XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH NERVOUS NECROSIS VIRUS TRÊN CÁ CHÌNH NUÔI TẠI THỪA THIÊN HUẾ Phạm Thị Tâm 1 , Phạm Công Hoạt 2 , Nguyễn Quang Linh 3 1 Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội 2 Bộ Khoa học và công nghệ 3 Trường Đại học Nông lâm Huế TÓM TẮT Từ 30 mẫu cá chình thu thập ở vùng biển Thừa Thiên- Huế nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh đã phát hiện được 4 mẫu có bệnh tích ở mô não cũng như bệnh tích trên tế bào mẫn cảm GS. Bằng phương pháp giải trình tự vùng biến đổi T4 trên RNA2 đã xác định được 04 chủng này thuộc nhóm viếu gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá chình Châu Âu (European Nervous Necrosis Virus ) Từ khóa: cá chình, vùng biến đổi T4, European Nervous Necrosis Virus 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh hoại tử thần kinh (Nervous necrosis disease) do Nervous Necrosis Virus- NNV là bệnh cấp tính, xuất hiện trên 22 loài cá, trong đó có các loài: mú (Epinephelus sp.), cá chình (Anguilla anguilla), chẽm (Lates calcarifer), giò (Racycentron canadum). Bệnh chủ yếu trên cá giống, tỷ lệ chết có thể lên đến 90 – 100%. Hầu hết những nghiên cứu về VNN đều cho thấy: mô đích của NNV là hệ thần kinh trung ương (gồm não và tuỷ sống) và võng mạc [5]. Virus này gây hoại tử các nơron thần kinh dẫn đến những biểu hiện bất thường như bơi không định hướng, chủ yếu theo hình trôn ốc hoặc lao thẳng, nhanh về phía trước [5]. NNV được xác định loài dựa vào trình tự của vùng biến đổi nằm trên phân tử RNA2 mã hóa protein vỏ của virus. Tại Việt Nam, virus này đã được xác định trên cá mú [1], trong nghiên cứu này, NNV được kiểm tra trên các mẫu cá chình có triệu chứng lâm sàng của bệnh hoại tử thần kinh. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu - Các mẫu cá chình có triệu chứng điển hình của bệnh hoại tử thần kinh 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu Thu não nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh. Một phần được sử dụng làm tiêu bản quan sát mô bệnh học, phần còn lại được dùng để phân lập virus. Nghiền các các mô này trong dung dịch muối cân bằng Hanks (HBSS) với tỉ lệ 1:10. Sau đó đem ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 15 phút, ở 4 o C. Dịch nổi được hút ra và lọc qua màng lọc 0,45µm. Dịch lọc được cất trong tủ lạnh cho đến khi dùng để phân lập virus trên tế bào. 2.2.2 Phương pháp kiểm tra mô bệnh học Mô mắt và não cá nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh được cố định trong dung dịch Davidson trong 24h. Sau đó, mẫu được làm mất nước bằng cồn 95% trong 4h, cồn 100% trong 4h, làm mềm bằng methylsalicilate trong 12-24h. Ngâm mẫu trong dung dịch paraffin nóng chảy ở nhiệt độ 65 o C trong 10h rồi đúc mẫu. Các mẫu sau khi đúc sẽ được cắt lát mỏng 5 μm. Nhuộm mẫu bằng dung dịch hematocyline và eosin, dán mẫu bằng bomcanada. Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học. 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào Dòng tế bào GS cung cấp bởi công ty Invitrogen được nuôi cấy trong môi trường Leibovitz L15 bổ sung 5-10% huyết thanh bào thai bê, 0.1% L-glutamine–penicillin – streptomycin (Invitrogen). Tế bào được nuôi trong chai nhựa có nút vặn dung tích 25cm 2 cho đến khi tế bào mọc thành một lớp rồi bổ sung dịch bệnh phẩm. Nuôi cấy virus ở nhiệt độ 25-30 0 C, hàng ngày bổ sung môi trường nuôi cấy tế bào và quan sát CPE. 2.2.4 Phương pháp xác định liều gây chết 50% tế bào (TCID 50 ) Tế bào GS được nuôi cấy để đạt mật độ khoảng 5x10 5 /ml trong đĩa 96 giếng rồi bổ sung 20 µl dịch virus được pha loãng ở các nồng độ khác nhau theo hệ số 10. Giữ đĩa nuôi cấy trong tủ ấm 37 0 C trong 1h để virus hấp phụ lên tế bào rồi tiếp tục bổ sung 80 µl môi trường Leibovit' L 15 5-10% huyết thanh bào thai. Nuôi cấy virus ở nhiệt độ 25-30 0 C, hàng ngày bổ sung môi trường nuôi cấy tế bào và quan sát CPE. TCID50 được xác định theo công thức của Reed và Muench (1938). 2.2.5 Phương pháp RT-PCR ARN tổng số của NNV được tách bằng kit Quick Prep Total RNA Isolation (Pharmacia biotech). ADN bổ sung được tạo thành từ phản ứng RT- PCR với bộ kit RT-PCR (Pharmacia biotech) và cặp mồi PCR F2 – R3 (invitrogen). Phản ứng được thực hiện với 30 chu kỳ theo các chu trình nhiệt: 90 0 C/5 phút, 55 0 C/45 giây, 72 0 C/1 phút. Sau đó, phản ứng được tiếp tục ở 72 0 C/10 phút. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kiểm tra mô bệnh học và phân lập virus trên các mẫu cá chình nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thu thập 30 mẫu cá chình ở Thừa Thiên- Huế có các biểu hiện: bơi bất thường theo hình trôn ốc hoặc bơi không định hướng, các triệu chứng lâm sàng này được nghi là do virus gây bệnh ở cơ quan thần kinh gây nên. Kết quả chẩn đoán mô bệnh học với mô não cá cho thấy: có 2 mẫu ký hiệu A-HUI01 và A-HUI17 có xuất hiện không bào và thể vùi ở não với mật độ dày đặc (hình 3.1). Sự có mặt của virus cũng như dạng gây tổn thương ở tổ chức thần kinh của 02 mẫu bệnh phẩm bước đầu có thể kết luận là cá mắc bệnh do virus hoại tử thần kinh. Các mẫu còn lại tuy không phát hiện không bào nhưng không nằm ngoài khả năng đang ở thời kỳ tiền nhiễm. Do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành phân lập virus từ các mẫu cá này bằng tế bào GS. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1. Hình 3.1 Hình ảnh kiểm tra mô bệnh học của não cá bệnh phẩm Hiện tượng virus gây bệnh trên tế bào nuôi cấy được đánh giá bằng chỉ số hiệu ứng huỷ hoại tế bào (CPE) (hình 3.2). Sau 6 ngày nuôi cấy, những dấu hiệu CPE bắt đầu xuất hiện ở các giếng tế bào gây nhiễm 04 mẫu A-HUI01, A-HUI06, A-HUI12 và A-HUI17. Hiện tượng quan sát được trên đĩa tế bào nuôi cấy là sự biến đổi hình dạng của một số tế bào từ dạng thuôn dài sang tròn, đồng thời có các đám tế bào tập trung, co cụm. Sang ngày thứ 7, hiệu ứng hủy hoại tế bào biểu hiện rõ hơn bởi sự xuất hiện những điểm tan bào, nhiều tế bào căng phồng, bong tróc khỏi bề mặt giếng nuôi cấy. Cho đến này thứ 9, diện tích bị tan bào ở hai mẫu A-HUI01 và A- HUI17 lên tới 95%, còn hai mẫu A-HUI06 và A-HUI12, diện tích tan bào khoảng 20% nhưng phần lớn các tế bào nuôi cấy bị biến dạng. Chuẩn độ TCID 50 /ml của các mẫu A-HUI01, A- HUI06, A-HUI12 và A-HUI17 lần lượt là 10 4,1 , 10 7.5 , 10 7.2 , 10 5.3 . Như vậy, 04 mẫu các cá chình ký hiệu A-HUI01, A-HUI06, A-HUI12 và A-HUI17 bị nhiễm virus, 26 mẫu bệnh phẩm còn lại không gây bệnh tích tế bào và có thể kết luận các mẫu này hoàn toàn không có Betanodavirus. Hình 3.2 Bệnh tích của tế bào GS sau khi gây nhiễm các mẫu cá bệnh 3.2 Xác định loài virus gây bệnh trên cá chình bằng phương pháp giải trình tự gen Cấu trúc genome của NNV gồm 02 phân tử RNA1 và RNA2, trong đó RNA1 mã hóa enzyme RNA polymerase có tính đặc trưng cho họ Betanodavirus. Còn RNA2 mã hóa glycoprotein cấu tạo vỏ virus mang tính đặc trưng cho từng loài NNV, có kích thước 1,410 base, trong đó chứa một vùng bảo thủ trình tự xác định 93% và một vùng biến đổi có trình tự xác định là 62%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định trình tự vùng biến đổi T4 của gen mã hóa protein vỏ của 04 chủng virus phân lập. Cặp mồi F2 (5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’) và R3 (5’-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3’) được sử dụng để tách dòng đoạn gen T4 kích thước khoảng 400bp ở 04 chủng virus ký hiệu A- HUI01, A-HUI06, A-HUI12 và A-HUI17. Các trình tự gen được xác định bởi hệ thống giải trình tự ABI 3110 PRISM (Perkin- Elmer) đồng thời tham khảo 03 trình tự gen sẵn có của GeneBank (bảng 3.1) để so sánh mối tương quan chéo về mặt di truyền của các chủng cho kết quả như sau: Bảng 3.1 Môi quan hệ chéo về tỷ lệ trình tự gen T4 của 04 chủng virus phân lập từ cá chình nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh Ghi chú: • A-HUI01, A-HUI06, A-HUI12 và A-HUI17: các chủng virus phân lập từ cá chình nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh • ENNV: European Nervous Necrosis Virus (Chi,và cộng sự, 2003) • GNNV: Grouper Nervous Necrosis Virus (Chi,và cộng sự, 2003) • JFNNV: Japanese Flounder Nervous Necrosis Virus (Nishizawa và cộng sự, 1995) Số liệu trong bảng 3.1 thể hiện trình tự của vùng biến đổi T4 trên RNA2 của 04 chủng A- HUI01, A-HUI06, A-HUI12 và A-HUI17 là tương đồng tuyệt đối, các trình tự này cũng có mối tương đồng cao (99%) đối với chủng virus gây bệnh trên cá chình Châu Âu (European Nervous Necrosis Virus) trong khi đó giá trị này thấp hơn (60-82%) khi so sánh với 02 chủng Grouper Nervous Necrosis Virus và Japanese Flounder Nervous Necrosis Virus. Bằng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) (IMurtagh, 1984) để xác định cây phân loài, 07 chủng so sánh được chia thành 03 nhóm, trong đó 04 chủng A-HUI01, A-HUI06, A-HUI12 và A-HUI17 phân lập được từ cá chình được xếp vào nhóm European Nervous Necrosis Virus (Hình 3.3). Hình 3.3 Cây phân loài dựa trên trình tự vùng T4 của các chủng NNV TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt (2011). Phát hiện, phân lập và xác định một số đặc tính của virus gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virus) trên cá mú tự nhiên tại vùng biển Quảng Ninh. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, ISSN 0866-7020, số 20, 2011. 2. Chi S.C., Shieh J.R., Lin,S.J. (2003). Dis. Aquat. Org. 55 (3), 221-228. 3. IMurtagh F (1984). Complexities of Hierarchic Clustering Algorithms: the state of the art. Computational Statistics Quarterly 1: 101–113. 4. Nishizawa T., Mori K., Furuhashi M., Nakai T., Furusawa I.Muroga K.J. (1995) Gen. Virol. 76 (PT 7), 1563-1569. 5. Renault, T., Haffner, P., Baudin, L.F., Breuil, G., Bonami, J.R., 1991. Mass mortalities in hatchery-reared sea bass Lates calcarifer larvae associated with the presence in the brain and retina of virus-like particles. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 11, 68–73. SUMMARY 04 strains of virus infected in neurvous central system were detected from 30 samples of Anguilla anguilla collected in Thua Thien- Hue province, these strains also can be innoculated to GS cells. By nucleotide sequencing method to identify sequence of variable region T4 belong to RNA2, all of four this trains were identical in European Nervous Necrosis Virus genotype. Keywords: Anguilla anguilla, European Nervous Necrosis Virus, genotype, variable gene T4 . XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH NERVOUS NECROSIS VIRUS TRÊN CÁ CHÌNH NUÔI TẠI THỪA THIÊN HUẾ Phạm Thị Tâm 1 , Phạm Công Hoạt 2 , Nguyễn. T4 trên RNA2 đã xác định được 04 chủng này thuộc nhóm viếu gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá chình Châu Âu (European Nervous Necrosis Virus ) Từ khóa: cá chình, vùng biến đổi T4, European Nervous. European Nervous Necrosis Virus 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh hoại tử thần kinh (Nervous necrosis disease) do Nervous Necrosis Virus- NNV là bệnh cấp tính, xuất hiện trên 22 loài cá, trong đó có các loài: mú