSD Dòng vi khuẩn N Mean Grouping Q7 1,78333 A Q5 1,30333 B ĐC 1,29333 B Q9 1,20000 C T6 1,18333 C M0 1,15667 CD M10 1,13000 CD Q6 1,09000 D Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... của vi sinh vật trong nước thải bánh Pía và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột tốt trong nước thải sản xuất bánh Pía nên đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ nƣớc thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng được tiến hành 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột trong nước thải. .. cứu phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tại làng nghề sản xuất bột gạo tại thị xã Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp, góp phần bảo vệ nguồn nước cho cộng đồng trong khu vực Trong số 23 dòng vi khuẩn phân lập được trong 25 mẫu nước thải thu được có 13 dòng vi khuẩn thuộc gram âm và 10 dòng vi khuẩn thuộc gram dương Các dòng vi khuẩn phân lập được có hoạt tính enzyme amylase từ 72,44U/ml đến... hiệu bánh Pía: Tân Huê Vi n, Quảng Hưng, Lập Hưng, Công Lập Thành, và hơn 50 lò bánh Pía ở làng nghề Vũng Thơm (http://www.soctrang.gov.vn, ngày 21/07/2013) Bánh Pía có nguồn gốc từ bánh trung thu kiểu Tô Châu (loại bột bánh có nhiều lớp mỏng và nhân bánh có trộn mỡ) Bánh do một số người Minh Hương di cư sang Vi t Nam từ thế kỷ 17 mang theo Trước đây, vi c làm bánh Pía hoàn toàn mang tính thủ công và. .. bùn và nước thải nhà máy sản xuất tinh bột, phân lập và tuyển chọn được 6 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột mạnh Các thí nghiệm xử lý đều đạt tiêu chuẩn xả thải loại B theo QCVN 24: 2009/BTNMT (http://tai-lieu.com/tai-lieu, ngày 01/08/2013) Các nghiên cứu hiện trạng và giải pháp xử lý nước thải cho làng nghề tinh bột Hoài Hảo-Tỉnh Bình Định, nhóm nghiên cứu đã đề nghị xử lý nước thải tinh bột. .. 72,44U/ml đến 910,89U/ml sau 72 giờ nuôi cấy Trong số này có 4 dòng có hoạt tính enzyme amylase cao 935, VD2, 92 và 16, Hai dòng 935 và VD2 có khả năng xử lý đến 97% lượng tinh bột có trong nước thải chỉ sau 24 giờ Vi c nghiên cứu, phân lập các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme amylase và ứng dụng các vi sinh vật này vào xử lý nước thải tinh bột là một vi c làm rất thiết thực, mang tính ứng dụng (http://www.canthostnews.vn/?tabid=230&NDID=15973&keyword=Phan-lap-cacdong -vi- khuan-co-kha-nang-phan-huy -tinh- bot,... điều này đủ chứng tỏ bánh Pía Sóc Trăng đã đi vào lòng người như thế nào Bánh Pía Sóc Trăng đã từng có mặt trong nhiều kỳ hội chợ được tổ chức trên khắp cả nước, được tặng thưởng nhiều huy chương vàng và đạt danh hiệu “hàng Vi t Nam chất lượng cao được người tiêu dùng bình chọn Ngày nay bánh Pía Sóc Trăng đã có mặt tại nhiều nơi trên thế giới, là cơ hội để tên tuổi bánh Pía Sóc Trăng vươn cao, bay... trình sinh tổng hợp Trong nhóm này có vi khuẩn Nitrat hóa, vi khuẩn sắt, vi khuẩn lưu huỳnh, Vi khuẩn dị dưỡng: Nhóm vi khuẩn này sử dụng các chất hữu cơ làm nguồn carbon dinh dưỡng, nguồn năng lượng để hoạt động sống, xây dựng tế bào và phát triển, Có ba loại vi khuẩn dị dưỡng:  Vi khuẩn hiếu khí: Là loại cần oxy để sống  Vi khuẩn kỵ khí: Chúng có thể sống và hoạt động ở điều kiện kỵ khí (không... trường có chứa tinh bột của hai hệ thống xử lý nước thải chế biến khoai tây (H Weber et al., 1990) Kết quả nghiên cứu của Shalini Aggarwal (2006) đã phân lập được dòng vi khuẩn trong nước thải có khả năng phân hủy tinh bột và chuyển hóa các phân tử đường thành acid lactic Vi khuẩn này đã được ứng dụng vào xử lý nước thải của ngành chế biến thực phẩm, đồng thời biến nước thải trở nên có giá trị và là nguyên... môn, và thơm mùi bột mì của vỏ bánh nướng vàng 5 Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Hình 1 Bánh Pía thành phẩm (*Nguồn: http://tanhuevien.com.vn/san-pham/c2-Banh-Pia.html , ngày 06/03/2013) Thông thường, bánh Pía Sóc Trăng có hai loại là bánh Pía khoai môn và bánh Pía đậu xanh Muốn có được mùi vị, màu sắc hấp dẫn, bánh Pía. .. trong nước thải từ làng nghề làm bánh Pía ở Sóc Trăng Khảo sát hoạt tính enzyme amylase của các dòng vi khuẩn này và định danh dòng vi khuẩn triển vọng bằng kỹ thuật PCR 2 Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Như chúng . có khả năng phân hủy tinh bột từ nước thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng. Từ ba mẫu nước thải thu được ở làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng, mười tám dòng vi khuẩn được phân lập trên môi. dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ nƣớc thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng được tiến hành. 1.2 . Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy. vi sinh vật trong nước thải bánh Pía và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột tốt trong nước thải sản xuất bánh Pía nên đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số dòng