MOLECULAR CHARACTERIZATION AND  DEVELOPMENTAL ANALYSIS OF THE TGF BETA 3  GENE IN ZEBRAFISH  CHEAH SIEW HONG FELICIA  (BSc Biochemistry/Microbiology (Hons.), University of  Aberdeen, UK)  A THESIS SUBMITTED  FOR THE DEGREE OF DOCTORATE OF PHILOSOPHY  DEPARTMENT OF PAEDIATRICS  NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE  2006 Table of Content  Summary …………………………………………………………………………………… . i  Acknowledgements ………………………………………………………………… .……. iii  List of Figures ……………………………………………………………… . iv  List of Tables …….…………………………………………………………  vi  List of Abbreviations ……………………………………………………  vii  List of Publications …………………………………………………………………….…… x  Chapter 1  Introduction   1  1.1 Background/Significance …………………………………………………… ………   1  1.2 Literature Reviews …………………………………………………… ……… . 3  1.2.1  Transforming Growth Factor b3 …………………………………………… .… . 3  Overview of transforming growth factor b family …………………………… . 3  TGFb ligands ………………………………………………………………… . 3  TGFb receptors …………………………………………………………… ………  5  Smad proteins ………………………………………………………………… ……. 7  Recognition of Smad by the activated receptor complex ……………………… … . 9  Mechanism of Smad phosphorylation and activation ……………………………… 10  Mechanisms of TGFb signalling from cell membrane to the nucleus …………… . 10  TGFb Subfamily and its isoforms …………………………………………………  11  Latent TGFb, latent TGFb binding protein, and bone …  11  Perturbation of TGFb signalling in human diseases ………………………………. 13  TGFb3, and expression patterns during early embryogenesis and in adult tissues   13  TGFb3 knockout mice studies ……………………………………………………… 17  TGFb3 mutations and diseases ……………………………………………………  19  1.2.2  Zebrafish: An Animal Model for Craniofacial Development and Disease  . 21  Overview of the zebrafish system ………………………………………………… . 21  Advantages and disadvantages of zebrafish ………………………………………  21  Disease modelling in zebrafish ……………………………………………………  22  Zebrafish as the animal model for craniofacial development and disease ………… 25  1.2.3  Development of Pharyngeal Arches …………………………………………… . 27  Overview of pharyngeal arches ……………………………………………………. 27  Patterning the pharyngeal arches …………………………………………………  27 1.2.4  Formation and Functions of the Notochord ……………………………….……. 34  Overview of notochord ………………………………………………………….…  34  Formation of the notochord ……………………………………………………… . 34  Functions of the notochord in vertebrate development ………………….……… . 37  Relationship between notochord and cartilage ………………….…………………. 39  1.2.5  Cardiac Development in Zebrafish ……………………………………………… 41  Overview of zebrafish heart ……………………………………………………… . 41  Formation of the heart ………………………………………………………… .… 41  1.2.6  Specific Aims ……………………………………………………………………… 47  Chapter 2  Materials and Methods …………………………………………… 48  2.1  Zebrafish maintenance …………………………………………………………… 48  2.2  Verification of RZPD clone ………………………………………………………. 48  2.3  DNA sequencing and cDNA analysis …………………………………… . 49  2.4  Genomic characterization …………………………….…………………………  49  2.5  Promoter analysis ……………………………………………………………….… 50  2.6  Embryonic expression pattern by RT­PCR analysis ………… ………………. 53  2.7  Embryonic expression pattern by in situ RNA hybridization analysis …… .… 53  2.8  Cryosection analysis …………………………………………………………….… 55  2.9  Microinjection ………………………… ……………………… ……….………  56  2.10  Knockdown studies using morpholino antisense oligonucleotides …… ………. 56  2.11  RT­PCR analysis for detection of morphant transcripts ……… ……….… …. 57  2.12  Real­time PCR analysis for efficacy of i1e2 splice modifying MO ……………… 57  2.13  Overexpression analysis ……………………………………………….…………  58  2.14  Alcian blue cartilage staining ………………………….………………….………. 60  2.15  Alizarin red bone staining ……………………………………………… .….…… 61 2.16  Analysis of molecular markers in tissue/organs ……………….…….……….…. 61  2.17  Imaging and processing ………………………………………………………… . 62  Chapter 3  Results …………………………………………………………… . 63  3.1  Identification of Zebrafish tgfb 3 cDNA …………………………………………. 63  3.2  Genomic Organization of Zebrafish tgfb Gene …………………………….…  69  3.3  Tgfb Promoter Analysis …………………………………………………………. 71  3.4  Genetic Mapping of Zebrafish tgfb 3 ……………………………………………  75  3.5  Embryonic Developmental Expression Pattern …………………………….…… 77  3.6  Inhibition of Zebrafish tgfb 3 with Splice Modifying Morpholino Ô  ……… ……84  3.7  Efficacy Assessment of Knockdown Morphant Phenotypes …………………… 89  3.8  Craniofacial Cartilage Phenotypes in tgfb Knockdown Morphant Embryos …92  3.9  Knockdown of tgfb3 Gene and Bone Development ……………………………… 97  3.10  Knockdown of tgfb3 Gene and Notochord Development ………………….……  99  3.11  Undulating Notochord and Heart Field Domain in tgfb Morphants …… … 102  3.12  Knockdown of tgfb3 Gene and Heart Development ………………….…….…  104  3.13  Overexpression of tgfb in Zebrafish ……………………………………….… . 110  Capped sense mRNA synthesis and validation of mRNA integrity ………………  110  Overexpression of tgfb3 and cartilage development …………………………… . 112  Overexpression of tgfb3 and notochord development ……………………………. 112  Overexpression of tgfb3 and cardiac development ………………………………. 112  Chapter 4  Discussion ……………………………………………………….…. 118  4.1  Genomic Analyses of tgfb ……………………………… .……………………. 118  4.2  Functional Analyses of tgfb ……………………………………………………. 119  Embryonic expression of tgfb3 …………………………………………………… 119 Perturbation of tgfb3 gene function ……………………………………….……… 122  Relationship between tgfb3 and head skeletogenesis ……………………………  124  Relationship between tgfb3 and cardiac development ………… .………………. 128  Dosage sensitive and tissue specific effects of tgfb3 …………………………… . 132  Chapter 5  Conclusions  . 133  Chapter 6  References …………………………………………………… …  135  Appendix …………………………………………………………………………………. 148  (A) Medium Preparation  (B) Published articles Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Summary  As a member of the transforming growth factor b family, TGFb3 regulates a plethora of  biological  processes  and  is  involved  in  mammalian  pulmonary  and  craniofacial  development.    Homologs  of  human  TGFb3  have  been  identified  in  several  vertebrate  species.  A cDNA clone of zebrafish tgfb3, consisting of a 271 bp 5’ untranslated region,  a 1233 bp open reading frame that encodes a predicted 410 amino acid peptide, and a 527  bp  3’  untranslated  region  was  sequenced.    Using  5’  rapid  amplification  of  cDNA  ends,  the transcription start site of this gene was determined to lie an additional 29 nucleotides  upstream.  This gene is composed of seven exons and maps to a segment of linkage group  17 that is syntenic to the human TGFb3  locus on chromosome 14q24.  One stimulating  protein  (Sp1)  and  two  TATA  binding  protein  (TBP)  transcription  factor  binding  sites  were identified in the putative promoter segment upstream of the transcription start site.  Comparative  alignment  analysis  revealed  a  high  degree  of  tgfb3  nucleotide  and  amino  acid  identity  between zebrafish and other species,  including a complete conservation of  the  cysteine  knot  structure that  facilitates  protein­protein  interaction.    Also,  9 out of  10  amino acid residues critical for ligand/receptor binding in human TGFb3 are conserved in  zebrafish, suggesting a high degree of functional conservation even in lower vertebrates.  Zebrafish  tgfb3  expression  was  first  detected  in  the  notochord  (10  somite  to  high­pec  stage),  subsequently  in  the  developing  pharyngeal  arch  and  neurocranial  cartilage  (18  somite to protruding mouth stage), lens and heart (21 somite to protruding mouth stage),  and pectoral fins (prim­25). i  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Both  cartilage  staining  and  molecular  marker  analysis  results  showed  that  morphant  larvae  had reduced pharyngeal  arches,  neurocranial cartilage and pectoral  fin,  confirming that tgfb3 is involved in the formation of cartilages of the pharyngeal arches,  neurocranium, and pectoral fin appendages.  The quadrate bone that forms the main part  of  the  upper  jaw  skeleton  and  lateral  part  of  the  larval  palate  was  also  absent  in  the  morphants.  This observation is reminiscent of the cleft palate phenotype reported in the  Tgfb3­/­  null  mice,  suggesting  that  the  role  of  TGFb3  in  palatogenesis  has  been  conserved  throughout  vertebrate  evolution.    The  opercle  and  the  branchiostegal  rays  which  form  the  key  supportive  components  of  the  gill  chamber  of  zebrafish  were  also  reduced in the morphants, suggesting that tgfb3 is required for the proper assembly of the  gill  chamber.  Tgfb3  also  appears  to  be  essential  for  the  proper  formation  of  the  heart.  Our studies have revealed that loss of tgfb3 expression affects the heart field formation,  cardiac  cone  formation,  heart  tube  elongation,  and  heart  tube  looping  in  cardiac  morphogenesis.  Tgfb3  may  regulate  the  cardiomyocytes  population  by  limiting  the  expansion  of  heart  field  domain  in  the  midline  via  its  effect  on  the  notochord,  and  regulating the population of neural crest that would differentiate into cardiomyocytes.  Our  study  has  clearly  demonstrated  that  zebrafish  can  be  a  suitable  vertebrate  model  for  studying  human  craniofacial  development  and  disease,  and  the  finding  of  an  important role of tgfb3 in cardiac development is novel and has not been reported in other  model organisms. ii  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Acknowledgements  I thank  my  supervisor, A/P Samuel Chong  for his  invaluable guidance and patience, Yi  Zhou  (The  Children’s  Hospital  Zebrafish  Genome  Project  Initiative,  Boston,  MA)  for  performing  the  RH  mapping,  Vladimir  Korzh  (Institute of  Molecular  and  Cell  Biology,  Singapore)  for  invaluable  advice  and  technical  support,  Bill  Trevarrow  (University  of  Oregon  Zebrafish  Facility,  Eugene,  OR)  for  providing  breeding  stocks  of  the  AB  line,  Karuna  Sampath  (Temasek  Life  Science  Laboratories,  Singapore)  for  nkx2.5  and  ntl  molecular markers, Yi­Lin Yan (University of Oregon, Eugene, OR) for sox9a molecular  marker,  Monte  Westerfield  (University  of  Oregon,  Eugene,  OR)  for  dlx2  molecular  marker,  Bonnie  Ullmann  (University  of  Oregon,  Eugene,  OR)  for  alizarin  red  staining  protocol,  Jin  Ben  and  Gare  Hoon  Yeo  for  technical  assistance  and  motivation,  and  lab  members of A/P Chong’s lab for their constant encouragement and motivation.  Last but  not least, my beloved husband, Dennis Goh for his constant support, encouragement and  love during the arduous six years of my part­time graduate studies.  “The Sovereign LORD is my strength; he makes my feet like the feet of a deer, he enables  me to go on the heights.”  Habakkuk 3:19 iii  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  List of Figures  Fig. 1  The  relationship  between  hindbrain,  neural  crest  migration,  and  pharyngeal arches  Fig. 2  Identification of zebrafish ortholog of human tgfb3  Fig. 3  Full­length sequence of zebrafish tgfb3 cDNA  Fig. 4  Alignment  of  tgfb3  mature  bioactive  peptide  sequences  from  various  species using the Clustal W algorithm  Fig. 5  Genomic organization of zebrafish tgfb3  Fig. 6  Putative promoter sequence of zebrafish tgfb3  Fig. 7  Construction  of  pXDtgfb3EGFPpA  expression  vector  used  for  promoter  analysis study  Fig. 8  Evaluation of the 921 bp genomic DNA fragment upstream of tgfb3 gene  Fig. 9  Chromosomal localization of zebrafish tgfb3  Fig. 10  Reverse  transcription­polymerase  chain  reaction  (RT­PCR)  analysis  of  tgfb3 expression in the developing zebrafish embryo  Fig. 11  Zebrafish tgfb3 expression in the notochord (A­D) and lens (E­H)  Fig. 12  Zebrafish tgfb3 expression in the presumptive pharyngeal arch primordia,  pharyngeal arches, and neurocranial cartilage  Fig. 13  Zebrafish tgfb3 expression in the pectoral fins (A­C, F) and heart (D­H)  Fig. 14  Inhibition of zebrafish tgfb3 with splice modifying MorpholinoÔ  Fig. 15  Relative  quantitation  of  morphant  transcripts  in  uninjected  control  and  i1e2 knockdown morphant embryos using real­time PCR analysis  Fig. 16  Relative quantitation of wildtype transcripts in uninjected control and i1e2  knockdown morphant embryos using real­time PCR analysis  Fig. 17  A  BLAST  search  of  the  Genbank  database  using  sequence  of  e1i1­MO  (A) and i1e2­MO (B) as query iv  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Fig. 18  Gross morphant 3 dpf phenotypes  Fig. 19  Head  structure  of  a  four­day  old  wild­type  zebrafish  larva  (WT)  and  a  four­day old morphant larva (tgfb3 MO )  Fig. 20  Cartilaginous  head  skeleton  of  a  four­day  old  wild­type  zebrafish  larva  (WT) and a four­day old morphant larva (tgfβ3 MO )  Fig. 21  Expression  of  cartilage  marker  sox9a  in  the  pharyngeal  arches,  neurocranial  cartilage,  and  pectoral  fins  of  48hpf  wild­type  (WT)  and  tgfβ3 morphant (tgfβ3 MO ) larvae  Fig. 22  Expression of neural crest marker dlx2 in 14­somite stage wild­type (WT)  and tgfβ3 morphant (tgfβ3 MO ) embryos  Fig. 23  Pharyngeal bones development in knockdown tgfβ3 morphant larva  Fig. 24  Notochord phenotype in knockdown tgfβ3 morphant embryos  Fig. 25  Notochord cross­sectional area in morphant embryos  Fig. 26  Loss of tgfb3 affects the organization and posterior extension of the heart  field domain  Fig. 27  Cardiac cones formation in tgfb3 MO  embryos  Fig. 28  Heart tubes elongation and looping in tgfb3 MO  embryos  Fig. 29  Fig. 30  Morphogenesis of Kupffer’s vesicle (KV) is affected in tgfb3 MO  embryos  Synthesis  and validation of tgfb3 capped mRNA  used  for overexpression  studies  Fig. 31  Cartilaginous  head  skeleton  of  a  four­day  old  wild­type  zebrafish  larva  (WT) and a four­day old overexpressed larva (tgfβ3 OE )  Fig. 32  Notochord phenotype in overexpressed tgfβ3 (tgfβ3 OE ) embryos  Fig. 33  Cardiac cones formation in tgfb3 OE  embryos  Fig. 34  Heart tubes elongation in tgfb3 OE  embryos v  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Parsons, M. J., Pollard, S. M., Saude, L., Feldman, B., Coutinho, P., Hirst, E. M.,  and  Stemple,  D.  L.  (2002).  Zebrafish  mutants  identify  an  essential  role  for  laminins in notochord formation. Development 129, 3137­46.  Pelton,  R.  W.,  Saxena,  B.,  Jones,  M.,  Moses,  H.  L.,  and  Gold,  L.  I.  (1991).  Immunohistochemical localization of TGF beta 1, TGF beta 2, and TGF beta 3  in  the  mouse  embryo:  expression  patterns  suggest  multiple  roles  during  embryonic development. J Cell Biol 115, 1091­105.  Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., and Lin, S. (2002). The zebrafish as a model for  human disease. Front Biosci 7, d1439­53.  Piotrowski, T., and Nusslein­Volhard, C. (2000). The endoderm plays an important  role in patterning the segmented pharyngeal region in zebrafish (Danio rerio).  Dev Biol 225, 339­56.  Placzek,  M.,  Jessell,  T.  M.,  and  Dodd,  J.  (1993).  Induction  of  floor  plate  differentiation by contact­dependent, homeogenetic signals. Development 117,  205­18.  Postlethwait,  J.  H.,  Johnson,  S.  L.,  Midson,  C.  N.,  Talbot,  W.  S.,  Gates,  M.,  Ballinger, E. W., Africa, D., Andrews, R., Carl, T., Eisen, J. S., and et al.  (1994). A genetic linkage map for the zebrafish. Science 264, 699­703.  Postlethwait, J. H., Yan, Y. L., Gates, M. A., Horne, S., Amores, A., Brownlie, A.,  Donovan, A., Egan, E. S., Force, A., Gong, Z., Goutel, C., Fritz, A., Kelsh,  R., Knapik,  E.,  Liao,  E.,  Paw, B.,  Ransom,  D.,  Singer,  A.,  Thomson, M.,  Abduljabbar, T. S., Yelick, P., Beier, D., Joly, J. S., Larhammar, D., Rosa,  F.,  Westerfield,  M.,  Zon,  L.  I.,  Johnson, S.  L., and  Talbot,  W.  S.  (1998).  Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nat Genet 18, 345­  9.  Pourquie,  O.,  Coltey,  M.,  Teillet,  M.  A.,  Ordahl,  C.,  and  Le  Douarin,  N.  M.  (1993). Control of dorsoventral patterning of somitic derivatives by notochord  and floor plate. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 5242­6.  Proetzel, G., Pawlowski, S. A., Wiles, M. V., Yin, M., Boivin, G. P., Howles, P. N.,  Ding,  J.,  Ferguson,  M.  W.,  and  Doetschman,  T.  (1995).  Transforming  growth  factor­beta  3  is  required  for  secondary  palate  fusion.  Nat  Genet  11,  409­14.  Rampazzo,  A.,  Nava,  A.,  Danieli,  G.  A.,  Buja,  G.,  Daliento,  L.,  Fasoli,  G.,  Scognamiglio,  R.,  Corrado,  D.,  and  Thiene,  G.  (1994).  The  gene  for  arrhythmogenic  right  ventricular  cardiomyopathy  maps  to  chromosome  14q23­q24. Hum Mol Genet 3, 959­62.  Reiter, J. F., Alexander, J., Rodaway, A., Yelon, D., Patient, R., Holder, N., and  Stainier, D. Y. (1999). Gata5 is required for the development of the heart and  endoderm in zebrafish. Genes Dev 13, 2983­95.  Reiter,  J.  F.,  Verkade,  H.,  and  Stainier,  D.  Y.  (2001).  Bmp2b  and  Oep  promote  early  myocardial  differentiation  through  their  regulation  of  gata5.  Dev  Biol  234, 330­8.  Sachdev, S. W., Dietz, U. H., Oshima, Y., Lang, M. R., Knapik, E. W., Hiraki, Y.,  and Shukunami, C. (2001). Sequence analysis of zebrafish chondromodulin­  1  and  expression  profile  in  the  notochord  and  chondrogenic  regions  during  cartilage morphogenesis. Mech Dev 105, 157­62.  Sampath, K., Rubinstein, A. L., Cheng, A. M., Liang, J. O., Fekany, K., Solnica­  Krezel, L., Korzh, V., Halpern, M. E., and Wright, C. V. (1998). Induction  of the zebrafish ventral  brain and floorplate requires cyclops/nodal signalling.  Nature 395, 185­9. 143  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Sanford, L. P., Ormsby, I., Gittenberger­de Groot, A. C., Sariola, H., Friedman,  R.,  Boivin,  G.  P.,  Cardell,  E.  L.,  and  Doetschman,  T.  (1997).  TGFbeta2  knockout mice have multiple developmental defects that are non­ overlapping  with other TGFbeta knockout phenotypes. Development 124, 2659­70.  Sato, F., Natsume, N., Machido, J., Suzuki, S., and Kawai, T. (2001). Association  between  transforming  growth  factor  beta  3  and  cleft  lip  and/or  palate  in  the  Japanese population. Plast Reconstr Surg 107, 1909­10.  Sato,  M.,  and  Yost,  H.  J.  (2003).  Cardiac  neural  crest  contributes  to  cardiomyogenesis in zebrafish. Dev Biol 257, 127­39.  Saude, L., Woolley, K., Martin, P., Driever, W., and Stemple, D. L. (2000). Axis­  inducing activities and cell fates of the zebrafish organizer. Development 127,  3407­17.  Schier,  A.  F.,  Neuhauss,  S.  C.,  Helde,  K.  A.,  Talbot,  W.  S.,  and  Driever,  W.  (1997).  The  one­eyed  pinhead  gene  functions  in  mesoderm  and  endoderm  formation in zebrafish and interacts with no tail. Development 124, 327­42.  Schilling, T. F. (1997). Genetic analysis of craniofacial development in the vertebrate  embryo. Bioessays 19, 459­68.  Schilling,  T.  F.,  and  Kimmel,  C.  B.  (1994).  Segment  and  cell  type  lineage  restrictions  during  pharyngeal  arch  development  in  the  zebrafish  embryo.  Development 120, 483­94.  Schmid,  P.,  Cox,  D.,  Bilbe,  G.,  Maier,  R.,  and  McMaster,  G.  K.  (1991a).  Differential expression of TGF beta 1, beta 2 and beta 3 genes during mouse  embryogenesis. Development 111, 117­30.  Schmid, T. M., Bonen, D. K., Luchene, L., and Linsenmayer, T. F. (1991b). Late  events  in chondrocyte differentiation:  hypertrophy, type X collagen synthesis  and matrix calcification. In Vivo 5, 533­40.  Schulte­Merker,  S.,  Ho,  R.  K.,  Herrmann,  B.  G.,  and  Nusslein­Volhard,  C.  (1992). The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T gene  is expressed in nuclei of the germ ring and the notochord of the early embryo.  Development 116, 1021­32.  Sekelsky, J. J., Newfeld, S. J., Raftery, L. A., Chartoff, E. H., and Gelbart, W. M.  (1995).  Genetic  characterization  and  cloning  of  mothers  against  dpp,  a  gene  required  for  decapentaplegic  function  in  Drosophila  melanogaster.  Genetics  139, 1347­58.  Serbedzija, G. N., Chen, J. N., and Fishman, M. C. (1998). Regulation in the heart  field of zebrafish. Development 125, 1095­101.  Shi,  Y.,  and  Massague,  J.  (2003).  Mechanisms  of  TGF­beta  signaling  from  cell  membrane to the nucleus. Cell 113, 685­700.  Shih,  J.,  and  Fraser,  S.  E.  (1996).  Characterizing  the  zebrafish  organizer:  microsurgical analysis at the early­shield stage. Development 122, 1313­22.  Smith, A., Robinson, V., Patel, K., and Wilkinson, D. G. (1997). The EphA4 and  EphB1  receptor  tyrosine  kinases  and  ephrin­B2  ligand  regulate  targeted  migration of branchial neural crest cells. Curr Biol 7, 561­70.  Smith, J. L., and Schoenwolf, G. C. (1989). Notochordal induction of cell wedging  in the chick neural plate and its role in neural tube formation. J Exp Zool 250,  49­62.  Solursh, M., Jensen, K. L., Reiter, R. S., Schmid, T. M., and Linsenmayer, T. F.  (1986). Environmental regulation of type X collagen production by cultures of  limb mesenchyme, mesectoderm, and sternal chondrocytes. Dev Biol 117, 90­  101. 144  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Spemann,  H.  and Mangold,  H.  (1924).  Über  die  Induktion  von  Embryonalanlagen  durch  Implantation  artfremder  Organizatoren.  Wilhelm  Roux  Arch.  Entw.  Mech. Org. 100:599­638.  Stachel, S. E., Grunwald, D. J., and Myers, P. Z. (1993). Lithium perturbation and  goosecoid expression identify a dorsal specification pathway in the pregastrula  zebrafish. Development 117, 1261­74.  Stainier,  D.  Y.  (2001).  Zebrafish  genetics  and  vertebrate  heart  formation.  Nat  Rev  Genet 2, 39­48.  Stainier,  D.  Y.,  Beis,  D.,  Jungblut,  B.,  and  Bartman,  T.  (2002).  Endocardial  cushion formation in zebrafish. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 67, 49­56.  Stainier,  D.  Y.,  and  Fishman,  M.  C.  (1992).  Patterning  the  zebrafish  heart  tube:  acquisition of anteroposterior polarity. Dev Biol 153, 91­101.  Stainier,  D.  Y.,  Lee,  R.  K.,  and  Fishman,  M.  C.  (1993).  Cardiovascular  development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation.  Development 119, 31­40.  Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W., 3rd, Zon, L. I., and Fishman,  M. C. (1995). Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the  endothelial and hematopoietic lineages. Development 121, 3141­50.  Stemple, D. L. (2005). Structure and function of the notochord: an essential organ for  chordate development. Development 132, 2503­12.  Stemple, D. L., Solnica­Krezel, L., Zwartkruis, F., Neuhauss, S. C., Schier, A. F.,  Malicki, J., Stainier, D. Y., Abdelilah, S., Rangini, Z., Mountcastle­Shah,  E.,  and  Driever,  W.  (1996).  Mutations  affecting  development  of  the  notochord in zebrafish. Development 123, 117­28.  Streisinger,  G.,  Walker,  C.,  Dower,  N.,  Knauber,  D.,  and  Singer,  F.  (1981).  Production  of  clones  of  homozygous  diploid  zebra  fish  (Brachydanio  rerio).  Nature 291, 293­6.  Summerton,  J.,  and  Weller,  D.  (1997).  Morpholino  antisense  oligomers:  design,  preparation, and properties. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7, 187­95.  Sun, Z., and Hopkins, N. (2001). vhnf1, the MODY5 and familial GCKD­associated  gene,  regulates  regional  specification  of  the  zebrafish  gut,  pronephros,  and  hindbrain. Genes Dev 15, 3217­29.  Suzuki, Y., Jezewski, P. A., Machida, J., Watanabe, Y., Shi, M., Cooper, M. E.,  Viet le, T., Nguyen, T. D., Hai, H., Natsume, N., Shimozato, K., Marazita,  M. L., and Murray, J. C. (2004). In a Vietnamese population, MSX1 variants  contribute to cleft lip and palate. Genet Med 6, 117­25.  Taipale, J., Saharinen, J., and Keski­Oja, J. (1998). Extracellular matrix­associated  transforming growth factor­beta: role in cancer cell growth and invasion. Adv  Cancer Res 75, 87­134.  Talbot,  W.  S.,  Trevarrow,  B.,  Halpern,  M.  E.,  Melby,  A.  E.,  Farr,  G.,  Postlethwait, J. H., Jowett, T., Kimmel, C. B., and Kimelman, D. (1995). A  homeobox  gene  essential  for  zebrafish  notochord  development.  Nature  378,  150­7.  Tanabe,  A.,  Taketani,  S.,  Endo­Ichikawa,  Y.,  Tokunaga,  R.,  Ogawa,  Y.,  and  Hiramoto,  M.  (2000).  Analysis  of  the  candidate  genes  responsible  for  non­  syndromic cleft lip and palate in Japanese people. Clin Sci (Lond) 99, 105­11.  Taya, Y., O'Kane, S., and Ferguson, M. W. (1999). Pathogenesis of cleft palate in  TGF­beta3 knockout mice. Development 126, 3869­79. 145  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  ten  Dijke,  P.,  Geurts  van  Kessel,  A.  H.,  Foulkes,  J.  G.,  and  Le  Beau,  M.  M.  (1988a). Transforming growth factor type beta 3 maps to human chromosome  14, region q23­q24. Oncogene 3, 721­4.  ten  Dijke,  P.,  Hansen,  P.,  Iwata,  K.  K.,  Pieler,  C.,  and  Foulkes,  J.  G.  (1988b).  Identification of another member of the transforming growth  factor type  beta  gene family. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 4715­9.  Tonissen,  K.  F.,  Drysdale,  T.  A.,  Lints,  T.  J.,  Harvey,  R.  P.,  and  Krieg,  P.  A.  (1994).  XNkx­2.5,  a  Xenopus  gene  related  to  Nkx­2.5  and  tinman:  evidence  for a conserved role in cardiac development. Dev Biol 162, 325­8.  Towbin,  J.  A.  and  McQuinn,  T.  C.  (1995).  Gridlock:  a  model  for  coarctation  of  aorta. Nature Medicine 1, 1141­2.  Trainor, P., and Krumlauf, R. (2000). Plasticity in mouse neural crest cells reveals  a new patterning role for cranial mesoderm. Nat Cell Biol 2, 96­102.  Trainor,  P.  A.,  and  Krumlauf,  R.  (2001).  Hox  genes,  neural  crest  cells  and  branchial arch patterning. Curr Opin Cell Biol 13, 698­705.  Trainor,  P.  A.,  Sobieszczuk,  D.,  Wilkinson,  D.,  and  Krumlauf,  R.  (2002).  Signalling  between  the  hindbrain  and  paraxial  tissues  dictates  neural  crest  migration pathways. Development 129, 433­42.  Trinh,  L.  A.,  and  Stainier,  D.  Y.  (2004).  Fibronectin  regulates  epithelial  organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell 6, 371­82.  Trinh le, A., and Stainier, D. Y. (2004). Cardiac development. Methods Cell Biol 76,  455­73.  Trokovic,  N.,  Trokovic,  R.,  and  Partanen,  J.  (2005).  Fibroblast  growth  factor  signalling  and  regional  specification  of  the  pharyngeal  ectoderm.  Int  J  Dev  Biol 49, 797­805.  Tsukazaki,  T.,  Chiang,  T.  A.,  Davison,  A.  F.,  Attisano,  L.,  and  Wrana,  J.  L.  (1998).  SARA,  a  FYVE  domain  protein  that  recruits  Smad2  to the  TGFbeta  receptor. Cell 95, 779­91.  Tucker, A. S., and Sharpe, P. T. (1999). Molecular genetics of tooth morphogenesis  and patterning: the right shape in the right place. J Dent Res 78, 826­34.  van  Straaten,  H.  W.,  Hekking,  J.  W.,  Wiertz­Hoessels,  E.  J.,  Thors,  F.,  and  Drukker,  J.  (1988).  Effect  of  the  notochord on  the  differentiation  of a  floor  plate  area  in  the  neural  tube  of  the  chick  embryo.  Anat  Embryol  (Berl)  177,  317­24.  Veitch,  E.,  Begbie,  J.,  Schilling,  T.  F.,  Smith,  M.  M.,  and  Graham,  A.  (1999).  Pharyngeal arch patterning in the absence of neural crest. Curr Biol 9, 1481­4.  Vieira, A. R., Orioli, I. M., Castilla, E. E., Cooper, M. E., Marazita, M. L., and  Murray,  J.  C.  (2003).  MSX1  and  TGFB3  contribute  to  clefting  in  South  America. J Dent Res 82, 289­92.  Waddington,  C.  H.  (1930).  Developmental  mechanics  of  chick  and  duck  embryos.  Nature 125:924­925.  Waheed,  R.  M.  (1998).  Human  embryology  made  easy.  Chapter  12.  Australia:  Harwood Academic.  Waldo, K., Miyagawa­Tomita, S., Kumiski, D., and Kirby, M. L. (1998). Cardiac  neural  crest  cells  provide  new  insight  into  septation  of  the  cardiac  outflow  tract: aortic sac to ventricular septal closure. Dev Biol 196, 129­44.  Waldo, K., Zdanowicz, M., Burch, J., Kumiski, D. H., Stadt, H. A., Godt, R. E.,  Creazzo,  T.  L.,  and  Kirby,  M.  L.  (1999).  A  novel  role  for  cardiac  neural  crest in heart development. J Clin Invest 103, 1499­507. 146  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Waldo, K. L., Kumiski, D. H., Wallis, K. T., Stadt, H. A., Hutson, M. R., Platt, D.  H.,  and  Kirby,  M.  L.  (2001).  Conotruncal  myocardium  arises  from  a  secondary heart field. Development 128, 3179­88.  Walsh, E. C., and Stainier, D. Y. (2001). UDP­glucose dehydrogenase required for  cardiac valve formation in zebrafish. Science 293, 1670­3.  Wang, H., Long, Q., Marty, S. D., Sassa, S., and Lin, S. (1998). A zebrafish model  for hepatoerythropoietic porphyria. Nat Genet 20, 239­43.  Ward,  A.  C.,  and  Lieschke,  G.  J.  (2002).  The  zebrafish  as  a  model  system  for  human disease. Front Biosci 7, d827­33.  Warga,  R.  M.,  and  Kimmel,  C.  B.  (1990).  Cell  movements  during  epiboly  and  gastrulation in zebrafish. Development 108, 569­80.  Warga,  R.  M.,  and  Nusslein­Volhard,  C.  (1999).  Origin  and  development  of  the  zebrafish endoderm. Development 126, 827­38.  Warren, K. S., Wu, J. C., Pinet, F., and Fishman, M. C. (2000). The genetic basis  of cardiac function: dissection by zebrafish (Danio rerio) screens. Philos Trans  R Soc Lond B Biol Sci 355, 939­44.  Westerfield, M. (1995). The zebrafish  book: a guide  for  laboratory use of zebrafish  (Danio rerio). Eugene, OR: University of Oregon Press.  Wilkie,  A.  O.,  and  Morriss­Kay,  G.  M.  (2001).  Genetics  of  craniofacial  development and malformation. Nat Rev Genet 2, 458­68.  Wixon, J. (2000). Featured organism: Danio rerio, the zebrafish. Yeast 17, 225­31.  Wu, G., Chen, Y. G., Ozdamar, B., Gyuricza, C. A., Chong, P. A., Wrana, J. L.,  Massague,  J., and  Shi,  Y.  (2000).  Structural  basis  of  Smad2  recognition  by  the Smad anchor for receptor activation. Science 287, 92­7.  Xu, X., Meiler, S. E., Zhong, T. P., Mohideen, M., Crossley, D. A., Burggren, W.  W.,  and  Fishman,  M.  C.  (2002).  Cardiomyopathy  in  zebrafish  due  to  mutation in an alternatively spliced exon of titin. Nat Genet 30, 205­9.  Yan, Y. L., Hatta, K., Riggleman, B., and Postlethwait, J. H. (1995). Expression of  a type II collagen gene in the zebrafish embryonic axis. Dev Dyn 203, 363­76.  Yelick,  P.  C.,  and  Schilling,  T.  F.  (2002).  Molecular  dissection  of  craniofacial  development using zebrafish. Crit Rev Oral Biol Med 13, 308­22.  Yelon, D., Horne, S. A., and Stainier, D. Y. (1999). Restricted expression of cardiac  myosin  genes  reveals  regulated  aspects  of  heart  tube  assembly  in  zebrafish.  Dev Biol 214, 23­37.  Yelon, D., Ticho, B., Halpern, M. E., Ruvinsky, I., Ho, R. K., Silver, L. M., and  Stainier,  D.  Y.  (2000).  The  bHLH  transcription  factor  hand2  plays  parallel  roles in zebrafish heart and pectoral fin development. Development 127, 2573­  82.  Zhao,  Q.,  Eberspaecher,  H.,  Lefebvre,  V.,  and  De  Crombrugghe,  B.  (1997).  Parallel  expression  of  Sox9  and  Col2a1  in  cells  undergoing  chondrogenesis.  Dev Dyn 209, 377­86.  Zoltewicz, J. S., and Gerhart, J. C. (1997). The Spemann organizer of Xenopus  is  patterned along its anteroposterior axis at the earliest gastrula stage. Dev Biol  192, 482­91. 147  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Appendix 148  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  (A)  Medium Preparation  1)  Agar block  To make 10 ml, add the following to 10 ml of 5% sucrose solution:  0.15 g of Bacto agar (Sigma, USA)  Warm the agar solution until solutes have dissolved.  Keep the agar solution at (40 to 50°C).  2)  0.1% Alcian blue solution  To make a 100 ml, add the following solute to 70 ml absolute ethanol:  0.1 g of Alcian Blue (Sigma, USA)  1 ml of concentrated HCl (Fisher Scientific, USA)  Adjust the volume to 100 ml with sterile deionized water.  3)  Alkaline phosphatase buffer  To make a 200 ml, add the following:  20 ml of 1M TrisHCl (pH9.5 or 8.2)  10 ml of 1M MgCl2  (Sigma, USA)  4 ml of 5M NaCl (Sigma, USA)  2 ml of Tween 20 (Duchefa, Netherlands)  0.24 g of Levamisole (Sigma, USA)  Adjust the volume to 200 ml with sterile 0.1% DEPC­treated water.  4)  Blocking reagent  To make a 50 ml, add the following solutions: 149  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  5 ml of 5M NaCl  5 ml of Boehringer blocking reagent  Adjust the volume to 50 ml with sterile 0.1% DEPC­treated water.  5)  Boehringer Blocking Reagent  To make a 60 ml, add the following solute to 60 ml Maleic acid buffer:  6g of Boehringer Blocking Reagent (Roche Applied Sciences, Germany)  Boil the solution until the solutes have dissolved.  Store the solution at ­20°C.  6)  1M Citric acid (pH 6.2)  To make a 50 ml, add the following solute to 30 ml 0.1% DEPC­treated water:  9.61 g of Citric acid (Sigma, USA)  Adjust the pH to 6.2 with NaOH.  Adjust the volume to 50 ml with sterile 0.1% DEPC­treated water.  Sterile the solution by filtration through a 0.22 mm filter.  7)  0.4% ethyl m­aminobenzoate (pH 7.0)  To make a 100 ml, add the following:  0.4 g of ethyl m­aminobenzoate (Sigma, USA)  97.9 ml sterile water  2.1 ml of 1M Tris (pH 9.0)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  8)  1 M glucose solution 150  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  To make a 100 ml, add the following solute to 90 ml deionized water:  18 g of glucose (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the volume of the solution to 100 ml with deionized water.  Sterilize the solution by filtration through a 0.22 mm filter.  9)  3% H2O2  in 1% KOH  To make a 100 ml, add the following:  10 ml of 30% H2O2  (BDH, UK)  1 g of KOH (Sigma, USA)  90 ml sterile deionized water  10)  Hybridization buffer (pH 7.0)  To make a 50 ml, add the following solutions:  25 ml of 100% Formamide (Amresco, USA)  12.5 ml of 20X SSC (Sigma, USA)  43 ml of 58 mg/ml Heparin (Sigma, USA)  500 ml of 500 mg/ml yeast RNA (Sigma, USA)  50 ml of Tween 20 (Duchefa, Netherlands)  460 ml of 1M Citric acid (pH6.2) (Sigma, USA)  Adjust the volume to 50 ml with sterile 0.1% DEPC­treated water.  11)  0.5% KOH solution  To make a 100 ml, add the following solute to 100 ml of deionized water: 151  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  0.5 g of KOH (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle.  12)  LB (Luria­Bertani) medium  To make a litre, add the following solutes to 950 ml of deionized water:  10 g of Bacto­tryptone (Sigma, USA)  5 g of Bacto­yeast extract (Sigma, USA)  10 g of NaCl (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the pH to 7.0 with 5 N NaOH.  Adjust the volume of the solution to 1 litre with deionized water.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle.  13)  0.1% DEPC­treated 0.5M Maleic acid (pH 7.5)  To make a litre, add the following solute to 800 ml deionized water:  116.1 g of Maleic acid (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the pH to 7.5 with NaOH.  Adjust the volume to 1 litre with deionized water.  Add 1 ml of DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (Sigma, USA).  Incubate the solution overnight at 37°C.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle. 152  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  14)  Maleic  acid  buffer  (150  mM  Maleic  Acid  +  100  mM  NaCl  solution)  To make a 200 ml, add the following solutions:  60 ml of 0.5M Maleic acid (pH 7.5)  4 ml of 5M NaCl  Adjust the volume to 200 ml with sterile 0.1% DEPC­treated water.  15)  0.1% DEPC­treated 1 M MgCl2  To make a litre, add the following solute to 800 ml deionized water:  203.3 g of MgCl2.6H2O (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the volume to 1 litre with deionized water.  Add 1 ml of DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (Sigma, USA).  Incubate the solution overnight at 37°C.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle.  16)  0.1% DEPC­treated 5M NaCl  To make a litre, add the following solute to 800 ml deionized water:  292.2 g of NaCl (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the volume to 1 litre with deionized water.  Add 1 ml of DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (Sigma, USA).  Incubate the solution overnight at 37°C.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle. 153  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  17)  4% PFA (Paraformaldehyde)  To make a 50 ml, add the following solute into 50 ml of 1X PBST  2 g of PFA (Sigma, USA)  Incubate the solution at 70°C (in waterbath) until the solutes have dissolved.  Cool the solution to room temperature before use.  18)  1X PBS (Phosphate Buffered Saline)  To make a litre, add the following solutes to 800 ml deionized water:  8g of NaCl (Sigma, USA)  0.2 g of KCl (Sigma, USA)  1.44 g of Na2HPO4  (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the pH to 7.4 with HCl.  Adjust the volume to 1 litre with deionized water.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle.  19)  0.1% DEPC­treated 1X PBST (Phosphate Buffered Saline Tween  20)  To make a litre, add the following solutes to 800 ml deionized water:  8g of NaCl (Sigma, USA)  0.2 g of KCl (Sigma, USA)  1.44 g of Na2HPO4  (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the pH to 7.4 with HCl. 154  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Add 1 ml of Tween 20(Duchefa, Netherlands).  Adjust the volume to 1 litre with deionized water.  Add 1 ml of DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (Sigma, USA).  Incubate the solution overnight at 37°C.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle.  20)  S.O.C. medium  To make a litre, add the following solutes to 950ml of deionized water:  20 g of Bacto­tryptone (Sigma, USA)  5 g of Bacto­yeast extract (Sigma, USA)  0.5 g of NaCl (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Add 10 ml of 250 mM solution of KCl.  Adjust the pH to 7.0 with 5 N NaOH.  Adjust the volume of the solution to 1 litre with deionized water.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle.  Cool the autoclaved solution to 60°C.  Add 20 ml of sterilized 1 M glucose solution.  Shake the solution to mix.  21)  20X SSC (Saline Sodium Citrate)  To make a litre, add the following solutes to 800 ml deionized water:  175.3 g of NaCl (Sigma, USA)  88.2 g of Sodium citrate (Sigma, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved. 155  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  Adjust the pH to 7.0 with a few drops of a 10 N NaOH solution.  Adjust the volume to 1 litre with deionized water.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle.  22)  30% Sucrose solution  To make 50 ml, add the following solute to 50 ml of sterile water:  15 g of sucrose (Sigma, USA)  Warm the solution until the solutes have dissolved.  Sterilize the solution by filtration through a 0.22 mm filter.  23)  5% Sucrose solution  To make 50 ml, add the following solute to 50 ml of sterile water:  2.5 g of sucrose (Sigma, USA)  Warm the solution until the solutes have dissolved.  Sterilize the solution by filtration through a 0.22 mm filter.  24)  5% TCA (Trichloroacetic acid)  To make a 100 ml, add the following solute to 100 ml of sterile deionized water:  5 g of TCA (BDH, UK)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  25)  TE 10/1 (Tris­EDTA) (pH 8.0)  To make 100 ml, add the following solution and solute to 80 ml deionized water:  1ml of Tris HCl (pH7.6) 156  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  0.0372g EDTA (BioRad)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the pH to 8.0 with HCl.  Adjust the volume to 100 ml with deionized water.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle.  26)  0.1% DEPC­treated 1M TrisHCl (pH 9.5)  To make a litre, add the following solute to 800 ml deionized water:  121.1 g of Tris base (J K Baker, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the pH to 9.5 with HCl.  Adjust the volume to 1 litre with deionized water.  Add 1 ml of DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (Sigma, USA).  Incubate the solution overnight at 37°C.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle.  27)  0.1% DEPC­treated 1M TrisHCl (pH 8.2)  To make a litre, add the following solute to 800 ml deionized water:  121.1 g of Tris base (J K Baker, USA)  Shake the solution until the solutes have dissolved.  Adjust the pH to 8.2 with HCl.  Adjust the volume to 1 litre with deionized water.  Add 1 ml of DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (Sigma, USA).  Incubate the solution overnight at 37°C.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle. 157  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish  28)  0.1% DEPC­treated water  To make a litre, add the following solution to 1 litre deionized water:  1 ml of DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (Sigma, USA)  Incubate the solution overnight at 37°C.  Sterilize the solution by autoclaving for 20 minutes at 15 lb/sq. in. on liquid cycle. 158  [...]... markedly reduced  in the degrading MEE seam during  fusion process  (Blavier et al., 18  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish 2001).    This  suggests  that  the expression  of MMPs  and TIMPs  is  dependent  on  TGFb3.  Not much is known about the molecular mechanism control of TGFb3 during  palatogenesis.  However, two recent studies show that Tgfb3­induced palatal fusion is ... Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish phosphorylating  TβR­I  on  the serine  and threonine  residues  and thus  results  in the activation of TβR­I.  In addition, the TβR­II kinase domain can also phosphorylate itself.  The kinase domain of TβR­I phosphorylates its substrates on the serine residues only and this domain also contains a region known as L45 loop which has been known to interact ... al., 1998).  The SARA possesses a phospholipids binding FYVE domain which can target  the molecule to the membrane of the early endosomes.  The efficient recruitment of the 9  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish Smad 2 and Smad 3 to the activated receptors for phosphorylation is facilitated by these  interactions.  1.2.1.6 Mechanism of Smad phosphorylation and activation  The R­Smads ... 1998).    They  are  organized  sequentially  into  (a)  the extracellular  domain, (b) the GS domain, and (c) the kinase domain.  Generally, the extracellular domain resembles the so­called three­finger toxin fold  structure  (Greenwald  et  al.,  1999).  Each  finger  is  formed  by  a  pair  of anti­parallel  β 5  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish ... has different binding affinities to their  receptors and elicits different biological effects.  For  instance,  both TGFb1 and TGFb3  are  expressed  in tissue  structures  that  are  undergoing  morphogenesis  and TGFb2  is  expressed in differentiating and mature epithelium (Taipale et al., 1998).  1.2.1.9 Latent TGFb, latent TGFb binding protein, and bone 11  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish ... TATA­binding protein  Type I receptors  Type II receptors  Trichloroacetic acid  Transforming Growth Factor b3  Tgfb3 homozygous  tgfb3 morphant  tgfb3 overexpressed embryo  Injection Time  Tissue Inhibitors of Metalloproteinases  5’ Untranslated Region  3  Untranslated Region  van gogh  Wild­type ix  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish List of Publications ... towards improving patient management, and developing treatment.  As we know, craniofacial development is a highly controlled and complex process  which  begins  with  the formation  of neural  crest  cells  in the brain  and their  subsequent 1  Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish migration, together with the mesodermal cells, to form the facial primordia (Francis­West ... serine/threonine  kinase  then  recruits  and phosphorylates  the GS  domain  of the type  I  receptor  serine/threonine  kinase.    This  leads  to  the activation  of the type  I  receptor  serine/threonine  kinase.    Activated  type  I  receptor  serine/threonine  kinase  uses  its  GS  domain  and L45  loop  to  interact  with  the basic  pocket  and L3  loop  of R­Smad.    This  results  in the ... BC022242),  TGFb2  (GenBank  accession  number  NM_0 032 38),  and TGFb3  (GenBank  accession  number  NM_0 032 39).    All  isoforms  exhibit  very  similar  sequence to the prototype TGFb1, particularly the active domain where the spacing of the seven  cysteines  is  most  conserved  (Hinck  et  al.,  1996).  In mammals,  TGFb1,  TGFb2,  and TGFb3 are  highly conserved.  Each of them  has different binding affinities to their ... signalling  activity  in the cell.    Hence,  the GS  domain  forms  a  crucial regulatory region that controls the catalytic activity of the TβR­I kinase and/ or its  interaction with the substrates.  The kinase domain  found  in both TβR­I and TβR­II is a typical serine/threonine  protein  kinase  (Massague,  1998).    The TβR­II  kinase  domain  is  capable  of 6  Molecular characterization and developmental analysis . includes the transforminggrowthfactor b3(TGFb3),amember of the TGF b family. Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish 3 1.2 Litera tureReviews 1.2.1TransformingGrowthFactor. neuralcrestcells in the brain and theirsubsequent Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish 2 migration,togetherwith the mesodermalcells,toform the facialprimordia(FrancisWest et. and Activin.Both TGF and ActivinexhibitahighaffinityfortypeIIreceptors and theydo notinteractwith the isolatedtypeIreceptors(Shi and Massague,20 03) .Theseligands Molecular characterization and developmental analysis of the TGF Beta 3 gene in zebrafish 5 bind directly to the