BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG THỂ QUẢ VÀ SINH KHỐI NUÔI CẤY CHÌM CỦA NẤM LINH CHI GIỐNG NHẬT (Ganoderma lucidum) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU NGUYỄN NGỌC THANH MSSV: 3102779 LỚP: CNSHTT K36 Cần Thơ, Tháng 11/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG THỂ QUẢ VÀ SINH KHỐI nuôi cấy chìm CỦA NẤM LINH CHI GIỐNG NHẬT (Ganoderma lucidum) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU NGUYỄN NGỌC THANH MSSV: 3102779 LỚP: CNSHTT K36 Cần Thơ, Tháng 11/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Ngọc Thanh DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại Học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu thực đề tài này. Xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu vừa giảng viên vừa cán hướng dẫn em. Trong suốt trình học tập thực luận văn, cô giúp đỡ, truyền thụ kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn Cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập, người quan tâm, chia sẻ, giúp đỡ động viên em suốt trình học tập nghiên cứu. Cảm ơn bạn Nguyễn Trung Duẩn, Nguyễn Thị Diễm An, tập thể lớp Công nghệ sinh học tiên tiến khóa 36, em sinh viên lớp Công nghệ sinh học khóa 37, Vi sinh vật 37, Công nghệ sinh học khóa 38 Công nghệ sinh học tiên tiến khóa 38 giúp đỡ em trình học tập thực luận văn. Cảm ơn cán quản lý phòng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đề tài anh chị nhiệt tình chia sẻ kiến thức kinh nghiệm cho em hoàn thành tốt đề tài. Ngoài ra, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ em vật chất lẫn tinh thần suốt trình học tập, nghiên cứu thực luận văn tốt nghiệp. Kính chúc quý thầy cô, anh chị tất bạn sinh viên dồi sức khỏe thành công công việc. Cần thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2014 Nguyễn Ngọc Thanh Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) biết đến từ xa xưa loại nấm dược liệu quý với nhiều tác dụng dược lý quan trọng nhờ vào thành phần hoạt chất phong phú đa dạng. Loài nấm nuôi trồng nhân tạo để thu hoạch thể từ thập niên trước, phương pháp nuôi cấy chìm bắt đầu áp dụng sản xuất nấm Linh chi. Tuy nhiên, nghiên cứu thành phần hoạt chất thể sinh khối nuôi cấy chìm nấm Linh chi Việt Nam ít. Do đó, đề tài “Xác định số hoạt chất thể sinh khối nuôi cấy chìm nấm Linh chi giống Nhật (Ganoderma lucidum)” tiến hành nhằm xác định so sánh số hoạt chất quan trọng khả kháng khuẩn thể khuẩn ty nuôi cấy chìm Ganoderma lucidum. Phân tích định tính sơ cho thấy hai mẫu Linh chi chứa triterpenoid, alkaloid saponin. Kết phân tích định lượng cho thấy hàm lượng polysaccharide acid ganoderic thể nấm Linh chi 2,730% 10,815%. Hàm lượng hoạt chất khuẩn ty nuôi cấy chìm cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với hàm lượng mẫu thể quả, hàm lượng polysaccharide acid ganoderic 2,830% 13,773%. Nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết methanol từ thể khuẩn ty chống lại vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922 4,5 mg/mL 1,8 mg/mL, cho thấy khuẩn ty nuôi cấy chìm thể hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn. Từ khóa: Hoạt chất, khuẩn ty, nồng độ ức chế tối thiểu, nấm Linh chi, thể Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ ii TÓM LƯỢC . i MỤC LỤC . ii DANH SÁCH BẢNG .v DANH SÁCH HÌNH vi TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu . CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .2 2.1. Khái quát Nấm . 2.2. Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) . 2.2.1. Khái quát chung nấm Linh chi . 2.2.2. Phân loại khoa học 2.2.3. Đặc điểm hình thái chu trình sống nấm Linh chi 2.2.4. Thành phần hóa học tác dụng dược lý nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) 2.2.5. Công dụng nấm Linh chi 10 2.3. Giới thiệu sơ lược số hoạt chất sinh học nấm Linh chi 13 2.3.1. Polysaccharide 13 2.3.2. Triterpenoid 15 2.3.3. Alkaloid 17 2.3.4. Saponin . 18 2.4. Một số phương pháp hóa học phân tích dược liệu 19 2.4.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu 19 2.4.2. Phương pháp Phenol-sulfuric acid (PSA) . 19 2.4.3. Phương pháp Liebermann-Burchard . 20 Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.4.4. Các loại thuốc thử chung cho alkaloid 20 2.5. Một số nghiên cứu thành phần dược tính nấm Linh chi . 21 2.5.1. Nghiên cứu nước . 21 2.5.2. Nghiên cứu nước . 22 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1. Thời gian địa điểm . 24 3.2. Đối tượng phạm vi nghiên cứu . 24 3.3. Phương tiện nghiên cứu . 24 3.3.1. Dụng cụ . 24 3.3.2. Thiết bị 24 3.3.3. Hóa chất 24 3.3.4. Vật liệu 26 3.4. Phương pháp nghiên cứu . 26 3.4.1. Chuẩn bị mẫu 26 3.4.2. Xác định so sánh số thành phần dược tính quan trọng thể khuẩn ty nuôi cấy chìm chìm nấm Linh chi 27 3.4.3. So sánh khả kháng khuẩn cao chiết từ thể từ khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi vi khuẩn Escherichia coli ATCC 29522 . 34 3.4.4. Xử lý số liệu 35 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 4.1. Xác định so sánh số thành phần dược tính quan trọng thể khuẩn ty nuôi cấy chìm chìm nấm Linh chi 36 4.1.1. Phân tích định tính số thành phần dược tính thể khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi 36 4.1.2. Xác định so sánh hàm lượng polysaccharide acid ganoderic thể khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi . 40 4.2. So sánh khả kháng khuẩn cao chiết từ thể từ khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi vi khuẩn Escherichia coli .43 4.2.1. Thử tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán giấy lọc . 43 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 4.2.2. Xác định MIC phương pháp pha loãng thạch . 43 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1. Kết luận . 46 5.2. Đề nghị . 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .47 PHỤ LỤC . Phụ lục 1: Các hình ảnh Phụ lục 2: Kết thí nghiệm 1. Thử nghiệm định tính saponin thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum 2. Xác định so sánh hàm lượng polysaccharide thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum . 3. Xác định so sánh hàm lượng acid ganoderic thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum . 4. So sánh khả kháng khuẩn cao chiết từ thể từ khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi vi khuẩn Escherichia coli ATCC 29522 . Phụ lục 3: Kết phân tích thống kê phần mềm Minitab 16.0 . 1. Định tính saponin thử nghiệm tính tạo bọt 2. So sánh hàm lượng polysaccharide thể khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi . 3. So sánh hàm lượng acid ganoderic thể khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi . 4. So sánh khả kháng khuẩn cao chiết từ thể từ khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi vi khuẩn Escherichia coli ATCC 29522 . Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Hàm lượng polysaccharide triterpenoid từ 11 sản phẩm nấm Linh chi (G. lucidum) thương mại thị trường .8 Bảng 2: Các hoạt chất sinh học dẫn xuất chúng nấm Linh chi .9 Bảng 3: Thành phần cho L môi trường CYM lỏng 25 Bảng 4: Thành phần cho L môi trường MHA 26 Bảng 5: Bố trí thử nghiệm định tính triterpenoid 28 Bảng 6: Bố trí thử nghiệm định tính alkaloid 29 Bảng 7: Thành phần dung dịch dùng để dựng đường chuẩn glucose 32 Bảng 8: Thành phần dung dịch dùng để dựng đường chuẩn thymol 33 Bảng 9: Kết phân tích định tính sơ thành phần dược tính thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum .36 Bảng 10: Chiều cao trung bình cột bọt .40 Bảng 11: Kết thử tính kháng khuẩn cao chiết methanol từ thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum .43 Bảng 12: Kết xác định MIC cao chiết methanol từ thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum .44 Bảng 13: Chiều cao cột bọt thử nghiệm tính tạo bọt (đơn vị: cm) Phụ lục Bảng 14: Giá trị OD xây dựng đường chuẩn D-glucose Phụ lục Bảng 15: Hàm lượng polysaccharide thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum Phụ lục Bảng 16: Giá trị OD xây dựng đường chuẩn thymol . Phụ lục Bảng 17: Hàm lượng acid ganoderic thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum Phụ lục Bảng 18: Đường kính vòng vô khuẩn cao chiết methanol từ thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum . Phụ lục Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Chu kì phát triển nấm Linh chi Hình 2. Kết phân tích định tính thành phần triterpenoid 37 Hình 3. Kết định tính alkaloid với thuốc thử Dragendorff .38 Hình 4. Kết định tính alkaloid với thuốc thử Wagner 38 Hình 5. Kết định tính alkaloid với thuốc thử Mayer 39 Hình 6. Kết thử nghiệm tính tạo bọt .39 Hình 7. Hàm lượng polysaccharide acid ganoderic thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum .41 Hình 8. Một số thiết bị sử dụng trình nghiên cứu Phụ lục Hình 9. Mẫu nấm Linh chi . Phụ lục Hình 10. Quá trình chiết xuất định lượng polysaccharide Linh chi Phụ lục Hình 11. Quá trình chiết xuất định lượng acid ganoderic Linh chi Phụ lục Hình 12. Kết xác định MIC cao chiết thể . Phụ lục Hình 13. Kết xác định MIC cao chiết khuẩn ty nuôi cấy chìm Phụ lục Hình 14. Đường chuẩn D-glucose . Phụ lục Hình 15. Đường chuẩn thymol Phụ lục Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Nielsen, S.S. 2010. Chapter 6: Phenol-Sulfuric Acid Method for Total Carbohydrates. In Food Analysis Laboratory Manual, Food Science Texts Series 2010. United State of America: Springer Science + Business Media, pp. 47-53. Ogbe, A.O., S.E. Atawodi, P.A. Abdu, A. Sannusi and A.E. Itodo. 2009. Changes in weight gain, faecal oocyst count and packed cell volume of Eimeria tenellainfected broilers treated with a wild mushroom (Ganoderma lucidum) aqueous extract. Journal of the South African Veterinary Association, 80(2):97–102. Ofodile, L.N. 2011. Effect of the Mycelial Culture of Ganoderma lucidum on Human Pathogenic Bacteria. International Journal of Biology, 3(2):111-114. Ooi, V.E.C. and F. Liu. 2000. Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide–protein complexes. Current Medical Chemistry, (7):715–729. Quereshi, S., A.K. Pandey, S.S. Sandhu. 2010. Evaluation of antibacterial activity of different Ganoderma lucidum extracts. People’s Journal of Scientific Research, 3(1):9-13. Roy, U. 2006. Reishi Mushroom Ganoderma lucidum Standards of Analysis, Quality Control, and Therapeutics. American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium, pp. 1-23. Sarker, S.D. and L. Nahar. 2007. Chemistry for Pharmacy Students: General, Organic and Natural Product Chemistry. Chichester, England: John Wiley & Sons, pp. 288-302. Segelman, A.B. and N.R. Farnsworth. 1969. Biological and phytochemical screening of plants. IV. A new rapid procedure for the simultaneous determination of saponins and tannins. Lloydia, 32:59-65. Shamaki, B.U., U.K. Sandabe, I.A. Fanna, O.O. Adamu, Y.A. Geidam, I.I. Umar and M.S. Adamu. 2012. Proximate Composition, Phytochemical and Elemental Analysis of Some Organic Solvent Extract of The Wild Mushroom-Ganoderma lucidum. Journal of Natural Sciences Research, 2(4):24-35. Skalicka-Woźniak, K., J. Szypowski, R. Łoś, M. Siwulski, K. Sobieralski, K. Głowniak and A. Malm. 2012. Evaluation of polysaccharides content in fruit bodies and their antimicrobial activity of four Ganoderma lucidum (W Curt.: Fr.) Chuyên ngành Công nghệ sinh học 51 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT P. Karst. strains cultivated on different wood type substrates. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 81(1):17-21. Sood, G., S. Sharma, S. Kapoor and P.K. Khanna. 2013. Optimization of extraction and characterization of polysaccharides from medicinal mushroom Ganoderma lucidum using response surface methodology. Journal of Medicinal Plants Research, 7(31):2323-2329. Swanholm, C.E., H.S. John and P.J. Scheuer. 1959. A Survey for Alkaloids in Hawaiian Plants. I, Pacific Science, 8:295-305. Tang, Y.J., J.J. Zhong. 2002. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme and Microbial Technology, 31:(2002):20-28. Toai, T.D., V.N. Ban, L.C. Tu, N.T. Hanh. 2005. Study on polysaccharide (1,3)-β-Dglucan from Ganoderma lucidum. Journal of Chemistry, 43(2):258-262. Trigos, A. and J.S. Medellín. 2011. Biologically active metabolites of the genus Ganoderma: Three decades of myco-chemistry research. Revista Mexicana de Micología, 34:63-83. Wagner, H., S. Bladt and V. Rickl. 1996. Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas (2nd edition). Berlin: Springer, pp. 360. Wasser, S.P. 2010. Reishi. In Encyclopedia of Dietary Supplements (2nd edition), eds. P.M. Coates, J.M. Betz, M.R. Blackman, G.M. Cragg, M. Levine, J. Moss, J.D. White. New York-London: Informa Healthcare, pp. 680-690. Wasser, S.P., A.L. Weis. 1999. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives (review). International Journal of Medicinal Mushrooms, 1(1):31–62. Wachtel-Galor S., J. Yuen, J.A. Buswell and I.F.F. Benzie. 2011. Chapter Ganoderma lucidum (Lingzhi or Reishi)  A Medicinal Mushroom. In Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects, eds. I.F.F. Benzie and S. WachtelGalor. Boca Ratonm (Florida): CRC Press, pp.175-199. Xu J., R.Q. Yue, J. Liu, H.M. Ho, T. Yi, H.B. Chen, Q.B. Han. 2014. Structural diversity requires Chuyên ngành Công nghệ sinh học individual optimization of 52 ethanol concentration in Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 polysaccharide Trường ĐHCT precipitation. International Journal of Biological Macromolecules, 67:205-209. Trang web Microbe Wiki. 2011. Ganoderma lucidum. Accessed on 20/05/2014, from https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Ganoderma_lucidum#Description_and _significance Nguyễn Hoàng Tuấn. 2012a. Chiết xuất phân lập chất từ dược liệu. Truy cập ngày 20/06/2014, từ http://www.duoclieu.org/2012/07/chiet-xuat-phan-lap-cacchat-tu-duoc-lieu.html Nguyễn Hoàng Tuấn. 21/05/2014, 2012b. Tính chất chung alkaloid. Truy cập ngày từ http://www.duoclieu.org/2012/02/tinh-chat-chung-cua- alcaloid.html Kuo, M. 2004. Ganoderma lucidum. Accessed on 19/05/2014, from http://www.mushroomexpert.com/ganoderma_lucidum.html NAMMEX. 2011. Active Compounds in Reishi Mushrooms. Accessed on 20/06/2014, from http://www.nammex.com/MedicinalMushroomArticles/activeCompoundsReishi. html NCBI. 2012. Ganoderma lucidum. Accessed on 20/05/2014, from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=5315 Chuyên ngành Công nghệ sinh học 53 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hình ảnh Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Hình 8. Một số thiết bị sử dụng trình nghiên cứu A. Máy vortex; B. Cân phân tích; C. Nồi khử trùng; D. Tủ đông lạnh; E. Tủ cấy; F. Tủ sấy; G. Máy cất nước; H. Lò vi sóng; I. Máy quang phổ; J. Máy lắc; K. Máy đo pH; L. Tủ hút; M. Bể điều nhiệt Hình 9. Mẫu nấm Linh chi A. Thể trước xay nhuyễn; B. Thể sau xay nhuyễn; C. Khuẩn ty trước sấy; D. Khuẩn ty sau sấy tán nhuyễn. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Hình 10. Quá trình chiết xuất định lượng polysaccharide Linh chi A. Trung hòa dung dịch qua lọc; B. Thẩm tích; C. Kết tủa polysaccharide tạo thành ethanol 96%; D. Dãy dung dịch dùng để dựng đường chuẩn D-glucose. Hình 11. Quá trình chiết xuất định lượng acid ganoderic Linh chi A. Chiết xuất GA chloroform; B. Muối GA không tan chloroform; C. Chiết xuất GA chloroform lần 2; D. Dãy dung dịch để dựng đường chuẩn thymol. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Hình 12. Kết xác định MIC cao chiết thể A: Cao chiết gốc; B: Pha loãng lần; C: Pha loãng lần; D: Pha loãng lần; E: Pha loãng 16 lần; F: Đối chứng. (*Ghi chú: Mỗi đĩa gồm 0,4 mL dung dịch cao chiết + 4,6 mL MHA) Hình 13. Kết xác định MIC cao chiết khuẩn ty nuôi cấy chìm A: Cao chiết gốc; B: Pha loãng lần; C: Pha loãng lần; D: Pha loãng lần; E: Pha loãng 16 lần; F: Đối chứng. (*Ghi chú: Mỗi đĩa gồm 0,4 mL dung dịch cao chiết + 4,6 mL MHA) Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Phụ lục 2: Kết thí nghiệm 1. Thử nghiệm định tính saponin thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum Bảng 13: Chiều cao cột bọt thử nghiệm tính tạo bọt (đơn vị: cm) Mẫu Thể Khuẩn ty nuôi cấy chìm Đối chứng Lần Lần Lần Trung bình 1,50 1,50 1,40 1,47 1,40 1,35 1,40 0,00 0,00 0,00 1,38 0,00 2. Xác định so sánh hàm lượng polysaccharide thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum Bảng 14: Giá trị OD xây dựng đường chuẩn D-glucose Giá trị OD (490 nm) Lần Lần Lần Trung bình Trung bình ODmẫu  Trung bình ODnước (Nước) 0,179 0,183 0,186 0,183 0,316 0,309 0,311 0,312 0,129 0,514 0,522 0,518 0,518 0,335 0,776 0,773 0,772 0,774 0,591 1,051 1,035 1,043 1,043 0,86 1,363 1,378 1,377 1,373 1,190 1,931 1,936 1,935 1,934 1,751 Ống nghiệm Hình 14. Đường chuẩn D-glucose Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Giá trị R2 = 0,9842 > 0,95, nên phương trình có độ tin cậy cao. Bảng 15: Hàm lượng polysaccharide thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum Thể Khuẩn ty nuôi cấy chìm Lần 1,324 1,372 Lần 1,323 1,368 Lần 1,326 1,369 Trung bình 1,324 1,370 Trung bình ODmẫu  Trung bình ODnuớc 1,141 1,187 Lượng polysaccharide thu (mg) 54,577 56,599 Hàm lượng polysaccharide (%) 2,730 2,830 Mẫu Giá trị OD (490 nm) (*Ghi chú: Lượng polysaccharide tính theo công thức: Lượng polysaccharide (mg) = [(Trung bình ODmẫu  Trung bình ODnước) + 0,1008]/9,1012*HSPL (HSPL = 400) 3. Xác định so sánh hàm lượng acid ganoderic thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum Bảng 16: Giá trị OD xây dựng đường chuẩn thymol Giá trị OD (245 nm) Lần Lần Lần Trung bình Trung bình ODmẫu  Trung bình OD ethanol tuyệt đối (Ethanol tuyệt đối) 0,539 0,538 0,541 0,539 0,569 0,568 0,567 0,568 0,029 0,571 0,573 0,573 0,572 0,033 0,616 0,619 0,618 0,618 0,079 0,679 0,682 0,680 0,680 0,141 0,817 0,815 0,817 0,816 0,277 1,043 1,042 1,039 1,041 0,502 1,544 1,542 1,542 1,543 1,004 Ống nghiệm Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Hình 15. Đường chuẩn nồng độ thymol Giá trị R2 = 0,9994 > 0,95, nên phương trình có độ tin cậy cao. Bảng 17: Hàm lượng acid ganoderic thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum Thể Khuẩn ty nuôi cấy chìm Lần 0,928 1,086 Lần 0,923 1,089 Lần 0,925 1,084 Trung bình 0,925 1,086 Trung bình ODmẫu  Trung bình ODethanol tuyệt đối 0,386 0,547 Lượng acid ganoderic thu (mg) 216,228 275,477 Hàm lượng acid ganoderic (%) 10,815 13,773 Mẫu Giá trị OD (245 nm) (*Ghi chú: Lượng acid ganoderic tính theo công thức: Lượng acid ganoderic (mg) = [(Trung bình ODmẫu  Trung bình ODethanol tuyệt đối)  0,0144]/1,5467*HSPL (HSPL mẫu thể = 900, HSPL mẫu khuẩn ty = 800) Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 4. So sánh khả kháng khuẩn cao chiết từ thể từ khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi vi khuẩn Escherichia coli ATCC 29522 Bảng 18: Đường kính vòng vô khuẩn cao chiết methanol từ thể khuẩn ty nuôi cấy chìm G. lucidum Loại cao chiết Thể Khuẩn ty nuôi cấy chìm Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 225 mg/mL 112,5 mg/mL 56,25 mg/mL 28,125 mg/mL 14,0625 mg/mL 7,03125 mg/mL Lần Lần Lần Trung bình Lần 10 Lần 10 6,95 Lần 10 7,05 Trung bình 10 Đối chứng Phụ lục 3: Kết phân tích thống kê phần mềm Minitab 16.0 1. Định tính saponin thử nghiệm tính tạo bọt Descriptive Statistics: Chiều cao cột bọt Total Variable Mẫu Count Mean SE Mean StDev Variance CoefVar Chiều cao cột bọt Khuẩn ty 1,3833 0,0167 0,0289 0,0008 2,09 Thể 1,4667 0,0333 0,0577 0,0033 3,94 One-way ANOVA: Chiều cao cột bọt versus Mẫu Source DF SS MS F P Mẫu 0,01042 0,01042 5,00 0,089 Error 0,00833 0,00208 Total 0,01875 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 S = 0,04564 R-Sq = 55,56% Trường ĐHCT R-Sq(adj) = 44,44% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev Khuẩn ty 1,3833 0,0289 Thể 1,4667 0,0577 --+---------+---------+---------+------(------------*-----------) (-----------*------------) --+---------+---------+---------+------1,320 1,380 1,440 1,500 Pooled StDev = 0,0456 Grouping Information Using Fisher Method Mẫu N Mean Grouping Thể 1,46667 A Khuẩn ty 1,38333 A Means that not share a letter are significantly different. 2. So sánh hàm lượng polysaccharide thể khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi Descriptive Statistics: Hàm lượng polysaccharide Total Variable Mẫu Count Mean SE Mean StDev Variance Hàm lượng polysaccharide Khuẩn ty 2,8293 0,00240 0,00416 0,00002 Thể 2,7297 0,00176 0,00306 0,00001 Variable Mẫu CoefVar Hàm lượng polysaccharide Khuẩn ty 0,15 Thể 0,11 One-way ANOVA: Hàm lượng polysaccharide versus Mẫu Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Source Trường ĐHCT DF SS MS F P Mẫu 0,0149002 0,0149002 1117,51 0,000 Error 0,0000533 0,0000133 Total 0,0149535 S = 0,003651 R-Sq = 99,64% R-Sq(adj) = 99,55% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev Khuẩn ty 2,82933 0,00416 Thể 2,72967 0,00306 --+---------+---------+---------+------(-*-) (-*-) --+---------+---------+---------+------2,730 2,760 2,790 2,820 Pooled StDev = 0,00365 Grouping Information Using Fisher Method Mẫu N Mean Khuẩn ty 2,82933 Thể 2,72967 Grouping A B Means that not share a letter are significantly different. 3. So sánh hàm lượng acid ganoderic thể khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi Descriptive Statistics: Hàm lượng acid ganoderic Total Variable Mẫu Hàm lượng acid ganoderic Chuyên ngành Công nghệ sinh học Count Mean SE Mean StDev Variance Khuẩn ty 13,773 0,0353 0,0611 0,0037 Thể 10,815 0,0397 0,0687 0,0047 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Variable Mẫu CoefVar Hàm lượng acid ganoderic Khuẩn ty 0,44 Thể 0,64 One-way ANOVA: Hàm lượng acid ganoderic versus Mẫu Source DF SS MS F P Mẫu 13,12760 13,12760 3104,06 0,000 Error 0,01692 0,00423 Total 13,14452 S = 0,06503 R-Sq = 99,87% R-Sq(adj) = 99,84% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+--- Khuẩn ty 13,7733 0,0611 (*) Thể 10,8150 0,0687 (*) ------+---------+---------+---------+--11,20 12,00 12,80 13,60 Pooled StDev = 0,0650 Grouping Information Using Fisher Method Mẫu N Mean Khuẩn ty 13,7733 Thể 10,8150 Grouping A B Means that not share a letter are significantly different. 4. So sánh khả kháng khuẩn cao chiết từ thể từ khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi vi khuẩn Escherichia coli ATCC 29522 One-way ANOVA: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) versus Cao chiết Source Cao chiết DF SS 152,0000 Chuyên ngành Công nghệ sinh học MS 76,0000 F * P * Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Error Total S = 0,0000 152,0000 R-Sq = 100,00% Level Đối chứng Khuẩn ty 225 Thể 225 Level Đối chứng Khuẩn ty 225 Thể 225 N 3 Trường ĐHCT 0,0000 R-Sq(adj) = 100,00% Mean 0,0000 10,0000 6,0000 StDev 0,0000 0,0000 0,0000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------* * * +---------+---------+---------+--------0,0 2,5 5,0 7,5 Pooled StDev = 0,0000 Grouping Information Using Fisher Method Cao chiết Khuẩn ty 225 Thể 225 Đối chứng N 3 Mean 10,0000 6,0000 0,0000 Grouping A B C Means that not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) versus Cao chiết Source Cao chiết Error Total S = DF SS 162,0000 0,0000 162,0000 R-Sq = 100,00% Level Đối chứng Khuẩn ty 112,5 Thể 112,5 Level Đối chứng Khuẩn ty 112,5 Thể 112,5 N 3 MS 81,0000 0,0000 F * P * R-Sq(adj) = 100,00% Mean 0,00000 9,00000 0,00000 StDev 0,00000 0,00000 0,00000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------* * * +---------+---------+---------+--------0,0 2,5 5,0 7,5 Pooled StDev = 0,00000 Grouping Information Using Fisher Method Cao chiết Khuẩn ty 112,5 Thể 112,5 Đối chứng N 3 Mean 9,00000 0,00000 0,00000 Grouping A B B Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT One-way ANOVA: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) versus Cao chiết Source Cao chiết Error Total DF S = 0,02887 SS 98,00000 0,00500 98,00500 Level Đối chứng Khuẩn ty 56,25 Thể 56,25 R-Sq = Level Đối chứng Khuẩn ty 56,25 Thể 56,25 N 3 MS 49,00000 0,00083 99,99% Mean 0,0000 7,0000 0,0000 F 58800,00 P 0,000 R-Sq(adj) = 99,99% StDev 0,0000 0,0500 0,0000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------* * * +---------+---------+---------+--------0,0 2,0 4,0 6,0 Pooled StDev = 0,0289 Grouping Information Using Fisher Method Cao chiết Khuẩn ty 56,25 Thể 56,25 Đối chứng N 3 Mean 7,0000 0,0000 0,0000 Grouping A B B Means that not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học [...]... nghiên cứu và áp dụng để nuôi và thu sinh khối của loài nấm này Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu xác định và so sánh thành phần dược tính trong thể quả và sinh khối nuôi cấy chìm của nấm Linh chi giống Nhật ở Việt Nam Để góp phần vào nghiên cứu thành phần dược tính trong Linh chi, đề tài Xác định một số hoạt chất trong thể quả và sinh khối nuôi cấy chìm của nấm Linh chi giống Nhật (Ganoderma lucidum) ... nuôi cấy chìm) của nấm Linh chi giống Nhật (Ganoderma lucidum) Phạm vi nghiên cứu: Xác định sự hiện diện và so sánh hàm lượng của một số thành phần dược tính (polysaccharide, triterpenoid, saponin, alkaloid) ở thể quả được trồng trên mùn cưa và khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi giống Nhật (Ganoderma lucidum), so sánh khả năng kháng khuẩn của cao nấm Linh chi được chi t xuất từ hai mẫu nấm trên 3.3... chi t thể quả) 10,97 1,06 E (cao chi t thể quả) 7,51 0,44 F (cao chi t thể quả) 6,18 1,78 G (cao chi t thể quả) 13,30 1,44 H (cao chi t thể quả) 15,80 0,50 I (cao chi t thể quả) 7,66 7,82 J (bột thể quả) 1,10 0,46 K (bột khuẩn ty) 12,78 Không thể xác định (*Nguồn: Chang và Buswell, 2008) Polysaccharide và triterpenoid được xem là những hoạt chất quan trọng nhất trong Linh chi (Skalicka-Woźniak et al.,... Nhật (Ganoderma lucidum) được thực hiện 1.2 Mục tiêu Xác định và so sánh một số dược chất quan trọng và khả năng kháng khuẩn của thể quả và sinh khối khuẩn ty được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy chìm của nấm Linh chi giống Nhật (Ganoderma lucidum) để làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất dược phẩm Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014... kháng nấm từ thể quả G lucidum Một số lectin được tách chi t từ thể quả và khuẩn ty của Linh chi có khả năng làm đông tụ hồng cầu hoặc tăng cường chức năng miễn dịch Các thành phần khác bao gồm enzyme như metalloprotease làm chậm quá trình đông máu; tác nhân ức chế α-glucosidase rất đặc hiệu từ thể quả của Linh chi, Bảng 2 giới thiệu tóm tắt hoạt tính của một số hoạt chất quan trọng trong Linh chi 2.2.5... phần hóa học và tác dụng dược lý của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) G lucidum không chứa nhiều chất dinh dưỡng để tạo ra năng lượng như các loài nấm ăn khác nhưng lại có các dược chất quý mà ở các loài nấm ăn khác có rất ít Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chất và xác định tác dụng dược lý của chúng trong thể quả, khuẩn ty, bào tử và dịch nuôi cấy của nấm Wasser... từ thể quả, khuẩn ty hoặc bào tử của Linh chi (Wachtel-Galor et al., 2011) Các nghiên cứu cho thấy có sự khác nhau về tính chất và hàm lượng của thành phần hóa học trong các sản phẩm từ Linh chi do nhiều yếu tố (Wasser, 2010) Tại Việt Nam, nấm Linh chi giống Nhật (loài Ganoderma lucidum) được xem là có thành phần hoạt chất phong phú và được trồng phổ biến để thu hoạch thể quả Phương pháp nuôi cấy chìm. .. về tính chất và hàm lượng của thành phần hóa học trong các sản phẩm từ G lucidum như nguồn gốc, chủng nấm, điều kiện nuôi trồng, phương pháp tách chi t (Wachtel-Galor et al., 2011) Bảng 2: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất của chúng trong nấm Linh chi Hoạt chất Nhóm chất Hoạt tính Bộ phận của nấm ARN Nucleic acid Kích thích hệ miễn dịch sản sinh interferon, chống virus Bào tử **(không xác định) Alkaloid... thái và chu trình sống của nấm Linh chi 2.2.3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) G lucidum thuộc họ Ganodermataceae bao gồm các nấm đảm đa tầng (nhiều lỗ) có bào tử đảm hai vách (Wachtel-Galor et al., 2011) Nấm có thể mọc thành cụm hoặc đơn lẻ Phần thịt của thể quả nấm Linh chi có màu nâu, mềm xốp nhưng hóa gỗ theo thời gian Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh (2000) chỉ ra rằng thể. .. leucine và lysine Hàm lượng chất béo thấp và tỉ lệ acid béo không no cao là một trong những tính chất quan trọng tạo nên giá trị cho nấm Linh chi Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh (2000) trích dẫn kết quả phân tích của Viện nghiên cứu dược liệu Quảng Đông về tỉ lệ tương đối của một số thành phần hóa học trong nấm Linh chi hoang dại như sau: + Nước (trong nấm khô): 12  13% + Lignin: 13  14% + Hợp chất . tài Xác định một số hoạt chất trong thể quả và sinh khối nuôi cấy chìm của nấm Linh chi giống Nhật (Ganoderma lucidum) được tiến hành nhằm xác định và so sánh một số hoạt chất quan trọng cũng. sinh khối nuôi cấy chìm của nấm Linh chi giống Nhật ở Việt Nam. Để góp phần vào nghiên cứu thành phần dược tính trong Linh chi, đề tài Xác định một số hoạt chất trong thể quả và sinh khối nuôi. polysaccharide trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi 3. So sánh hàm lượng acid ganoderic trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi 4. So sánh khả năng kháng khuẩn của