BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI --------- TRẦN VĂN THỌ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRONG MỘT SỐ CÂY DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI --------- TRẦN VĂN THỌ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRONG MỘT SỐ CÂY DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60.42.01.20 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. DƯƠNG MINH LAM HÀ NỘI - 2014 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi tới TS. Dương Minh Lam lòng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn chân thành, người tận tình hướng dẫn giúp đỡ hoàn thành luận văn mình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Thầy/Cô giáo Phòng Sau Đại học, Thầy/Cô Khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội giúp đỡ nhiều suốt trình thực luận văn mình. Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy/Cô giáo tổ Bộ môn phòng CNSH – Vi sinh, Khoa Sinh học trường ĐHSP Hà Nội giúp nhiều việc thực luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị làm việc phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW – Bộ Y tế giúp đỡ thực thao tác lấy mẫu chụp ảnh hiển vi quang học điện tử quét. Đồng thời xin bày tỏ lòng biết ơn đến người thân gia đình, đồng nghiệp bạn có khích lệ tinh thần quan tâm sâu sắc thời gian thực đề tài này. Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2014 Tác giả luận văn Trần Văn Thọ ii LỜI CAM ĐOAN Xin cam đoan công trình nghiên cứu thân. Các số liệu có nguồn gốc, tuân thủ nguyên tắc, kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố. Tác giả luận văn Trần Văn Thọ iii MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn i Mục lục . iii Danh mục từ viết tắt . v Danh mục bảng . vi Danh mục hình . vii MỞ ĐẦU . Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn 1.1.1. Vị trí xạ khuẩn sinh giới . 1.1.2. Phân loại xạ khuẩn . 1.2. Đa dạng vai trò xạ khuẩn nội cộng sinh 1.3. Xạ khuẩn sinh kháng sinh . 15 1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh . 15 1.3.2. Định nghĩa phân loại chất kháng sinh 18 1.3.3. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh . 22 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 26 2.1. Vật liệu . 26 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu . 26 2.1.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định . 27 2.1.3. Hóa chất . 27 2.1.4. Dụng cụ thiết bị . 27 2.2. Các loại môi trường sử dụng . 28 2.2.1 Môi trường phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh . 28 2.2.2. Môi trường giữ giống xạ khuẩn 28 iv 2.2.3. Môi trường nghiên cứu hình thái xạ khuẩn . 29 2.2.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định 30 2.3. Các phương pháp nghiên cứu . 31 2.3.1. Phương pháp thu thập, xử lý mẫu phân lập dòng xạ khuẩn nội công sinh dược liệu . 31 2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn 33 2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh . 36 2.4. Phương pháp sử lý số liệu . 36 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 3.1. Phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh số dược liệu tự nhiên Việt Nam 37 3.2. Nhóm màu hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập . 38 3.3. Đặc tính sinh học xạ khuẩn nội cộng sinh phân loại xạ khuẩn 44 3.3.1. Đặc điểm hình thái chủng Streptomyces 44 3.3.2. Đặc điểm hình thái chủng Actinopolyspora 46 3.3.3. Đặc điểm hình thái chủng Saccharopolyspora . 47 3.4. Đặc điểm nuôi cấy 49 3.4.1. Màu sắc hệ sợi khí sinh, hệ sợi chất sắc tố tan 49 3.4.2. Khả đồng hóa nguồn cacbon . 52 3.4.3. Sự hình thành sắc tố melanin 56 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CNSH: Công nghệ sinh học ĐHSP: Đại học Sư phạm HSCC: Hệ sợi chất HSKS: Hệ sợi khí sinh VSVKĐ: Vi sinh vật kiểm định vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Một số loài xạ khuẩn nội cộng sinh phát . 13 Bảng 2.2. Một số chất kháng sinh từ xạ khuẩn hoạt tính chúng 16 Bảng 2.3. Phân loại chất kháng sinh . 19 Bảng 2.4. Một số chất kháng sinh công bố từ xạ khuẩn nội cộng sinh 23 Bảng 3.1. Kết phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh số loài dược liệu 37 Bảng 3.2. Các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu hoạt tính kháng sinh chúng 39 Bảng 3.3. Hoạt tính kháng sinh chủng xa khuẩn nội cộng sinh . 41 Bảng 3.4. Tỉ lệ chủng xạ khuẩn ức chế VSVKĐ . 42 Bảng 3.5. Hoạt tính đối kháng chủng xạ khuẩn tuyển chọn . 43 Bảng 3.6. Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 55 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh Streptomyces sp. EN27 hạt lúa mì Hình 1.2. Kháng sinh phát qua năm . 15 Hình 3.1. Hoạt tính kháng sinh số chủng xạ khuẩn tuyển chọn . 43 Hình 3.2. Hệ sợi mang bào tử số chủng Streptomyces . 45 Hình 3.3. Hệ sợi mang bào tử bào tử chủng S1A6 . 46 Hình 3.4. Hệ sợi mang bào tử bào tử chủng SC1A4 46 Hình 3.5. Hệ sợi mang bào tử số chủng Actinopolyspora 47 Hình 3.6. Hệ sợi mang bào tử bào tử chủng Sacchararopolyspora . 48 Hình 3.7. Màu sắc HSKS chủng S1A4 môi trường nghiên cứu . 50 Hình 3.8. Màu sắc HSCC chủng S1A4 môi trường nghiên cứu 50 Hình 3.9. Màu sắc HSKS chủng SC 1A4 môi trường nghiên cứu . 51 Hình 3.10. Màu sắc HSKS chủng SC 1A4 môi trường nghiên cứu….54 MỞ ĐẦU 1. Lý chọn đề tài Việt Nam quốc gia nằm bán đảo Đông Dương, khu vực Đông Nam Á, kéo dài từ vĩ độ 23023’ Bắc đến 8027’ Bắc, với 3260km bờ biển, 3/4 diện tích lãnh thổ đồi núi thấp. Nhiệt độ trung bình Việt Nam dao động từ 210C đến 270C tăng dần từ Bắc vào Nam. Lượng mưa trung bình hàng năm 1500 – 2000 mm, độ ẩm không khí 80%, lượng xạ mặt trời lớn với số nắng từ 1400 – 3000 giờ/năm [72]. Chính yếu tố vô thuận lợi giúp Việt Nam đánh giá trung tâm giàu đa dạng sinh học giới [12]. Hiện nay, Việt Nam có 300 loài thú, 830 loài chim, 260 loài bò sát, 158 loài lưỡng cư, khoảng 5.300 loài côn trùng 547 loài cá nước ngọt, 2.038 loài cá biển thống kê. Với thực vật có 481 loài Rêu (Bryophyta), 691 loài Dương xỉ (Polypodiophyta), 69 loài Hạt trần (Gymnospermae), với 10.386 loài thực vật có mạch, đặc biệt có 3.830 loài thực vật có giá trị mặt y học (cây thuốc) định danh [14]. Xạ khuẩn đối tượng nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới đa dạng hoạt chất chúng, đặc biệt chất kháng sinh. Cho đến nay, Việt Nam có nhiều công trình khoa học nghiên cứu xạ khuẩn phân lập đất canh tác, đất rừng, đất mặn…[1]. Một vài nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh (xạ khuẩn thể thực vật) rừng ngập mặn nghiên cứu [9], [13], nhiên, chưa có công trình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh đối tượng dược liệu tự nhiên. Nhiều nghiên cứu giới cho thấy mức độ đa dạng cao xạ khuẩn nội cộng sinh thuốc có tác động tích cực tới 51 màu đỏ vỏ trầu môi trường ISP 3, ISP 5, màu trắng môi trường ISP 4, màu nâu môi trường ISP ISP 7. Hình 3.9. Màu sắc HSKS chủng SC 1A4 môi trường nghiên cứu Hình 3.10. Màu sắc HSCC chủng SC 1A4 môi trường nghiên cứu 52 Sự khác hình thái khuẩn lạc, màu sắc HSKS, HSCC sắc tố môi trường môi trường khác chủng xạ khuẩn có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu sau này, giúp cho công tác phân loại tránh nhầm lẫn xếp chủng xạ khuẩn vào chi tương ứng. Kết chủng xạ khuẩn nội cộng sinh thể phần phụ lục. 3.4.2. Khả đồng hóa nguồn cacbon Khả đồng hóa nguồn cacbon 109 chủng xạ khuẩn thể bảng 3.9 Bảng 3.6. Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn nội cộng sinh STT Chủng ISP xạ khuẩn 9.1 F1A1 11 ISP 9.2 ISP 9.3 SP 9.4 Nguồn cacbon ISP ISP ISP 9.5 9.6 9.7 ISP 9.8 10 ISP 9.9 10 ISP 9.10 ISP 9.11 F1A2 13 12 11 12 12 16 12 15 13 F1A3 10 11 13 12 11 F1A4.1 11 12 10 15 10 F1A4.2 12 10 11 10 F1A5.1 11 10 10 10 11 10 F1A5.2 16 12 13 14 11 16 16 15 13 SC1A3 15 12 11 10 12 11 13 13 11 SC1A4 13 12 12 12 11 16 14 16 13 10 SC1A5 11 14 10 12 11 11 SC1A6 15 12 12 13 10 17 16 14 13 14 12 SC1A9 15 12 13 11 13 17 17 14 16 13 13 S1A1 14 10 12 13 10 12 11 11 14 S1A2 16 10 11 11 11 10 13 15 11 15 S1A3 16 13 12 13 10 12 14 14 11 13 10 16 S1A4 10 10 12 10 10 13 17 S1A5 16 18 21 14 18 17 12 16 53 18 S1A6 - - - - - - 19 S1A7 10 13 12 10 11 11 20 S1A8 12 14 16 12 13 15 15 18 10 16 11 21 S1A9 11 22 S1A10 11 12 11 23 S1A11 - 20 24 S1A13 25 S1A14 11 10 10 10 15 10 26 S1A15 12 11 10 12 - 11 10 20 12 12 27 S1A16 18 10 10 18 14 12 10 17 16 16 10 28 S1A20 12 13 10 10 10 12 10 10 10 12 29 S1A21 13 14 11 11 13 16 16 15 30 F2A2 17 13 12 17 14 16 12 14 14 12 31 F2A3 - - - - - 14 - - 13 - - 32 F2A4 18 15 14 16 - 14 13 16 16 18 12 33 F2A5 20 17 17 - 16 14 16 17 20 11 34 F2A6.1 11 - 12 12 12 16 16 16 13 16 35 F2A6.2 13 13 11 13 12 11 11 36 F2A9 21 14 13 16 11 13 20 17 18 17 12 37 F2A10 23 15 16 24 15 23 20 29 21 16 12 38 SC2A1 12 14 13 15 15 13 18 12 15 39 SC2A2 10 11 11 12 12 16 13 19 16 40 SC2A3 11 13 12 11 13 15 13 18 10 17 12 41 S2A1 11 10 14 11 10 13 12 16 11 11 11 42 S2A2 10 13 13 10 13 10 13 43 S2A3 21 13 15 18 17 17 18 18 19 11 44 S2A6 11 14 11 11 12 12 45 S2A8 12 12 10 - 15 12 11 15 12 46 S2A9 10 14 16 11 12 10 47 S2C1 13 15 14 14 13 13 11 48 S2C2 17 13 11 13 11 54 49 S3A1 22 11 13 23 16 18 21 23 18 18 13 50 S3A2 21 14 14 21 18 18 22 19 22 21 13 51 F4A1 20 13 13 21 18 12 20 17 20 16 16 52 F4A2 10 13 11 14 15 53 F4A3 10 12 10 16 14 54 F4A4.1 11 10 17 11 15 15 19 10 55 F4A4.2 15 17 15 12 15 14 13 14 10 56 F4A4.3 10 11 16 10 14 19 16 57 F4A5 13 10 10 14 10 11 10 13 12 12 10 58 F4A6 12 10 10 11 11 10 59 F4A7.1 17 11 15 15 13 11 15 15 13 15 60 F4A7.2 10 11 11 10 11 13 12 61 F4A9 - 62 F4A10 11 10 10 12 10 10 10 11 12 10 63 F4A11 11 12 12 10 11 14 10 64 F4A12 15 14 13 65 F4A13 14 12 10 13 13 10 11 66 SC4A01 19 10 12 18 12 14 15 17 18 17 67 SC4A1 11 11 11 11 12 14 14 68 SC4A2 13 11 12 13 11 12 15 12 10 69 SC4A3 19 10 21 11 17 16 16 16 70 SC4A4 11 12 10 12 10 18 15 10 13 71 SC4A5 14 10 15 10 14 14 11 10 72 SC4A6 13 12 10 16 10 15 21 22 10 73 SC4A7 17 15 20 14 11 17 16 15 18 10 74 SC4A8.1 18 13 21 17 11 21 17 75 SC4A8.2 12 10 10 76 SC4A8.3 18 19 13 20 17 25 22 14 15 77 SC4A9 12 12 10 13 11 10 14 11 11 10 78 SC4A10.1 18 12 13 18 11 14 16 18 18 19 79 SC4A10.2 26 13 13 24 19 14 13 22 23 15 10 55 80 SC4A11 23 11 10 28 14 14 14 20 24 22 10 81 SC4A12 26 12 11 27 14 11 12 23 23 24 10 82 SC4A13 26 11 10 28 10 11 14 22 23 25 83 SC4A14 18 11 12 15 12 13 14 15 15 15 12 84 SC4A15 18 17 21 18 13 16 85 SC4A16 10 11 13 11 86 SC4A17 13 11 12 13 11 12 15 12 10 87 SC4A18 14 12 11 13 12 10 11 11 13 13 10 88 SC4A19 15 13 17 12 13 16 15 13 89 SC4A20 10 12 12 13 14 90 SC4A21 27 16 16 22 22 15 16 24 18 19 19 91 SC4A22 13 15 11 16 11 18 10 92 SC4A23 21 12 19 23 15 14 21 21 21 17 10 93 SC4A24 13 10 16 10 15 18 17 11 94 SC4A25 10 10 15 11 17 18 18 95 SC4A26 10 11 14 10 14 14 18 96 SC4A27 11 11 12 11 13 16 97 SC4A28 12 12 11 13 12 15 17 15 13 98 SC4A29 11 11 11 11 12 12 18 14 14 10 99 SC4A30 14 11 18 13 18 22 11 100 SC4A31 10 10 17 10 14 17 16 10 101 SC4A32.2 12 11 18 12 18 22 21 10 102 SC4A33 25 10 26 20 14 13 16 25 19 12 103 SC4A4.1 23 11 11 25 13 11 11 21 22 22 10 104 S4A1 16 17 10 21 18 16 20 16 16 105 S4A3 11 12 14 12 11 10 11 13 12 11 106 S4A4 18 12 10 18 16 11 19 17 16 14 11 107 S4A5 10 10 11 11 10 13 10 15 108 F5C1 11 11 10 10 109 F5D1 15 15 14 13 10 15 15 16 13 15 56 Qua bảng số liệu nhận thấy: Gần toàn 109 chủng xạ khuẩn có khả đồng hóa 10 nguồn cacbon khác nhau. Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng khác nhiều, dao động khoảng từ – 24 mm. Trong nghiên cứu này, môi trường đối chứng có trường hợp tốc độ sinh trưởng mạnh so với môi trường có nguồn cácbon, hóa chất không tinh khiết, lẫn tạp chất làm chất dinh dưỡng. Đặc biệt đáng ý màu sắc hình thái chủng xạ khuẩn nguồn cacbon lại có khác biệt nhau. Đây để phân nhận biết phân loại xạ khuẩn. 3.4.3. Sự hình thành sắc tố melanin 109 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh cấy chấm điểm môi trường ISP ISP nhiệt độ 300C thời gian 10 ngày. Bắt đầu quan sát màu môi trường sau ngày 10 ngày. Nếu kết dương tính (+), màu môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu tối đến màu đen. Kết cho thấy, 109 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có 21 chủng (19.27%) có khả hình thành sắc tố melanin. 57 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua năm thực đề tài, thu số kết sau: 1. Đã phân lập 109 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 05 loài dược liệu tự nhiên Việt Nam (Artemisia vulgaris L., Artemisia annua L., Plantago asiatic L., Alternanthera sessilis (L.) A. DC., Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.), với 105 chủng (96,4%) từ rễ, chủng (2,7%) từ chủng (0,9%) từ quả. 2. Đã xác định 109 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh thuộc nhóm màu: Trắng (White) chiếm 51,38%, Xám (Gray) chiếm 38,53%, Nâu (Chromogenes) chiếm 3,67%, Vàng (Yellow) chiếm 3,67% Xanh (Green) chiếm 2,75%. 3. Đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc hệ thống môi trường ISP, khả đồng hóa nguồn cacbon, hình thái hiển vi, siêu hiển vi định loại 109 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh gồm 101 chủng (92,66%) thuộc chi Streptomyces, chủng (6,42%) thuộc chi Actinopolyspora, chủng 0,92% số chủng thuộc chi Saccharopolyspora. 4. 39,4% số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập có hoạt tính kháng sinh với vi sinh vật kiểm định. Số chủng ức chế vi khuẩn Gram âm 15 chủng chiếm 13.76%, Gram dương 42 chủng chiếm 38.53%, nấm men chủng chiếm 3.67% nấm mốc 10 chủng chiếm 9.17%. Trong có chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có hoạt tính kháng sinh tốt với vi khuẩn Gram dương S1A2, S1A6, S1A7, F1A4.2, SC1A3, SC1A4, F1A5.1. 4.2. Kiến nghị Kết nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ nguồn dược liệu lớn. Tuy nhiên, để có dự liệu hoàn chỉnh nguồn xạ khuẩn này, cần có nghiên cứu sâu hơn, đề nghị: 58 1. Định tên đến loài chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có hoạt tính cao với vi khuẩn Gram dương. 2. Nghiên cứu sâu hoạt tính kháng sinh, tách chiết, tinh định tên kháng sinh, kiểm tra đặc tính lý hoá chất kháng sinh chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1]. Biền Văn Minh (2000), “Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên”, Luận án TS Sinh học, Hà Nội, tr. 50-96. [2]. Bùi Thị Hà (2008), “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên”, Luận văn Thạc Sĩ Sinh học, Thái Nguyên, tr. 46 - 95. [3]. Bùi Thị Việt Hà (2006), “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam”, Luận án TS Sinh học, Hà Nội, tr. 30 - 78. [4]. Đỗ Tất Lợi (2004), “Những thuốc vị thuốc Việt Nam”, Nxb Y học. [5]. Đỗ Thu Hà (2004), “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng”, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội. [6]. Dương Minh Lam Nguyễn Thị Tần. (2013). “Nghiên cứu đặc điểm sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. QN63 chống vi khuẩn nhờn kháng sinh Staphylococcus aureus”. Tạp chí Khoa học Công nghệ, tr. 34-38, tập 7. [7]. Lê Gia Hy (1994), “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam”, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội, tr. 16-78. [8]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào, (2011), “Thực hành vi sinh vật”, Nxb Đại học Sư Phạm, tr. 95-105. [9]. Nguyễn Đình Việt (2014), “Nghiên cứu khả kháng tế bào ung thư chủng xạ khuẩn nội cộng sinh số rừng ngập nặm”, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, ĐHSP Hà Nội, tr. 30 - 50. 60 [10]. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011), “Điều tra, nghiên cứu số hoạt chất có khả kháng vi sinh vật kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn”, Viện Vi Sinh Vật Công Nghệ Sinh Học – Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr. 36 - 79. [11]. Nguyễn Thành Đạt (2011), “Cơ sở sinh học vi sinh vật”, Nxb ĐHSP Hà Nội. [12]. Phạm Bình Nguyên, Nguyễn Nghĩa Thìn (2002), “Đa dạng sinh học”, Nxb ĐHQG Hà Nội, tr. 61 – 76. [13]. Phùng Thị Ngọc Quyền (2014), “Nghiên cứu khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ số rừng ngập mặn”, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, ĐHSP Hà Nội. [14]. Trung tâm Tài Nguyên Môi Trường (Trường Đại học Tổng Hợp Hà Nội) (1995), “Tiến tới môi trường bền vững”, Nxb Nông nghiệp Hà Nội. [15]. Từ Minh Koóng (2007), “Kỹ thuật sản xuất dược phẩm”, Nxb Y học. TIẾNG ANH [16]. Ahmed M. (2012), “Isolation of microbial endophytes from some ethnomedicinal plants of Jammu and Kashmir”, Cholars research library, (2): 215 – 220. [17]. Araujo (2002), “Diversity ef endophytic bacteria population and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants”. Appl Environ Microbiol 68: 4996 – 4914. [18]. Araujo J.M. (1999), “Isolation of endophytic actinomycetes from roots and leaves of maize (Zea mays L.)”, Brazilian Archives of Biology and Technology, 43: 447 – 451. [19]. Arawan Shutsrirung (2013), “Diversity of endophytic actinomycetes in mandarin grown in northern Thailand, their phytohormone production potential and plant growth promoting activity”, Soil Science and Plant Nutrition, Volume 59, Issue 3, 322-330. 61 [20]. Bergey’s Manual Trust, (2012), “Systematic Bacteriology”, Volume Five, University of Georgia, USA. [21]. Blakrishna G., Shira Shanker A. and Pindi P.K. (2012), “Isolation of phosphate solibulizing actinomycetes from forest soils of Mahabubnagar district”, Appl, Environ. Microbiol.2: 271 – 275. [22]. Booth C. (1971), Methods in microbiology volume 4, us. Edition published by ACADEMIC PRESSINC, 111 Fifth Avenue, New York 10003. 279 -284. [23]. Cao L. (2004), “Isolation of endophytic actinomycetes from roots and leaves of banana (Musa acuminata) plants and their activities against Fusarium oxysporum f. sp. cubense”, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 20: 501 – 504. [24]. Castillo (2002), “Munumbicins, wide - -spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans”, Microbiology 148: 2675-2685. [25]. Castillo (2003), “Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp. NRRL 30566, an endophyte of Grenvillea pteridifolia”, FEMS Microbiol Lett 234: 183-190. [26]. Castillo (2006), “Munumbicins E-4 and E – 5; novel broadspectrumantibiotics from Streptomyces NRRL 3052”, FEMS Microbiol Lett 255: 296-300. [27]. Coombs JT, Franco (2003), “Isolation and identification of actinobacteria from surface sterilized wheat roots”, Appl, Environ. Microbiol. 69: 5603-5608. [28]. Coombs JT, Franco (2003), “Visualization of an endophytic Streptomyces Species in Wheat seed”, Appl, Environ. Microbiol. 69: 4260 – 4262. [29]. David A. Hopwood (2007), “Streptomyces in nature and medicine”, Oxford University Press. 62 [30]. Dinesh K. Maheshwari, 2011, “Bacteria in Agrobiology: Plant Growth Respomses”, Springer Berlin Heidelberg, Uttarakhand, India, 824 – 830. [31]. El-Gendy MMA, EL-Bondkly AMA (2010), “Production and genetic improvement of a novel antimycotic agent, saadamycin, against dermatophytes and other clinical fungi from endophytic Streptomyces sp. Hedaya 48”, J Ind Microbiol Biotechnol 37 (8): 831 – 841. [32]. Gangwar M. (2012), “Diversity of endophytic actinomyetes from wheat and its potential as plant growth promoting and biocontrol agents”, Journal of advanced laboratory research in Biology, ISSN 0976 – 7614. [33]. Gangwar M. (2014), “Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India”, African Journal of Microbiology Rederch, doi: 10.5897/AJMR2012.2452. [34]. Hema Shenpagam (2012), “isolation of endophytic actinomycetes from medicinal plants and its mutational effect in biocontrol activity”, IJPSR, Vol. 3, Issue 10, 0975-8232. [35]. HiMedia Laboratories, “Tryptone Glucose Extract Agar”, Technical Date, 1-2. [36]. Hua Hong Chen (2009), “Streptomyces mayteni sp. nov., a novel actinomycete isolated from a Chinese medicinal plant”, Antoni evan Leuwenhoek, 95: 47-53. [37]. Igarashi Y (2004), “Screening of novel bioactive compounds from plant associated actinomycetes”, Actinomycetologica 18: 63-66. [38]. Jansto JE, Carter GT (2010), “Biosynthetic potential of phylogentically unique endophytic actinomycetes from tropical plants”, Appl Environ Microbiol 76: 4377-4386. [39]. Kafur A. Khan AB (2011), “Isolation and screening of endophytic actinomycetes against human bacterial pathogens”, Ecoscan, 1: 173-177. 63 [40]. Ke Zhao (2010), “The diviversity and antimicrobial activity of endophytic actinomycetes isolated from medicinal plants in Paxi plateau, China”, Curr Microbiol. doi:10.1007/s00284-010-9685-3. [41]. Lee SO (2008), “ Isolation and characterization of endophytic actinomycetes from Chineses cabbage root as antagonists to Plasmodiophora brassicae”, J. Microbiol Biotechnol 18: 1741 – 1746. [42]. Liu M. (2013), “Endophytic Streptomyces sp. Y3111 from traditional Chinese medicine produced antitubercular pluramycins”, Appl Microbiol Biotechnol, doi 10.1007/s00253-013-5335-6. [43]. Mini P. R (2012), “Endophytic actinomycetes from Indian medicinal plants as antagonists to some phytopathogenic fungi”, Open access, vol 1, issue 4, 1730 – 1736 [44]. Okazaki T (2003), “Studies on actinomycetes isolation from plant leaves In: Kurtboke DI (ed) selective isolation of rare actinomycetes”, Queensland Complete Printing Service, Australia, pp 102 – 121. [45]. Pullen C (2002), “New and bioactive compounds from Steptomyces strains residing in the wood of zcelastraceae”, Planta 216: 162-167. [46]. Qin S. (2008), “Glycomyces endophyticus sp. nov., an endophytic actinomycete isolated from the root of Carex baccans Nees”, International Journal of Systemtic and Evolutionary Microbiology 58, 2525-2528. [47]. Qin S. (2009), “Isolation, diversity, and antimicrobial activity of rare actinobacteria from medicinal plants of tropical rain forests in Xishuangbanna, China”, App Environ Microbiol 75: 6176-6186. [48]. Qin S. (2011), “Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant – associated endophytic actinobacteria”, App Microbiol Biotechnol 89: 457 – 473. [49]. Qin S. (2012), “Nocardioides panzhihuaensis sp. nov., a novel endophytic actinomycete isolated from medicinal plant Jatropha curcas L.”, Antoni evan Leuwenhoek, doi. 10. 1007/s10482-012-9745-8. 64 [50]. Qin S. (2012), “Promicromonospora xylanilytica sp. nov., an endophytic actinomycete isolated from surface – sterilized leaves of the medicinal plant Maytenus austroyunnanensis”, International Journal of Systemtic and Evolutionary Microbiology 62, 84 – 89. [51]. Rungin S. (2012), “Plant growth enhancing effects by a siderophore – producing endophytic Streptomycetes isolated from a Thai jasmne rice plant (Oryza sativa L. cv. KDML105)”, Antonie van Leeuwenhoek, 102: 463 – 472. [52]. Sessitsch (2004), “Endophytic bacterial communities of field – grown potato plants and their plant – growth promoting and antagonistic abilities”, Can J Microbiol 50: 239 – 249. [53]. Shirling E – B. Gottlieb D. (1966), “Methods for characterization of Streptomyces species”, International Journal of systematic bacteriology, (16): 313 – 340. [54]. Strobel GA, Daisy B (2003), “Bioporospecting for microbial endophytes and their natural products”, Microbiol, Mol. Biol. Rev. 67: 491-302. [55]. Surette (2003), “Bacterial endophytes in processing carrots (Daucus carota L. var. sativus): their localization, population density, biodiversity and their effects on plant growth”, Plant Soil 253: 381 –390. [56]. Takahashi Y, Omura S (2003), “Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds”, Journal of General and Applied Microbioogy 49: 141 – 154. [57]. Tan HM (2006), “Isolation of endophytic actinomycetes from different cultivars of tomato and their activities against Ralstonia solanacearum in vitro”, World J Microbiol Biotechnol 22: 1275 – 1280. [58]. Teachowisan, John F. Peberdy (2003), “Isolation of endophytic actinomyctes from selected plants and their antifungal activity”, World Journal of Mcrobiology – Biotechnology, 19: 381 – 385. 65 [59]. Teachowisan, T., Wanbajob, A. (2006), “Identification os Streptomyces sp. Tc022, an endophytic in Alpinia galangal, and the isolation os actinomycin D”, Ann Microbiol 56 (2): 113- 211. [60]. Tian (2007), “Diversity of Cultivated and Uncultivated actinobacterial endophytes in the stems and root of rice”, Microbial ecology, 53: 700 – 707. [61]. Velazquez (2008), “Genetic diversity of endophytic bacteria which could be find in the apoplastic sap of medullary parenchym of the stem of healthy sugarcane plant”, J Basic Microbiol 48: 118 – 124. [62]. Verma (2009), “Endophytic actinomycetes from Azadirachta indica A. Juss: isolation, diversity, and anti-microbial activity”, Microb Ecol 57: 749-756. [63]. Waksman, S.A. (1961), The Actinomycetes, Classification, identification and description of genera and species, Baltimore, Williams & Wilkins, vol 2, 1741 – 1746 [64]. Yuan (2008), “Genetic characterization of endophytic actinobacteria isolated from the medicinal plants in Sichuan”, Ann Microbiol 58 (4): 597 – 604. [65]. Zhang X. (2012), “Sreening and Preliminary Identificaltion of Medicinal Plants Endophytic Actinomycetes Used for Inhibiting Penicillin – Resistant Staphylococcus aureus”, International Journal of Biology, (2): 119 – 124. [66]. Zhao (2010), “Pseudonocardia artemisiae sp. nov., a novel actinobacterium isolated from surface – sterilized Artemisia annua L.” Int J Syst Evol Microbiol. doi: 10.1099/ijs.0.021931-0. [67]. Zhao (2010), “Streptomyses artemisiae sp. nov., a novel actinobacterium isolated from surface – sterilized Artemisia annua L.” Int J Syst Evol Microbiol. 60: 27-32. [68]. Zhao (2010), “The diversity and antimicrobial activity of endophytic actinomycetes isolated from medicinal plants in Paxi plateau, China” Curr Microbiol. doi: 10.1007/s00284-010-9685-3. 66 [69]. Zhi XY (2009), “An update of the structure and 16S rRNA gene sequence – based definition of higher ranks of the class Actinobacteria, with the proposal of two new suborder and four new – families and emended descriptions of the existing higher taxa” International Journal of Systematic Bacteriology, 59: 589 – 608. [70]. Zhu (2009), “” Selective isolation and ansamycin – Targeted screeings of coomensal actinomycetes from the “Maytansinoids - Producing” arboreal Trewiamudi jlora, Curr Microbiol; 58: 87 – 94. [71]. Zin (2007), “Bioactive endophytic Streptomycetes from the Malay Pininsula”, FEMS Microbiol Lett 274: 83 – 88. WEB [72]. http://chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/NuocCHXHCNVietNa m/ThongTinTongHop/dialy [73]. http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir [74]. http://www.catalogueoflife.org/col/browse/tree/id/20073717. [...]... độ đa dạng và khả năng sinh chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh một số cây dược liệu tự nhiên ở Việt Nam 3 Nhiệm vụ nghiên cứu Nghiên cứu này nhằm đánh giá sự đa dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có hoạt tính quí từ một số cây dược liệu tự nhiên ở Việt Nam Cụ thể: - Phân lập xạ khuẩn nội công sinh từ các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả của một số cây dược liệu. .. liệu tự nhiên ở Việt Nam - Nghiên cứu đặc điểm hình thái và định loại các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh - Đánh giá mức độ đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh - Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có hoạt tính kháng sinh 4 Những đóng góp mới của đề tài 3 - Lần đầu tiên nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên các loài cây nghiên cứu - Xác định được độ đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trong một số cây dược. .. vực Đông Nam Á [12] Tuy nhiên, nghiên cứu xạ khuẩn trên cây thuốc ở Việt Nam hiện chưa có, nên chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu sự đa dạng và khả năng sinh chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trong một số cây dược liệu tự nhiên ở Việt Nam dưới sự hướng dẫn của TS Dương Minh Lam bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh học, Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 Mục đích nghiên cứu Đánh... Ở rễ, xạ khuẩn nội cộng sinh đa dạng hơn ở các phần khác Tian (2007) [60] khi phân tích 16S rADN của 45 và 33 chủng xạ khuẩn phân lập được từ thân và rễ, đã thấy rằng những chủng xạ khuẩn có nguồn gốc từ rễ thuộc vào 9 chi xạ khuẩn, trong khi đó xạ khuẩn có nguồn gốc thân chỉ thuộc vào 4 chi của xạ khuẩn Kết quả này đã chứng tỏ sự đa dạng của xạ khuẩn ở trong rễ cao hơn ở thân Sự đa dạng xạ khuẩn trong. .. trong đất là một trong những nguyên nhân giải thích sự đa dạng của xạ khuẩn nội cộng sinh ở trong rễ Xạ khuẩn trong môi trường đất có thể dễ dàng di chuyển vào trong rễ [30] Rễ vừa có vai trò hút nước, chất dinh dưỡng, đồng thời là nguồn cơ chất lý tưởng cho xạ khuẩn nội cộng sinh Strobel và Daisy (2003) cho rằng sự đa dạng của xạ khuẩn nội cộng sinh có thể tìm thấy trong vùng nhiệt đới và vùng ôn đới... lặp lại các thí nghiệm của mình và đã xác định được vị trí cư trú của chủng xạ khuẩn này trong cây cà chua Sinh vật nội cộng sinh cư trú bên cạnh các mô thực vật và thường được nuôi dưỡng và bảo vệ từ cây chủ Ngược lại, các sinh vật nội cộng sinh tạo điều kiện thuận lợi cho cây chủ sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, bảo vệ cây chủ [30] Xạ khuẩn nội cộng sinh là những xạ khuẩn sống trong mô của thực... Streptomyces và Microbispora trong cơ thể thực vật Rễ, thân, lá, quả là những bộ phận chứa đựng đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh Đa số xạ khuẩn nội cộng sinh được phân lập ở rễ nhiều hơn ở các phần khác của cơ thể [62], [71] Số lượng xạ khuẩn nội cộng sinh ở rễ nhiều 11 gấp đôi so với ở thân cây Azadirachta indica ở phía bắc Ấn Độ [62] Teachowisa (2003) [58] phân lập được 330 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ... tin về đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn phân lập được Có thể thấy rằng sự đa dạng và giàu có của xạ khuẩn nội cộng sinh ở rừng mưa nhiệt đới cao hơn so với các vùng khác Rừng mưa nhiệt đới là tiềm năng hứa hẹn của loài mới và nguồn kháng sinh mới Sự đa dạng này được thể hiện giữa các vùng khác nhau và giữa các loài thực vật khác nhau Ngày nay, xạ khuẩn nội cộng sinh vẫn đang được các nhà khoa... một hợp chất chống nấm saadamyein đã được tách chiết từ Streptomyces sp Hedaya 48 nội cộng sinh, và đã thể hiện hoạt lực đáng kể trong việc chống lại những bệnh nấm ngoài da và một số loại nấm khác [31] Những nghiên cứu trên một lần nữa chứng minh xạ khuẩn nội cộng sinh là nguồn hứa hẹn tiềm năng của chất kháng sinh mới Bảng 2.4 Một số chất kháng sinh mới công bố từ xạ khuẩn nội cộng sinh [48] XK nội. .. lượng chủng xạ khuẩn có nguồn gốc từ rễ khi phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh từ cây lúa mì Năm 2014, Gangwar [33] phân lập được 40 chủng xạ khuẩn nội cộng từ rễ, thân và lá của 3 cây thuốc ở Ấn Độ, trong đó 70% số lượng chủng có nguồn gốc từ rễ, 17.5% chủng có nguồn gốc từ thân và 12.5% chủng có nguồn gốc từ lá El – Tarabily (2009) [30] đã ước lượng được xạ khuẩn nội cộng sinh trong rễ cây dưa chuột và . NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRONG MỘT SỐ CÂY DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60.42.01.20. Nam hiện chưa có, nên chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu sự đa dạng và khả năng sinh chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trong một số cây dược liệu tự nhiên ở Việt Nam . kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh một số cây dược liệu tự nhiên ở Việt Nam. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Nghiên cứu này nhằm đánh giá sự đa dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ khuẩn