PHÁT TRIỂN BIOFLOC TRONG NƯỚC AO NUÔI TÔM THÂM CANH BẰNG CÁC NGUỒN NGUYÊN LIỆU CARBON KHÁC NHAU Lê Thanh Ngọc Uyên * , Hoàng Tùng, Trịnh Thị Trúc Ly Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Quốc Tế - ĐHQG TPHCM 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo của FAO năm 2010 Trung Quốc là nước dẫn đầu nghề nuôi tôm của thế giới với 899.600 tấn, kế đến là Thái Lan 548.800 tấn và Việt Nam 357.700 tấn. Năm 2011 xuất khẩu tôm của Việt Nam đã đạt gần 2,4 tỉ đôla, đứng đầu danh mục các mặt hàng xuất khẩu thủy sản. Bên cạnh những lợi ích mang lại cho xã hội, thiệt hại do nghề nuôi tôm gây ra cũng rất lớn. Tình trạng dịch bệnh bùng nổ ngày càng thường xuyên và ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long đã trở nên nghiêm trọng trong năm 2011. Nguyên nhân chính của sự bùng nổ dịch bệnh tôm là do sự suy thoái về môi trường. Thức ăn nuôi tôm là nguồn dinh dưỡng giàu protein (35-45%). Theo nhiều nghiên cứu khoảng 70% các chất dinh dưỡng đưa vào ao sẽ tồn đọng trong môi trường nuôi. Sự phân hủy thức ăn thừa và các chất thải của tôm tạo ra một lượng lớn các hợp chất nitơ. Trong đó, ammonia và nitrite là các hợp chất độc hại, có thể gây chết đối với tôm cá (Avnimelec 2009). Việc nuôi thâm canh càng làm tăng sự tích tụ của các chất độc hại và không chỉ gây chết tôm nuôi mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường nước xung quanh ao nuôi (Piedrahita 2003). Do đó, để quản lý tốt nguồn nước cần đảm bảo loại bỏ các chất thải trong ao một cách triệt để. Công nghệ lọc tuần hoàn thực hiện việc xử lý nước bên ngoài ao. Nước thải được dẫn ra một ao riêng biệt để lắng, lọc cơ học, lọc sinh học, sau đó tái sử dụng hoặc thải ra môi trường. Tuy nhiên, phương pháp này khá phức tạp, đòi hỏi chi phí cao và chiếm diện tích lớn. Việc xử lý nước ngay bên trong ao bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn dị dưỡng phát triển, chuyển chất thải hữu cơ thành sinh khối của vi khuẩn được xem là giải pháp hữu hiệu hơn. Đây cũng là cơ sở của công nghệ biofloc (Hoàng Tùng 2010). Thông thường hàm lượng nitơ trong ao cao hơn rất nhiều so với lượng carbon hữu cơ. Để thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn dị dưỡng cần bổ sung một lượng carbon hữu cơ với tỉ lệ thích hợp (C/N>10) để cân bằng lượng nitơ sẵn có trong ao (Avnimelec 2009). Bổ sung đủ carbon tạo điều kiện cho vi khuẩn dị dưỡng sử dụng hết chất thải hữu cơ, chuyển hóa ammonia, do đó làm sạch môi trường. Các hạt flocs có thể được sử dụng trực tiếp bởi tôm, cá (Thompson 2002). Vi khuẩn đặc trưng cho floc thường có khả năng tổng hợp các chất sinh ngoại bào. Các chất này được tiết ra để kết dính các vi khuẩn lại với nhau thành những hạt floc. Poly-β-hydroxybutyrate là chất sinh ngoại bào có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh. Một số nghiên cứu gần đây cho biêt poly-β-hydroxybutyrate có tác dụng ngăn ngừa bệnh của tôm cá (Schryver 2008). Công nghệ biofloc không chỉ mang lại lợi ích trong xử lí nước thải, tiết kiệm chi phí thức ăn, hỗ trợ phòng bệnh mà còn hạn chế tối đa việc thay nước ao, nâng cao tỉ lệ sống của tôm nuôi. Công nghệ này đã được thử nghiệm và ứng dụng thành công ở một số nước trên thế giới như Malaysia, Indonesia, Belize, Mexico, Trung Quốc … nhưng vẫn còn khá mới mẻ ở Việt Nam. Trong nghiên cứu này chúng tôi thử nghiệm tạo flocs từ nước ao nuôi tôm tại Bà Rịa Vũng Tàu bằng cách bổ sung 3 loại nguyên liệu có hàm lượng carbon hữu cơ cao là mật rỉ đường, bột ngô và đường cát; phân lập và định danh các vi khuẩn thu được từ bioflocs làm cơ sở cho việc phát triển công nghệ bioflocs tại địa phương. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Mẫu nước được lấy từ ao nuôi tôm thâm canh ở Lộc An, Bà Rịa Vũng Tàu vào thời điểm tôm được khoảng 2 tháng tuổi. Rỉ đường (19.52%C), bột ngô (44.1%C, 1.92%N) và đường cát (40.22%C) là 3 nguồn nguyên liệu được sử dụng để phát triển flocs. 2.2. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 1 nghiệm thức đối chứng và 3 nghiệm thức với 3 nguồn carbon hữu cơ là rỉ đường, bột ngô và đường cát. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, sử dụng túi nhựa PE với 22 lít nước thu từ ao nuôi tôm thâm canh cho mỗi túi. Các thông số môi trường ban đầu gồm độ mặn 5 ppt, nhiệt độ 28 o C, pH = 8,5; TAN = 4,9 mg/L; nitrite = 4,5 mg/L và nitrate = 65 mg/L. Tiến hành sục khí liên tục đảm bảo hàm lượng oxy hòa tan luôn cao hơn 6 mg/L. Lượng carbon bổ sung hàng ngày dựa vào hàm lượng TAN và nitrite: C = (TAN + nitrite)*12.5 theo Avnimelec (1999) và Jorgensen et al. (1994). Hai ngày một lần xác định lượng flocs hình thành bằng cách để mẫu nước lắng 20 phút trong bình Imhoff. Tiếp theo các chỉ tiêu: chất rắn lơ lửng (suspendid solid), chất rắn lơ lửng dễ bay hơi (volatile suspendid solid), chỉ số thể tích floc (floc volume index) được xác định để đánh giá chất lượng floc. Chất rắn lơ lửng là lượng chất rắn thu được sau khi sấy khô mẫu floc đến trọng lượng không đổi. Đem nung chất rắn lơ lửng ở 500 o C trong 15 phút được chất tro. Khối lượng chất rắn lơ lửng trừ chất tro thể hiện khối lượng chất rắn lơ lửng bay hơi. Chỉ số thể tích được tính bằng lượng thể tích floc được chiếm bởi 1g chất rắn lơ lửng bay hơi. Hàm lượng TAN, nitrite, nitrate, độ pH và nhiệt độ được đo hàng ngày vào lúc 10 giờ sáng. Để phân lập vi khuẩn có liên quan đến flocs chúng tôi thu mẫu flocs vào ngày thứ 8, ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 10 phút. Các hạt floc được tách ra chuẩn bị cho quá trình phân lập. Phân lập vi khuẩn được thực hiện trên NA (nutrient agar) với độ pH được điều chỉnh theo độ pH của đối chứng (8.5) và từng nghiệm thức (7.9 đối với rỉ đường; 8.0 đối với bột ngô và đường cát). Các chủng vi khuẩn thuần khiết được thực hiện định danh bằng phương pháp sinh học phân tử tại công ty Nam Khoa, Khu Công nghệ Cao TPHCM. Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phân tích phương sai một yếu tố với Tukey’ HSD Posthoc test ở mức ý nghĩa 0,05. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sự hình thành floc Flocs hình thành từ ngày thứ 2 của thí nghiệm. Màu nước dần chuyển sang màu kaki. Nghiệm thức mật rỉ đường và bột ngô đạt sinh khối floc cao nhất vào ngày thứ 6. Trong khi đó nghiệm thức sử dụng đường cát đạt sinh khối cao nhất vào ngày thứ 8 (Hình 1). Hình 1: Lượng flocs hình thành trong các nghiệm thức 3.2. Hàm lượng TAN, nitrite, nitrate và độ pH Kết quả phân tích thống kê cho thấy có sự khác biệt đáng kể của TAN giữa nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức còn lại (P<0.05). Hàm lượng nitrite và nitrate giảm mạnh vào thời gian cuối của thí nghiệm trong khi vẫn tồn tại ở mức cao ở nghiệm thức đối chứng (Hình 4, 5). Trong các nghiệm thức được bổ sung carbon hữu cơ TAN sụt giảm đáng kể vào ngày thứ 2 của thí nghiệm, chỉ còn 25% so với đối chứng. Tuy nhiên, không có sự khác biệt nào về TAN giữa các nghiệm thức được bổ sung carbon hữu cơ (P>0.05). Sự sụt giảm nhẹ TAN và pH ở đối chứng là kết quả của tiến trình phân hủy chất hữu cơ. Sự sụt giảm mạnh TAN và pH (Hình 2, 3) vào ngày thứ 2 là bằng chứng cho thấy việc hình thành floc đã tiêu thụ một lượng TAN đáng kể, và do đó làm giảm pH. Trong bột ngô có một phần protein và sự phân hủy của nó làm cho TAN tăng nhẹ từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4. Sự thay đổi pH ở các nghiệm thức trong suốt thời gian thí nghiệm là rất thấp (0.1 - 0.3), cho thấy hiệu quả của công nghệ bioflocs trong bình ổn độ pH của môi trường nuôi. Nghiệm thức sử dụng mật rỉ đường là ổn định nhất. Độc tính của NH 3 tự do phụ thuộc vào độ pH và nhiệt độ (Hargreaves 1998). Độ pH và hàm lượng ammonia tổng thấp làm hạn chế độc tính của NH 3 thấp. Do đó, mặc dù không có sự khác biệt rõ trong việc làm sụt giảm TAN ở các nghiệm thức nhưng mật rỉ đường có thể được xem là hiệu quả nhất trong 3 nguồn carbon hữu cơ đã sử dụng. Hình 2: Biến đổi của hàm lượng TAN trong thời gian thí nghiệm Hình 3: Biến đổi của độ pH trong thời gian thí nghiệm Hình 4: Biến đổi của hàm lượng nitrite (mg/L) trong thời gian thí nghiệm Hình 5: Biến đổi của hàm lượng nitrate (mg/L) trong thời gian thí nghiệm 2.3. Chất rắn lơ lửng (SS), chất rắn lơ lửng bay hơi (VSS) và chỉ số thể tích (FVI): Chất rắn lơ lửng, chất rắn lơ lửng bay hơi và chỉ số thể tích là 3 thông số thể hiện đặc tính của flocs (De Schryver 2008). Giá trị chất rắn lơ lửng bay hơi thể hiện lượng sinh khối tồn tại trong hạt floc. Lượng sinh khối chiếm 67% đối với floc tạo thành từ mật rỉ đường và bột ngô nhưng chỉ chiếm 50% đối với nghiệm thức đường cát. Chỉ số thể tích floc liên quan trực tiếp đến việc sử dụng floc làm thức ăn cho tôm cá. FVI thấp từ 40 - 60mL/g, tốc độ lắng của floc nhanh, thời gian lơ lửng ngắn, hạn chế khả năng bắt mồi của tôm cá. Hơn nữa, sự lắng tụ nhanh của floc ở đáy ao tạo môi trường kị khí, làm ảnh hưởng xấu đến việc phát triển floc. Ngược lại, FVI quá lớn, hạt floc to mắc vào mang cá gây ảnh hưởng xấu đến cá và tôm cũng không thể sử dụng được. Mặc dù vẫn chưa có nghiên cứu thực nghiệm nào chỉ ra giá trị FVI nào là tốt nhất. De Schryver (2008) kiến nghị FVI > 200mg/L là phù hợp, tránh hiện tượng lắng tụ nhanh trong khu vực có độ khuấy động thấp. Bảng 2: Tổng lượng chất rắn lơ lửng (SS), chất rắn lơ lửng bay hơi được (VSS) và chỉ số thể tích flocs (FVI) thu được từ các nghiệm thức NghNghiệm Nghiệm thức SS (g/L) VSS(g/L) FVI(mL/g) Mật rỉ đường 0.3 0.2 109.4 Bột ngô 0.3 0.2 133.7 Đường cát 0.4 0.2 109.6 2.4. Vi khuẩn thường trú trong floc Chúng tôi đã phân lập được 22 chủng vi khuẩn từ flocs với tần suất xuất hiện khác nhau. Trong đó 6 chủng vi khuẩn được tìm thấy nhiều nhất ở các nghiệm thức được chọn để định danh phân tử. Kết quả định danh đã chỉ ra các chủng Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas nitroreducens, Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter cloacae EcWSU1 và Enterobacter cloacae SL9_4C. Trong số này Citrobacter freundii và Klebsiella pneumoniae có khả năng tham gia chuyển hóa nitơ trong thủy vực. Duy nhất chỉ có Pseudomonas nitroreducens là vi khuẩn có khả năng tổng hợp poly-hydroxy-butyrate và poly-hydroxy-alkanoate. Ba chủng còn lại nhiều khả năng là vi khuẩn cơ hội, lẫn vào flocs từ mẫu nước. De Schryver (2008) cho biết poly-hydroxy-alkanoate đóng vai trò quan trọng trong việc tạo cầu nối cho các chất tạo thành floc. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào đề cập cụ thể đến tác dụng của poly-hydroxy- alkanoate với vai trò là chất sinh nội bào. Mặc dù, Klebsiella pneumoniae giữ vai trò trong việc chuyển hóa ni tơ nhưng nó là vi khuẩn gây bệnh. Do đó, cần thận trọng trong việc tăng sinh khối chủng vi khuẩn này khi phát triển floc. 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ + Mật rỉ đường, bột ngô hoặc đường cát có thể được sử dụng để phát triển floc trong nước ao nuôi tôm và làm giảm đáng kể TAN trong nước. Trong số các nguyên liệu thử nghiệm, mật rỉ đường là hiệu quả nhất trong việc làm giảm TAN và ổn định pH. + Đã phân lập được 22 chủng vi khuẩn có liên quan đến flocs. Trong số 6 chủng đầu tiên được định danh phân tử có Pseudomonas nitroreducens là vi khuẩn có khả năng sản sinh poly- hydroxy-butyrate và poly-hydroxy-alkanoate, được xem là quan trọng trong quá trình tạo flocs. + Để tiếp tục nghiên cứu về công nghệ bioflocs trong nuôi tôm cần định danh phân tử tất cả các chủng vi khuẩn đã phát hiện. Cần thử nghiệm hướng bổ sung những chủng vi khuẩn tìm được trong flocs vào ao kết hợp với cung cấp carbon hữu cơ để nhanh chóng tạo sinh khối flocs trong ao nuôi tôm. LỜI CẢM ƠN Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Công ty Tôm giống CP Mạnh Cường tại Lộc An và Công ty TNHH Thủy sản Hoàng Nguyên tại Bà Rịa đã hỗ trợ thực hiện nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các anh chị tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Y sinh Phân tử của Trường Đại học Quốc tế - ĐHQG TPHCM. TÀI LIỆU THAM KHẢO Avnimelech Y. 1999. Carbon/nitrogen ratio as a control element in aquaculture systems. Aquaculture 176: 227-235. Avnimelech Y. 2009. Biofloc Technology. A practical guide book. World Aquaculture Society. De Schryver P. 2008. The basics of bio-flocs technology: The added value for aquaculture. Aquaculture 2007: 125-127. FAO. 2010. The state of world fisheries and aquaculture. FAO, Rome. Hoàng Tùng 2010. Nuôi tôm bằng công nghệ bioflocs. Báo Sài gòn Giải phóng, TPHCM. Piedrahita R. H. 2003. Reducing the potential environmental impact of tank aquaculture effluents through intensification and recirculation. Aquaculture 226: 35-44. Stickney 2005. Aquaculture: An introductory text. Cambridge, USA. CABI Publ: 256. Thompson, F.L., Abreu, P.C., Wasielesky, W., 2002. Important of biofilm for water quality and nourishment in intensive shrimp culture. Aquaculture 203, pp.263-278 ABSTRACT The application of biofloc technology (BFT) has recently attracted increasing interest in shrimp farming. This technology is characterized by adjusting C/N ratio in pond water to control excessive nitrogen build-up. It has been known that the formation and quality of bioflocs depend upon the source of supplementary organic carbon. In this present study effluent from intensive shrimp pond in Vung Tau was used for biofloc formation using three different carbon sources, namely molasses (19.5%C), corn meal (44.1%C; 1.5%N), and food-graded sugar (40.2%C) in an 8-day trial. Bioflocs were observed from day 2 of the experiment in association with a significant reduction of TAN and more stable pH. The rate of RAN reduction was highest in the mollasses treatment and lowest in the food- graded sugar treatment (P<0,05). Twenty two bacteria strains were found associated with the flocs. Among these Pseudomonas nitroreducensi was identified as an important strain. This bacterium is able to synthesise polyhydroxybutyrate homopolymer. Key words: bioflocs technology, organic carbon source, nitrogenous compound, floc volume . PHÁT TRIỂN BIOFLOC TRONG NƯỚC AO NUÔI TÔM THÂM CANH BẰNG CÁC NGUỒN NGUYÊN LIỆU CARBON KHÁC NHAU Lê Thanh Ngọc Uyên * , Hoàng Tùng, Trịnh Thị. cát có thể được sử dụng để phát triển floc trong nước ao nuôi tôm và làm giảm đáng kể TAN trong nước. Trong số các nguyên liệu thử nghiệm, mật rỉ đường là hiệu quả nhất trong việc làm giảm TAN và. khuẩn thu được từ bioflocs làm cơ sở cho việc phát triển công nghệ bioflocs tại địa phương. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Mẫu nước được lấy từ ao nuôi tôm thâm canh ở Lộc An,