BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CHITOSAN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. TRẦN THỊ XUÂN MAI HUỲNH HỮU KHIÊM MSSV: 3103340 LỚP: CNSHTT K36 Cần Thơ, Tháng 11/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CHITOSAN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. TRẦN THỊ XUÂN MAI HUỲNH HỮU KHIÊM MSSV: 3103340 LỚP: CNSHTT K36 Cần Thơ, Tháng 11/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Trần Thị Xuân Mai Huỳnh Hữu Khiêm DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ ĐỀ CƢƠNG ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh Học thuộc trƣờng Đại học Cần Thơ, nhận đƣợc nhiều quan tâm, động viên từ phía gia đình nhƣ hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức tận tình thầy cô với giúp đỡ, hỗ trợ bạn bè Viện nói chung bạn bè lớp nói riêng. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến: Ba mẹ, ngƣời quan tâm, động viên, ủng hộ tạo điều kiện tốt cho trình học tập thực luận văn. Cô Trần Thị Xuân Mai, cán hƣớng dẫn đồng thời cố vấn học tập, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm nhƣ quan tâm, hỗ trợ em trình thực luận văn tạo điều kiện tốt cho em thực thí nghiệm. Cô Nguyễn Thị Liên, cô Nguyễn Thị Pha thầy Võ Văn Song Toàn tạo điều kiện thuận lợi sẵn sàng giúp đỡ, hỗ trợ em trình thực luận văn. Các thầy cô giảng dạy truyền đạt cách tận tình cho em kiến thức chuyên môn kỹ quý báu quãng thời gian học tập trƣờng Đại học Cần Thơ. Các anh chị học viên cao học bạn sinh viên làm việc phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật, ngƣời tận tình giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn. Xin gửi đến tập thể lớp Công nghệ Sinh Học tiên tiến khóa 36 lời cảm ơn chân tình bên cạnh, đồng hành trình học tập nhƣ hoạt động khác suốt tháng ngày học giảng đƣờng đại học. Xin kính chúc quý thầy cô toàn thể bạn sinh viên thuộc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học lời chúc sức khỏe, may mắn thành công. Cần Thơ, ngày tháng Huỳnh Hữu Khiêm năm 2014 Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Đề tài “Phân lập tuyển chọn số dòng nấm có khả sản xuất chitosan” thực với mục tiêu phân lập số dòng mốc dùng để sản xuất trực tiếp chitosan. Trong trình nghiên cứu, dòng nấm mốc phân lập từ mẫu đất thu thập từ vùng ven biển thuộc tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng Bạc Liêu. Qua phương pháp nhận diện chitosan phương pháp hóa học cho thấy dòng nấm mốc với dòng Aspergillus niger Rhizopus oryzae có khả sản xuất chitosan. Kết nghiên cứu cho thấy lượng chitosan trích từ R. oryzae nhiều (71,7mg/g sinh khối sấy khô). Chitosan ly trích từ nấm sử dụng để kiểm tra khả kháng khuẩn kháng nấm. Thí nghiệm khảo sát khả kháng khuẩn cho thấy dung dịch chitosan trích từ dòng nấm R. oryzae ức chế phát triển vi khuẩn Escherichia coli sử dụng với nồng độ 500mg/L ức chế hoàn toàn phát triển vi khuẩn lây nhiễm mô nuôi cấy in vitro. Kết thí nghiệm khảo sát khả kháng nấm cho thấy chitosan trích từ R. oryzae giảm bớt phát triển nấm Collectotrichum gloeosporioides giảm bớt lây nhiễm loài nấm mốc khác mô nuôi cấy in vitro. Từ khóa: chitosan, dung môi, kháng khuẩn, kháng nấm, khối lƣợng. Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT . LỜI CẢM TẠ TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG . v DANH SÁCH HÌNH . vi CÁC TỪ VIẾT TẮT viii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề . 1.2. Mục tiêu CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Chitin 2.1.1. Sơ lƣợc chitin .2 2.1.2. Cấu trúc chitin 2.1.3. Tính tan chitin .3 2.1.4. Dẫn xuất chitin 2.1.5. Ứng dụng chitin 2.1.6. Sản xuất chitin công nghiệp .5 2.2. Chitosan 2.2.1. Sơ lƣợc chitosan .5 2.2.2. Cấu trúc chitosan 2.2.3. Tính tan chitosan 2.2.4. Ứng dụng chitosan 2.2.4.1. Ứng dụng mặt dƣợc liệu 2.2.4.2. Ứng dụng dƣợc lý 2.2.4.3. Ứng dụng nông nghiệp .7 2.2.4.4. Ứng dụng nuôi cấy mô .8 2.2.4.5. Ứng dụng công nghiệp thực phẩm 2.2.5. Sản xuất chitosan công nghiệp 2.3. Chitosan có nguồn gốc từ nấm . 2.3.1. Những nghiên cứu chitosan có nguồn gốc từ nấm .9 2.3.2. Triển vọng công nghiệp .10 2.3.3. Ƣu điểm việc tận dụng nấm làm nguồn nguyên liệu sản xuất chitosan10 Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT 2.4. Aspergillus niger 10 2.4.1. Sơ lƣợc Aspergillus niger (A. niger) 10 2.4.2. Sinh thái học 11 2.4.3. Phân loại học . 11 2.4.4. Ứng dụng công nghiệp .12 2.5. Rhizopus oryzae 12 2.5.1. Sơ lƣợc 12 2.5.2. Ứng dụng thƣơng mại 13 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14 3.1. Thời gian địa điểm . 14 3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 14 3.2.1. Vật liệu 14 3.2.2. Dụng cụ .14 3.2.3. Hóa chất .14 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 15 3.3.1. Phân lập khảo sát đặc điểm dòng nấm mốc .15 3.3.2. Quy trình trích chitosan dòng nấm .17 3.3.3. Nhận diện chitosan phƣơng pháp hóa học .18 3.3.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn 19 3.3.5. Chuẩn bị dung dịch chitosan .19 3.3.6. Khảo sát khả kháng khuẩn chitosan .19 3.3.6.1. Khảo sát môi trƣờng đặc .19 3.3.6.2. Khảo sát môi trƣờng lỏng .20 3.3.7. Khảo sát khả kháng nấm chitosan .20 3.3.8. Xử lý số liệu 21 3.4. Bố trí thí nghiệm . 21 3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập khảo sát đặc điểm dòng nấm mốc .21 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả sản xuất chitosan dòng nấm .21 3.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá khả kháng khuẩn chitosan 22 3.4.3.1. Đánh giá khả kháng khuẩn dung dịch chitosan trích đƣợc từ dòng nấm môi trƣờng đặc 22 3.4.3.2. Khảo sát nồng độ tối thiểu có khả kháng khuẩn chitosan 23 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả kháng nấm chitosan 24 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 25 4.1. Kết phân lập khảo sát đặc điểm dòng nấm mốc . 25 4.1.1. Kết trình phân lập 25 4.1.2. Khảo sát đặc điểm dòng nấm mốc phân lập 25 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT 4.2. Kết thí nghiệm khảo sát khả sản xuất chitosan dòng nấm . 27 4.3. Đánh giá khả kháng vi khuẩn Escherichia coli chitosan 29 4.4. Đánh giá khả kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides chitosan . 32 4.5. Ứng dụng chitosan nuôi cấy mô 34 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1. Kết luận 36 5.2. Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC . 40 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Những ứng dụng chitosan, chitin dẫn xuất chúng công nghiệp thực phẩm Bảng 2. Bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm hình thái dòng nấm mốc .21 Bảng 3. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả sản xuất chitosan dòng nấm 22 Bảng 4. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả kháng khuẩn chitosan dung môi acid acetic 5% môi trƣờng đặc .23 Bảng 5. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả kháng khuẩn chitosan môi trƣờng lỏng 24 Bảng 6. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả kháng nấm chitosan .24 Bảng 7. Kết khảo sát đặc điểm hình thái dòng nấm mốc 26 Bảng 8. Trung bình sinh khối trung bình chitosan trích đƣợc lần lặp lại dòng nấm .28 Bảng 9. Lƣợng chitosan/1g sinh khối nấm thu đƣợc từ dòng nấm .29 Bảng 10. Kết thí nghiệm đánh giá khả kháng khuẩn chitosan môi trƣờng lỏng 31 Bảng 11. Kết khảo sát khả kháng khuẩn dung dịch chitosan với dung môi acid acetic 1% 32 Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc monomer phân tử chitin (N-acetyl-β-D-glucosamine) .3 Hình 2. Cấu trúc mạch chitosan Hình 3. Khuẩn ty túi bào tử nấm Aspergillus niger .11 Hình 4. Khuẩn ty túi bào tử nấm Rhizopus oryzae 13 Hình 5. Sơ đồ quy trình ly trích chitosan từ nấm mốc 18 Hình 6. Nhận diện chitosan phƣơng pháp hóa học .18 Hình 7. Sơ đồ khảo sát khả kháng khuẩn chitosan môi trƣờng đặc 20 Hình 8. Sơ đồ khảo sát khả kháng nấm chitosan .21 Hình 9. Vòng sáng xuất quanh khuẩn lạc dòng nấm ST3 (phải) TV1 (trái) sau ngày nuôi cấy môi trƣờng chitin 25 Hình 10. Khuẩn ty túi bào tử dòng nấm ST3 (phải) ST2.2 (trái) quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần .26 Hình 11. Chitosan trích đƣợc từ dòng nấm R. oryzae đƣợc nhận diện phƣơng pháp hóa học 27 Hình 12. Hàm lƣợng chitosan trích đƣợc/1g sinh khối dòng nấm .29 Hình 13. Thí nghiệm khảo sát khả kháng vi khuẩn E. coli chitosan trích đƣợc từ dòng nấm R. oryzae ST2.2 30 Hình 14. Khả kháng khuẩn chitosan trích từ R. oryzae nồng độ khác thông qua số OD610nm 31 Hình 15. Vòng kháng khuẩn xuất quanh mẫu giấy đƣợc tẩm dung dịch chitosan 1% dung môi acid acetic 1% .32 Hình 16. Nấm C. gloeosporioides phát triển tốt môi trƣờng PDA chitosan 33 Hình 17. Khả kháng nấm chitosan 1% trích từ nấm với thể tích 100µL (phải) 150µL (trái) 33 Hình 18. Các mẫu đinh lăng nuôi cấy mô bị nhiễm khuẩn (A) nấm mốc (B) 34 Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT Bảng 9. Lƣợng chitosan/1g sinh khối nấm thu đƣợc từ dòng nấm Dòng nấm Aspergillus Niger BL1 Rhizopus Oryzae ST2.1 ST2.2 ST3 TV1 P-value F CV (%) Lƣợng Chitosan/1g sinh khối nấm (mg g-1) 3,9 c 4,1 c 71,7 a 9,0 b 9,1 b 3,3 c 3,7 c 0,000 2439,70 10,72 (Ghi chú: Các giá trị trung bình có chữ phía sau khác khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 95% (P[...]... khá mới mẻ ở Việt Nam Do đó đề tài Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm có khả năng sản xuất chitosan đã đƣợc thực hiện 1.2 Mục tiêu Mục tiêu của đề tài này là phân lập và tuyển chọn đƣợc một số dòng nấm mốc có khả năng sản xuất chitosan Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Chitin 2.1.1 Sơ lƣợc... 1: Phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc *Mục đích Phân lập và tuyển chọn những dòng nấm có khả năng phân giải và sử dụng chitin nhƣ nguồn carbon để sinh trƣởng và phát triển Khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn ty và bào tử của các dòng nấm phân lập đƣợc *Bố trí thí nghiệm Bảng 2 Bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm hình thái của các dòng nấm mốc Đặc điểm hình thái Màu sắc Khuẩn ty Vách ngăn Phân. .. nghiệm 4: Khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan 4 *Mục đích Khảo sát khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thƣ trên thực vật của loại chitosan trích từ dòng nấm có khả năng sản xuất chitosan cao nhất *Bố trí thí nghiệm Bảng 6 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan Nghiệm thức Đối chứng 100µL dung dịch chitosan 1% 150µL dung dịch chitosan 1% Chuyên ngành... Nhận diện chitosan trích đƣợc bằng phƣơng pháp hóa học đã nêu ở mục 2.2.6 Phân tích thống kê số liệu ghi nhận đƣợc Bảng 3 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng sản xuất chitosan giữa các dòng nấm Nghiệm thức Lặp lại Lƣợng chitosan thu đƣợc (mg/1g sinh khối) 3 Dòng nấm 1 3 Dòng nấm 2 3 Dòng nấm 3 3.4.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan *Mục đích Khảo sát và so sánh khả năng kháng... Dòng nấm 1 Dòng nấm 2 Dòng nấm 3 Cuống bào tử đính Màu sắc bào tử Hình dạng bào tử 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng sản xuất chitosan của các dòng nấm Chuyên ngành Công nghệ sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT *Mục đích So sánh khả năng sản xuất chitosan của các dòng nấm mốc *Bố trí thí nghiệm Nuôi tăng sinh khối các dòng nấm mốc và trích chitosan. .. có khả năng kháng khuẩn của chitosan *Bố trí thí nghiệm Trong thí nghiệm này chỉ sử dụng một loại chitosan đƣợc trích từ dòng nấm nào có tiềm năng để sản xuất chitosan với năng suất cao nhất Tiến hành nuôi tăng sinh khối dòng nấm này trong 2L môi trƣờng nhằm thu đƣợc hàm lƣợng cao chitosan đủ phục vụ cho nghiên cứu này và các nghiên cứu tiếp theo Chitosan sau khi đƣợc ly trích xong đƣợc pha loãng vào... dung dịch chitosan khác nhau Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn E coli của chitosan trích đƣợc từ dòng nấm có hiệu quả sản xuất chitosan cao nhất trong các dòng nấm đƣợc khảo sát, trên môi trƣờng lỏng và môi trƣờng đặc ở các nồng độ khác nhau 3.4.3.1 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dung dịch chitosan trích đƣợc từ các dòng nấm trong môi trƣờng đặc *Bố trí thí nghiệm Nhỏ 10µL dung dịch chitosan 1%... bên cạnh khả năng sản xuất enzyme, R oryzae còn có hiệu quả trong việc sản xuất một số lƣợng các acid hữu cơ, ancol và esters (Ghosh và Ray, 2011) Hình 4 Khuẩn ty và túi bào tử của nấm Rhizopus oryzae (http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Zygomycetes/Rhizopus/R_oryzae.html) 2.5.2 Ứng dụng trong thƣơng mại Theo Ghosh và Ray (2011), Rhizopus oryzae đƣợc ứng dụng trong sản xuất các... dụng nấm làm nguồn nguyên liệu sản xuất chitosan Việc sử dụng nấm làm nguồn nguyên liệu sản xuất chitosan có nhiều lợi ích thiết thực so với sử dụng nguồn nguyên liệu từ vỏ giáp xác Thứ nhất, nguồn cung ứng vỏ giáp xác thì có hạn và thay đổi theo mùa cũng nhƣ địa điểm đánh bắt trong khi đó có thể thu đƣợc sợi nấm bằng cách lên men đơn giản mà không cần chú ý tới điều kiện thời tiết và địa lý Thêm vào... sản xuất chitosan bằng phƣơng pháp hóa học trong công nghiệp có một số bất lợi nhƣ nguồn cung cấp vỏ giáp xác không ổn định, ô nhiễm môi trƣờng, tiêu tốn nhiều năng lƣợng và chất lƣợng thành phẩm không cao Gần đây, một số nghiên cứu đã thành công trong việc trích chitosan từ nấm mốc, đặc biệt là những loài nấm sử dụng chitin nhƣ nguồn carbon chính trong quá trình dinh dƣỡng Việc trích chitosan từ nấm . Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm có khả năng sản xuất chitosan đã đƣợc thực hiện. 1.2. Mục tiêu Mục tiêu của đề tài này là phân lập và tuyển chọn đƣợc một số dòng nấm mốc có khả năng. LƢỢC Đề tài Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm có khả năng sản xuất chitosan đã được thực hiện với mục tiêu phân lập được một số dòng mốc có thể dùng để sản xuất trực tiếp chitosan. Trong. 1: Phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc 21 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng sản xuất chitosan của các dòng nấm 21 3.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan