TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN HỒ VĂN TO NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM BỆNH DO HAI LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ BỆNH XUẤT HUYẾT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN HỒ VĂN TO NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM BỆNH DO HAI LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ BỆNH XUẤT HUYẾT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGs Ts TỪ THANH DUNG 2014 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM BỆNH DO HAI LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ BỆNH XUẤT HUYẾT Hồ Văn To Từ Thanh Dung1 Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ ABSTRACT The objectives of the study was to examine histopathological of bacterial disease causing by Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila on the striped catfish In this study, Pangasianodon hypophthalmus were exposed to both bacterial species by intraperitoneal injection The infected experiments were carried out on healthy fingerlings (15-25 gram) with treatments, each treatment with replicates by injection with challenge bacterial doses: A hydrophila 104 CFU/ml, E ictaluri 106 CFU/ml The results showed that mortality rate increased strongly in all treatments when the fish were injected by bacteria species and the highest mortality rate was ạt 24 hour after the injection of A hydrophila Additionally, Haematoxylin & Eosin stain and smear the tissue of muscle, gills, liver, kidney and spleen of effected fish have done in this study In the result, haemorrhaged and necrosis phenomenon were recorded in those of organs when staining with Haematoxylin & Eosin The study also indicated that the structure of gills of injected fingerlings changed including secondary gill filaments were swollen, haemorrhagic and sticky Furthermore, Wright and Giemsa staining also presented that both species were found out in the smear However, control treatment (no bacterial injection) did not appear both bacteria in the smeared samples Keywords: Pangasianodon hypophthalmus, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, histological characteristic, coinfection Title: Study on the histopathological characteristics of the striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) exposed to both Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila TĨM TẮT Nghiên cứu tiến hành nhằm tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học bệnh vi khuẩn cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Trong nghiên cứu này, loài vi khuẩn đưa vào thể cá phương pháp tiêm vào xoang bụng Thí nghiệm tiêm vi khuẩn tiến hành cá tra giống (15-25 gram/con) với nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại lần với mật độ vi khuẩn cảm nhiễm E ictaluri 106 CFU/ml; A hydrophila 104 CFU/ml Kết cho thấy, sau cảm nhiễm loài vi khuẩn E ictaluri A hydrophila cho thấy bệnh bộc phát mạnh cá bị nhiễm loài vi khuẩn gây chết cao thời điểm tiêm sau 24 tiêm A hydrophila Ngoài ra, phương pháp nhuộm với Haematoxylin & Eosin phết kính da-cơ, mang, gan, thận tỳ tạng cá cảm nhiễm thực nghiên cứu Kết phân tích nghiệm thức tiêm vi khuẩn cấu trúc gan, thận, tỳ tạng có tượng xung huyết, xuất huyết, hoại tử cấu trúc nhuộm với Haematoxylin & Eosin Cấu trúc mang có biến đổi sợi mang thứ cấp phình to, xung huyết, xuất huyết có dính lại nhiều sợi mang Bên cạnh đó, phương pháp nhuộm với Wright Giemsa cho thấy có diện lồi vi khuẩn vùng phết kính Trong đó, nghiệm thức đối chứng (không tiêm vi khuẩn) không thấy vi khuẩn mẫu phết Từ khóa: Pangasianodon hypophthalmus, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, mô bệnh học, cảm nhiễm kép Đặt vấn đề 1.1 Giới thiệu Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đối tượng xuất nước ta Việc mở rộng diện tích ni việc thâm canh hóa đối tượng ni năm qua dẫn đến tình hình dịch bệnh xảy ngày nhiều, đặc biệt bệnh vi khuẩn Trong số loại bệnh vi khuẩn cá tra bệnh xuất huyết vi khuẩn Aeromonas hydrophila bệnh mủ gan vi khuẩn Edwardsiellla ictaluri loại bệnh thường xuất nhiều nhất, bệnh xảy quanh năm gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi (Từ Thanh Dung et al., 2004) Ở Mỹ, vi khuẩn E ictaluri tác nhân gây nhiễm trùng máu đư ờng ruột (Enteric Septicemia of Catfish, ESC) cá nheo Mỹ (Ictalurus furcatus), phân lập vào năm 1979 Hawke (Hawke, 1979) Tuy nhiên, đến năm 1981 định danh vi khuẩn E ictaluri (Hawke et al., 1981) Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ vi khuẩn E ictaluri ghi nhận xuất cá tra nuôi ĐBSCL vào cuối năm 1998 với tên gọi Bacillary Necrosis of Pangasius (BNP) (Ferguson et al., 2001) Sau đó, Crumlish et al (2002) xác định xác nguyên nhân gây bệnh mủ gan cá tra nuôi ĐBSCL vi khuẩn E ictaluri Bệnh xuất huyết vi khuẩn A hydrophila gây báo cáo nhiều loài cá kể động vật (Colwell, MacDonell DeLey, 1986), đặc biệt vi khuẩn gây bệnh nhiều lồi cá nước (Newman, 1993) Ở Việt Nam, tổn thất bùng phát vi khuẩn A hydrophila cá tra nhiều tác giả báo cáo (Subagja, Slembrouck, Hung Legendre, 1999) Vi khuẩn A hydrophila xem tác nhân gây bệnh hội, thường gây bệnh vật chủ bị stress hệ thống miễn dịch bị suy yếu (Roberts, 1993) Đặc biệt, vài năm trở lại tượng nhiễm kép loài vi khuẩn E ictaluri A hydrophila thường xuất gây bệnh cá tra (Crumlish Dung, 2002) Chính vậy, chúng gây thiệt hại nhiều làm cho trình điều trị bệnh trở nên khó khăn Kết nghiên cứu Nusbaum Morrison (2002) cho thấy bị nhiễm A hydrophila cá da trơn chưa biểu bệnh bộc phát bệnh mạnh cá bị nhiễm thêm vi khuẩn E ictaluri Hiện tại, có nhiều nghiên cứu độc lực mô bệnh học vi khuẩn E ictaluri A hydrophila gây bệnh cá tra (Đặng Thị Hoàng Oanh , 2009; Đặng Thụy Mai Thy, 2010; ) Tuy nhiên, việc nghiên cứu mô bệnh học loài vi khuẩn gây bệnh cá tra chưa nghiên cứu nước ta Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm bệnh hai loài vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ bệnh xuất huyết” thực để xác định số đặc điểm mô bệnh học cá tra cảm nhiễm loài vi khuẩn nhằm làm sở cho việc chẩn đoán điều trị bệnh đạt hiệu cao VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Cá tra ch ọn làm thí nghiệm có trọng lượng khoảng 15-25 gram/con, mua từ Trại cá giống Hồng Mỹ Cá tra giống sau mua nuôi dưỡng bể composite khoảng 7-10 ngày Trong thời gian nuôi dưỡng cá cho ăn thức ăn công nghiệp, lần/ngày cho ăn theo nhu cầu cá Chọn cá bố trí thí nghiệm có kích thước tương đối đồng đều, khỏe mạnh, linh hoạt da sáng bóng Trước bố trí thí nghiệm cá kiểm tra kí sinh trùng, vi khuẩn nhằm lựa chọn cá khỏe, không nhiễm bệnh 2.2 Vi khuẩn thí nghiệm Hai dịng vi khuẩn E ictaluri (dòng E3) A hydrophila (dòng A7) phân lập từ cá tra nhiễm bệnh gan thận mủ bệnh xuất huyết Hai dòng vi khuẩn xác định giá trị LD50 E ictaluri (106 CFU/ml) A hydrophila (104 CFU/ml) Vi khuẩn trữ glycerol phục hồi môi trường TSA (tryptone soya agar, Oxoid), ủ 280C Sau nuôi tăng sinh môi trường brain heart infusion (BHI, Merck) ủ qua đêm nhiệt độ phòng máy lắc 110 vòng/phút Tiến hành ly tâm 4.000 vòng/phút 10 phút 40C để thu sinh khối tế bào Sau ly tâm, dùng nước muối sinh lý (0.85%) để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần) Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn máy so màu quang phổ bước sóng 610 nm (OD = ± 0.1 tương ứng với mật độ vi khuẩn E ictaluri 109 CFU/mL vi khuẩn A hydrophila 108 CFU/mL) Sau đó, dung dịch vi khuẩn pha lỗng đến nồng độ thí nghiệm cần thiết 2.3 Bố trí thí nghiệm Bể thí nghiệm tích 60 L, cấp khoảng 40 L nước Nguồn nước sử dụng nước máy sục khí 24 trước thả cá thí nghiệm Bể đặt phịng thí nghiệm ướt (wet-lab) Dựa kết xác định nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với nghiệm bố trí sau: Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm loài vi khuẩn A hydrophila E ictaluri cá tra Nghiệm thức (NT) NT NT NT NT NT NT Mô tả thí nghiệm Tiêm lúc A hydrophila E ictaluri Tiêm A hydrophila sau 24 tiêm E ictaluri Tiêm A hydrophila sau 48 tiêm E ictaluri Tiêm A hydrophila sau 72 tiêm E ictaluri Đối chứng tiêm nước muối sinh lý Đối chứng không tiêm Mật độ vi khuẩn E ictaluri 106 CFU/ml A hydrophila 104 CFU/ml 0.85% Mỗi nghiệm thức lặp lại lần với mật độ 10 con/bể, sục khí liên tục khơng cho cá ăn suốt q trình thí nghiệm Cá thí nghiệm tiêm 0.1 ml vi khuẩn/cá xoang bụng Nhiệt độ nước theo dõi ngày, dao động khoảng 28 ± 2oC thí nghiệm theo dõi liên tục 14 ngày 2.4 Phƣơng pháp phết kính mẫu tƣơi Dùng dao cắt phần nhỏ da-cơ, mang, gan, thận tỳ tạng cá tra phết nhẹ lên lame Để khô tự nhiên, sau cố định lame dung dịch Methanol phút nhuộm theo phương pháp nhuộm mẫu Chinabut (1991) Quan sát kết kính hiển vi vật kính 100x 2.5 Phƣơng pháp mơ học Các mẫu da-cơ, mang, gan, thận, tỳ tạng cá lờ đờ từ nghiệm thức gây cảm nhiễm kết hợp loài vi khuẩn cá từ nghiệm thức đối chứng thu cố định dung dịch formol trung tính 10% 24-48 Tiến hành rửa trữ mẫu cồn 70% phân tích mơ học Mẫu xử lý qua giai đoạn: loại nước, làm mẫu tẩm paraffin Sau mẫu đúc khối, cắt lát với độ dày từ 4-6 μm nhuộm Haematoxylin Eosin Tiêu quan sát kính hiển vi độ phóng đại 10x, 40x 100x chụp hình tiêu đặc trưng Đọc kết theo Ferguson (2006) 2.6 Phƣơng pháp phân tích số liệu Các số liệu, đồ thị thí nghiệm xử lý phần mềm Excel 2007 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri A hydrophila 3.1.1 Tỉ lê ̣cá chế t sau cảm nhiễm loài vi khuẩn E ictaluri A hydrophila Sau gây cảm nhiễm kết hợp loài vi khuẩ n E ictaluri A hydrophila, kết theo dõi thí nghiệm cho thấy nghiệm thức khác thời gian cá chết tỉ lệ cá chết khác nhau, ngoại trừ nghiệm thức đối chứng (tiêm không tiêm nước muối sinh lý) khơng có cá chết suốt thời gian thí nghiệm (Hình 3.1) Hình 3.1 Tỉ lệ cá chết tích lũy theo dõi qua ngày cảm nhiễm kết hợp loài vi khuẩn E ictaluri A hydrophila Kết Hình 3.1 cho thấy, cá cảm nhiễm NT NT có tỉ lệ chết cao 80% sau ngày tiêm vi khuẩn, thấp 67% NT sau ngày tiêm vi khuẩn Còn NT có tỉ lệ chết 73% Ở NT cá chết chậm NT 3,4 cạnh tranh E ictaluri A hydrophila nên chúng làm giảm độc lực Trái lại, NT 3,4 cá bị nhiễm loại bệnh độc lực bệnh tác động lên cá Nhưng sau đó, cá lại nhiễm tiếp tục bệnh khác lúc độc lực vi khuẩn nhiễm trước nhiễm sau đồng thời tác động lên cá làm cho cá chết cao Thời gian cá bắt đầu chết sau tiêm vi khuẩn tất nghiệm thức ngày thứ Trong đó, cá chết tập trung nhiều từ ngày thứ ngày đến ngày thứ sau giảm dần từ ngày thứ trở không thấy xuất cá chết kết thúc thí nghiệm Cá bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý đối chứng khơng tiêm bình thường suốt thời gian thí nghiệm Kết thí nghiệm cho thấy bệnh bộc phát mạnh cá bị nhiễm loài vi khuẩn gây chết cao thời điểm tiêm sau 24 tính kể từ kết thúc tiêm A hydrophila Kết tương tự Nusbaum Morrison (2002) cho thấy bị nhiễm A hydrophila cá da trơn chưa biểu bệnh bộc phát bệnh mạnh cá bị nhiễm thêm vi khuẩn E ictaluri 3.1.2 Dấu hiệu bệnh lý cá cảm nhiễm Trong q trình thí nghiệm, cá bị nhiễm vi khuẩn A hydrophila E ictaluri có dấu hiệu bất thường lờ đờ mặt nước, màu sắc da nhợt nhạt, xuất huyết khắp thể, vây, hậu môn, xung quanh miệng, hầu mắt xuất huyết, xuất điểm xuất huyết thể (Hình 3.2 A, B) Cá chết thường nhào lộn xoay tròn, ngửa bụng, thả trơi theo dịng nước chìm xuống đáy Giải phẩu bên xoang nội quan có chứa dịch lỏng màu hồng hay màu vàng (Hình 3.2 C) Gan, thận, tỳ tạng sưng to, xuất đốm trắng có đường kính 1-2 mm, đặc biệt có tượng nhũn thận (Hình 3.2 D) Ở giai đoạn đầu nhiễm bệnh đốm trắng xuất thận tỳ tạng cá Kết nghiên cứu tương tự với kết thí nghiệm cảm nhiễm đơn vi khuẩn E ictaluri số tác Ferguson et al (2001); Từ Thanh Dung ctv (2004), Đặng Thụy Mai Thy (2010), Kết tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng cá tra cảm nhiễm lồi vi khuẩn mơi trường TSA cho thấy có xuất dạng khuẩn lạc vi khuẩn A hydrophila E ictaluri Trong đó, nghiệm thức đối chứng khơng tiêm vi khuẩn khơng phân lập vi khuẩn q trình thí nghiệm Đối với dịng vi khuẩn E ictaluri sử dụng thí nghiệm gây cảm nhiễm xác định vi khuẩn Gram âm, hình que, oxidase âm tính, catalase dương tính Trong đó, vi khuẩn A hydrophila xác định vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, phản ứng oxidase catalase dương tính Từ kết với việc tái định danh kỹ thuật PCR kết luận dòng vi khuẩn tái phân lập cá cảm nhiễm loài vi khuẩn A hydrophila E ictaluri Hình 3.2 Dấu hiệu bệnh lý cá cảm nhiễm vi khuẩn A hydrophila E ictaluri A Vùng đầu, mắt, vây hậu môn xuất huyết; B Nhiều điểm xuất huyết khắp da cá; C Nhiều đốm trắng xuất gan, thận tỳ tạng với dịch màu hồng; D Gan, tỳ tạng sƣng thận bị nhũn 3.2 Biến đổi cấu trúc mơ quan sát phết kính tiêu tƣơi Quan sát mẫu cá thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri A hydrophila phương pháp phết kính mẫu tươi da-cơ, mang, gan, thận, tỳ tạng cá tra cho thấy có xuất loại vi khuẩn hình que (dạng que ngắn: A hydrophila, que dài: E ictaluri) nằm rải rác hay tập trung thành cụm vùng mơ phết kính Ở nghiệm thức đối chứng khơng có vi khuẩn diện vùng phết kính vào ngày thu mẫu cuối (Hình 3.3 A) Kết phết kính cho thấy, sau ngày cá chết vi khuẩn diện mẫu mơ có xuất vi khuẩn E ictaluri, riêng nghiệm thức tiêm lúc lồi vi khuẩn E ictaluri A hydrophila có lồi vi khuẩn E ictaluri A hydrophila, chúng bao quanh tế bào hồng cầu chưa cơng vào nhân tế bào chất (Hình 3.3 B) Từ ngày thứ trở đi, vùng mô phết kính có xuất lồi vi khuẩn E ictaluri A hydrophila tất nghiệm thức Quan sát cho thấy, chúng công phá vỡ màng tế bào hồng cầu, tạo nhiều không bào tế bào chất khơng cịn tế bào làm cho tế bào bị biến đổi hình dạng (Hình 3.3 C) Kết tương tự với kết thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri cá tra Đặng Thụy Mai Thy (2010) Bên cạnh đó, tiêu mẫu thận tỳ tạng cho thấy loại tế bào bạch cầu tham gia vào hệ thống miễn dịch thể, chống lại tác nhân gây bệnh (Hình 3.3 D) Nhưng có gia tăng số lượng vi khuẩn hệ miễn dịch tiêu diệt vi khuẩn làm suy giảm khả chống chịu với tác nhân gây bệnh dẫn đến cá chết Hình 3.3 Mẫu phết kính cá nhiễm E ictaluri A hydrophila (Giemsa, 100x) A Mẫu thận cá khỏe a: hồng cầu; b: bạch cầu đơn nhân; c: tế bào lympho; B Vi khuẩn E ictaluri A hydrophila bao quanh hồng cầu thận cá tra a: vi khuẩn A hydrophila, b: vi khuẩn E ictaluri; C Màng tế bào hồng cầu bị vi khuẩn phá vỡ vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất tỳ tạng (mũi tên); D Đại thực bào vi khuẩn thận (mũi tên) 3.3 Biến đổi mô học cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri A hydrophila 3.3.1 Da Khảo sát mơ da-cơ cá gây cảm nhiễm lồi vi khuẩn E ictaluri A hydrophila cho thấy nghiệm thức tiêm vi khuẩn cấu trúc mơ biến đổi so với mơ cá khỏe (Hình 3.4) Sau 14 ngày theo dõi, nghiệm thức tiêm vi khuẩn cá chết phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng môi trường TSA Đồng thời, kết phết kính trên, sau thu mẫu cá cảm nhiễm loài vi khuẩn E ictaluri A hydrophila nhuộm Giemsa cho thấy có vi khuẩn hình que diện vùng da-cơ Thí nghiệm Takashi Hybyia (1982) cho thấy mẫu da-cơ bị biến đổi với tượng viêm, khối phù, thối hóa hạt, thối hóa lỏng, khối u phù bị tác nhân vi khuẩn, kí sinh trùng, nấm xâm nhập gây bệnh Như vậy, cá chết bị nhiễm vi khuẩn kết quan sát mô da-cơ nghiệm thức tiêm vi khuẩn khơng có biến đổi so với cá khỏe (nghiệm thức đối chứng) Cơ quan bị ảnh hưởng trực tiếp vi khuẩn Hybiya (1982) giải thích cấu trúc quan rắn không giữ vai trị quan trọng q trình tạo máu không trực tiếp tham gia vào hệ miễn dịch thể Do đó, có khả tiếp xúc bị cơng vi khuẩn Hình 3.4 Đặc điểm mô da-cơ cá tra (H&E) A Da-cơ cá khỏe (20x), a: lớp biểu bì, b: lớp hạ bì, c: lớp cơ; B Da-cơ cá bệnh (10x) a: lớp biểu bì ; b: tế bào sắc tố, c: lớp hạ bì, d: lớp 3.3.2 Mang Qua khảo sát mơ mang cá bệnh tiêm lồi vi khuẩn E ictaluri A hydrophila cho thấy cấu trúc mô mang có biến đổi sợi mang thứ cấp phình to, xung huyết, xuất huyết có dính lại nhiều sợi mang, động mạch vào mang bị xung huyết (Hình 3.5) Hiện tượng phình to sợi mang thứ cấp ghi nhận từ ngày thu mẫu thứ sau tiêm vi khuẩn Đến ngày thứ mô mang nghiệm thức bị nhiễm bệnh nặng hơn, mô mang bị xuất huyết, cấu trúc khơng có khả hồi phục Khơng tìm thấy biến đổi cấu trúc mang nghiệm thức đối chứng vào ngày thu mẫu cuối Hiện tượng sợi mang thứ cấp bị dính lại với nhau, sưng viêm cấu trúc bị phá vỡ vi khuẩn cơng tạo nên phản ứng miễn dịch làm tế bào mang sưng lên tế bào sưng to dẫn đến tiếp xúc sợi mang với dịch viêm tạo nên dính lại sợi mang Sự dính lại sợi mang làm giảm khả hô hấp mang giảm diện tích tiếp xúc với nước chức vùng sợi mang bị dính lại hoại tử Do đó, cá bệnh thường có biểu thiếu oxy thường lờ đờ mặt nước Tuy nhiên, biến đổi mang xuất số mẫu nghiệm thức qua ngày thu mẫu, mang khơng giữ vai trị trọng q trình tạo máu nên bị phá hủy vi khuẩn gây bệnh Hình 3.5 Đặc điểm mơ mang cá tra (H&E) A Mang cá tra khỏe (20x) a: Sợi mang sơ cấp, b: sợi mang thứ cấp; B Mang cá tra bi xung huyết có dính lại sợi mang thứ cấp (mũi tên) (20x); C Mang cá tra bị xung huyết sợi mang thứ cấp động mạch vào mang (mũi tên) (10x); D Mang cá tra có dính lại sợi mang xuất huyết (mũi tên) (10x) 3.3.3 Thận Qua khảo sát mô thận cá bệnh tiêm hai loài vi khuẩn E ictaluri A hydrophila cho thấy cấu trúc mơ thận có biến đổi xung huyết, xuất huyết, hoại tử Khơng tìm thấy biến đổi cấu trúc mô nghiệm thức đối chứng vào ngày thu mẫu cuối (Hình 3.6 A) Ở ngày thứ sau cảm nhiễm quan sát mô thận cá nhiễm vi khuẩn cho thấy chủ yếu tượng xung huyết, xuất huyết (Hình 3.6 B, C) Hiện tượng xung huyết xem phản ứng thể tác nhân gây bệnh kích thích đặc biệt làm cho mao mạch nở lượng máu lớn bình thường đưa đến gần ổ viêm Khi vùng xung huyết ảnh hưởng độc tố vi khuẩn, mao mạch máu bị vỡ tính thẩm thấu mao mạch tăng lên, làm cho tế bào máu vùng xung huyết thoát xen lẫn với tế bào máu quan gây tượng xuất huyết Hiện tượng xung huyết xuất huyết kéo dài làm cho mô thận sưng viêm cấu trúc dẫn đến hoại tử Đến ngày thứ 3, bên cạnh tượng xung huyết, xuất huyết, tế bào bị biến đổi cấu trúc, nhiều vùng hoại tử lan rộng đại thực bào sắc tố tìm thấy mơ thận (Hình 3.6 D) Từ đó, làm thận chức quan trọng thận điều hòa áp suất thẩm thấu, tiết sản phẩm trình biến dưỡng NH3, urê, muối hóa trị 2, sản xuất hồng cầu tiết hormone điều hịa q trình sinh lý thể kết hợp với yếu tố khác làm cho cá chết Hình 3.6 Đặc điểm mơ thận cá tra (H&E) A Thận cá khỏe (20x) a: tiểu cầu thận; b: ống thận; c: trung tâm đại thực bào sắc tố; B Thận cá xung huyết xuất huyết (20x) a: vùng xung huyết; b: vùng xuất huyết; C a : tiểu cầu thận xung huyết; b: xuất huyết ; c: trung tâm đại thực bào sắc tố (10x); D Nhiều vùng mô xuất huyết hoại tử (10x) a: xuất huyết, b: hoại tử 3.3.4 Tỳ tạng Tỳ tạng bao bọc lớp tế bào biểu mô lát đơn mô liên kết Cấu tạo tỳ tạng gồm hai phần tủy đỏ tủy trắng Tủy trắng nằm bên bắt màu sậm phần tủy đỏ, tủy đỏ tạo thành mạng lưới bao quanh tủy trắng Ngoài tủy đỏ tủy trắng, tỳ tạng cịn có diện trung tâm đại thực bào sắc tố, có màu vàng nâu nâu đen, đóng vai trị kho lưu trữ tế bào phá hủy, mảnh vụn kháng nguyên (Ferguson, 2006) Qua khảo sát mô tỳ tạng cá bệnh cho thấy cấu trúc mơ tỳ tạng có vùng bị hoại tử cấu trúc (Hình 3.7) Khơng tìm thấy biến đổi cấu trúc tỳ tạng nghiệm thức đối chứng vào ngày thu mẫu cuối Đặc biệt, nhiều trung tâm đại thực bào sắc tố màu vàng nâu xuất mô tỳ tạng Vi khuẩn gây bệnh công làm cho cấu trúc tỳ tạng bị biến đổi Những biến đổi cấu 10 trúc tỳ tạng giống với nghiên cứu trước Trần Thị Ngọc Hân (2006) cá tra bị bệnh mủ gan Tỳ tạng quan tạo máu cá, hồng cầu máu giảm dẫn đến lưu thông tế bào hồng cầu tham gia vào đáp ứng miễn dịch thực trình trao đổi chất diễn yếu Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập vào xảy tượng xung huyết, xuất huyết mạch máu sau cấu trúc tế bào Cá bị xung huyết, xuất huyết tế bào sưng viêm kéo dài dẫn đến vùng hoại tử xuất diện rộng với phá hủy trung tâm đại thực bào sắc tố làm cho tỳ tạng chức sản sinh hồng cầu, bạch cầu, khả tạo kháng thể thực bào khơng cịn, với tác động khác làm cho cá chết Hình 3.7 Đặc điểm mơ tỳ tạng cá tra (H&E) A Tỳ tạng cá khỏe (10x) Trung tâm đại thực bào sắc tố (mũi tên); B Tỳ tạng bị biến đổi cấu trúc (mũi tên) (10x) 3.3.5 Gan Kết quan sát tiêu mô gan cá bệnh tiêm loài vi khuẩn E ictaluri A hydrophila nghiệm thức cho thấy tiêu mô bệnh xuất số biến đổi liên kết cấu trúc tế bào bị phá hủy, nhiều vùng tế bào gan bị xung huyết, xuất huyết hoại tử cấu trúc Khơng tìm thấy biến đổi cấu trúc gan nghiệm thức đối chứng vào ngày thu mẫu cuối (Hình 3.8 A) Hiện tượng xung huyết xảy sau ngày cảm nhiễm (Hình 3.8 B) Khi tượng xung huyết kéo dài làm vỡ mạch máu, giải thoát nhiều enzyme tiêu hóa (tiêu hóa protein, lipid, ) từ bạch cầu làm cho tổ chức viêm bị hủy hoại dẫn đến tế bào bị hoại tử cấu trúc Hiện tượng cấu trúc ghi nhận mô gan ngày thứ sau cảm nhiễm (Hình 3.8 C) Tế bào cấu trúc dẫn đến hoại tử, hoại tử dạng hạt sau hoại tử gần hóa lỏng đến hóa lỏng Tuy nhiên, tượng hoại tử dạng hạt hoại tử hóa lỏng khơng xảy gan cá cảm nhiễm Điều khơng giống với thí nghiệm cảm nhiễm đơn trước Trần Thị Ngọc Hân (2006) ghi nhận có tượng hoại tử dạng hạt hóa lỏng nghiệm thức 1x105 CFU/ml 1x106 CFU/ml gây cảm nhiễm E ictaluri cá tra Đặng Thụy Mai Thy (2010) nghiên cứu đặc tính gây bệnh vi khuẩn E ictaluri cá tra ghi nhận có tượng hoại tử dạng hạt đến hóa lỏng gan Theo Ferguson (1989) tổn thương diễn toàn tổ chức gan 11 làm cho gan khơng cịn chức khử độc, lọc máu, chuyển hóa protein, lipid, glucid, tiết mật Từ đó, độc lực vi khuẩn khơng loại bỏ tích lũy thể làm giảm khả đề kháng với mầm bệnh kết hợp với điều kiện bất lợi khác làm cá chết KẾT LUẬN Kết sau cảm nhiễm loài vi khuẩn E ictaluri A hydrophila cho thấy bệnh bộc phát mạnh cá bị nhiễm loài vi khuẩn gây chết cao thời điểm tiêm sau 24 tính kể từ kết thúc tiêm A hydrophila Kết phết kính mẫu tươi da-cơ, mang, gan, thận tỳ tạng cá tra có xuất lồi vi khuẩn có dạng hình que ngắn vi khuẩn A hydrophila dạng que dài vi khuẩn E ictaluri Trong đó, nghiệm thức đối chứng không thấy vi khuẩn mẫu phết Cấu trúc mô gan, thận, tỳ tạng có tượng xung huyết, xuất huyết, hoại tử cấu trúc cảm nhiễm lúc vi khuẩn E ictaluri A hydrophila Kết thí nghiệm cho thấy cấu trúc mang có biến đổi sợi mang thứ cấp phình to, xung huyết, xuất huyết có dính lại nhiều sợi mang Trong mơ da-cơ khơng có biến đổi cấu trúc qua ngày thu mẫu 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO CrumLish, M Thanh, P.C., Koesling, J., Tung, V., T and Gravingen, K., 2010 Experimental challenge studies in Vietnamese catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage), exposed to Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila Crumlish, M., T.T Dung, J.F Turnbull, N.T.N Ngoc and H.W Ferguson, 2002 Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases, 25: 733-736 Chinabut S, P Kitsawat and C Limsuwan, 1991 Histology of the walking catfish, Clarias batrachus International development research centre, Canada Colwell R.R., MacDonell M.R & DeLey J (1986) Proposal to reorganize the family Aeromonadaceae fam nov International Journal of Systematic Bacteriology 36, 473-477 Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương, 2009 Độc lực vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh mủ gan Tạp chí Nơng Nghiệp Phát triển Nông thôn, số 12:64-70 Đặng Thụy Mai Thy, 2010 Nghiên cứu đặc tính gây bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra Luận văn cao học, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Ferguson, H.W., 1989 Systemic pathology of fish 247p Ferguson, H.W., 2006 Systemic pathology of fish: Atext atlas of normal tissues in teleosts their responses in disease Scotian press 367 pp Ferguson, 2002 Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases, 25: 733-736 Hybiya, T 1982 An atlas of histology (Normal and Pathological features) College of Agriculture and Veterinary Medicine, Nihon Univ Tokyo, Japan 146p Hawke, J.P., A.C McWhorter, A.G Steigerwalt and D.J Brenner, 1981 Edwardsiella ictaluri sp nov., the causative agent of enteric septicemia of catfish International ournal of Systematic bacteriology, 31: 396-400 Hawke, J.P 1979, A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish (Italurus punctaus) Journal of fishes Research Board of Canada, 36: 1058-1512 Inglis, V., R.J Roberts, N.R Bromage, 1993 Bacterial disease of fish 196-210 Newman S.G (1993) Bacterial vaccines for fish Annual Review of Fish Diseases 3, 145–185 Nusbaun, K.E and E.E Morrison, 2002 Edwardsiella ictaluri bacteraemia elicits shedding of Aeromonas hydrophila complex in latently infected channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque) Journal of Fish Diseases, 25: 343-350 13 Subagja J., Slembrouck J., Hung L.T & Legendre M (1999) Larval rearing of an Asian catfish Pangasius hypophthalmus (Siluroidei, Pangasiidae): analysis of precocious mortality and propositions of appropriate treatments Aquatic Living Resources 12, 37-44 Trần Thị Ngọc Hân, 2006 Khảo sát mô học cá tra (Pangasianodon hypophthalamus) Luận văn Đại học, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thụy Mai Thy, 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá tra (Pangasianodon hypophthalamus) Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, 2004 373 trang 14 ...TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN HỒ VĂN TO NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM BỆNH DO HAI LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ BỆNH XUẤT HUYẾT LUẬN... nghiên cứu nước ta Xuất phát từ thực tế trên, đề tài ? ?Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm bệnh hai loài vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ bệnh xuất huyết? ?? thực để... ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGs Ts TỪ THANH DUNG 2014 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM BỆNH DO HAI LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN