m BỘ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ L-CYSTIN TỪ TÓC, SỪNG (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHOÁ 200# - 2005) s ' ị i ^ - x / ') '■ - \ V u Cụ Giáo viên hướng dẫn ': Ths. ^Nguyễn Đình Luyện Ths. Nguyễn Thị Trinh Lan Sình viên thực hiện : Nghiêm Thanh Hoàng Nơi thực hiện : Bộ món Công nghiệp - Dược, phòng GMP Trường ĐH Dược HN Thời gianthực hiện : 3/2005 - 5/2005 ■■ ■' g ' HÀ NỔI, THÁNG 5 - 2é05 K . v ; ; -MÓ V - ý LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp “Khảo sát một số phương pháp điều chế L-cystin từ tóc, sừng”, được sự giúp đỡ hết sức tận tình của thầy Nguyễn Đình Luyện và cô Nguyễn Thị Trinh Lan, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp với mục đích và nội dung đề ra đúng thời gian qui định. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Đình Luyện và cô Nguyễn Thị Trinh Lan cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược, phòng thí nghiệm GMP - Trường Đại học Dược Hà nội. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các phòng ban, bộ môn của trường đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đc tài. Xin kính chúc các thầy cô luôn luôn mạnh khỏe và ngày càng thu được nhiều thành tích mới trong công tác nghiên cứu cũng như trong giảng dạy. Hà nội, ngày 27 tháng 5 năm 2005. Sinh viên Nghiêm Thanh Hoàng MỤC LỤC Trang ĐẶT VÂN ĐỂ 1 PHẨN 1 : TỔNG QUAN 2 1. ĐẠI CƯƠNG 2 1.1. Tổng quan về acid amin 2 1.1.1. Acid amin 2 1.1.2. Cấu tạo hóa học của acid amin 3 1.1.3. Phân loại acid amin 3 1.1.4. Tính chất của acid amin 4 1.2. Cấu trúc hóa học của nguyên liệu Keratin 4 1.2.1. Cấu dạng xoắn a 5 1.2.2. Cấu dạng gấp nếp p 6 1.3. Lịch sư nghiên cứu, tính chất lý hóa và ứng dụng của L-cvstin 7 1.3.1. Lịch sử nghiên cứu 7 1.3.2. Cấu tạo hoá học 9 1.3.3. Tính chất lý hóa 10 1.3.3.1. Lý tính 10 1.3.3.2. Hóa tính 11 1.3.4. Cách xác định L-cystin tạo thành 13 1.3.5. Tác dụng sinh học và ứng dụng 15 2. PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ 16 2.1. Điều chế theo Vogel 16 2.2. Điều chế theo Gortner và Hoffman 17 2.3. Các phương pháp điều chẻ khác 17 PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN c ứ u 20 1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 1.1. Nguyên liệu 20 1.2. Hoá chất và thuốc thử 20 1.3. Thiết bị và máy móc 21 1.4. Phương pháp nghiên cứu và cách xác định hàm lượng L-cystin tạo thành 21 2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 23 2.1. Khao sát sự ảnh hưởng của nồng độ acid tới hiệu suất của phản ứng thủy phân 23 2.2. Khảo sát anh hương của thời gian thủy phân tới hiệu suất của phản ứng thủy phân 26 2.3. Khảo sát và tối ưu hóa giai đoạn tách và tinh chế L-cystin 29 2.4. Kết quả phân tích phổ và biện giải các phổ 31 2.5. Kiểm nghiệm một sỏ tiêu chuẩn của L-cystin điều chê được theo tiêu chuẩn Dược điển Anh BP 1998 33 3. BÀN LUẬN 33 PH Ầ N 3 : K ẾT L U Ậ N V À Đ Ể X U Â T 35 TÀ I LIỆ U T H A M K H Ả O 37 PHỤ LỤC ĐẶT VÂN ĐỂ Cystin là một acid amin chiếm tỷ lệ đáng kể trong thành phần của tóc, sừng, móng thuộc nhóm acid amin có chứa lưu huỳnh [8]. Về mặt hóa học, Cystin được cấu tạo từ hai phân tử Cystein liên kết với nhau qua cầu nối disulfide. Trong tự nhiên Cystin thường tồn tại dưới dạng L- cystin với tên khoa học là : L(-)-3,3'-Dithiobis(2-aminopropanoic acid). Trong y học, người ta đã sử dụng L-cystin để điều trị một số bệnh da liễu như: rụng tóc, trứng cá, bệnh vảy nến Gần đây L-cystin còn được dùng trong các trường hợp tổn thương giác mạc, do tác dụng ức chế colagenaza làm biểu mô giác mạc nhanh thành sẹo. Ngoài ra, L-cystin còn được dùng để tổng hợp nhiều dẫn xuất có ứng dụng trong lâm sàng như : N-acetylcystcin, L-cystein, S-carboxy-Metylcystein Đc điều chế L-cystin người ta có thể đi từ con đường tổng hợp hóa học hoặc chiết từ dịch thủy phân protein [8J. Trcn thế giới cũng như ở Việt nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu điều chế L-cystin từ tóc, sừng, lông gà, lông cừu [11][15][19] Nhằm hoàn thiện quy trinh điều chế L-cystin, chúng tôi tiến hành đc tài nghicn cứu “ Khảo sát inột sô phương pháp điều chê L-cystin từ tóc, sừng “ với những inục tiêu sau : 1. Khảo sát 1 số điều kiện của phản ứng thủy phân ảnh hưởng đến hiệu suất tạo thành L-cystin từ nguyên liệu ban đầu là tóc. 2. Khao sát 1 số điều kiện của phản ứng thủy phân ảnh hưởng đến hiệu suất tạo thành L-cystin từ nguyên liệu ban đầu là sừng. 3. Nghiên cứu cải tiến các phương pháp tách và tinh chế L-cystin nhằm tiết kiệm năng lượng và phụ liệu. 4. Điều chế một lượng L-cystin đạt tiêu chuẩn cho quá trình tổng hợp Acetylcystein tiếp theo. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1. ĐẠI CƯƠNG 1.1. Tổng quan về acid amin 1.1.1. Acid amin Acid amin là sản phẩm thủy phân cuối cùng của pcptid và protein, là đơn vị cấu tạo xây dựng nên các phân tử peptid và protein. Một số acid amin có chức năng quan trọng như dẫn truyền thần kinh (glycin và acid glutamic) hay đóng vai trò trung gian trong sinh tổng hợp urê (acid argininosuccinic, citrulin). Người ta đã phân lập được trên 20 acid amin từ các dịch thủy phân protein thiên nhiên, các chất này đều thuộc loại a-aminoacid. [4] Thông thường người ta thu được các acid amin từ quá trình thủy phân protein với các tác nhân khác nhau như: acid, kiềm, enzym Để đánh giá chất lượng các chế phẩm acid amin, người ta tiến hành kiểm nghiệm bằng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp Kendan, phương pháp Ninhydrin, phương pháp sắc ký giấy, phương pháp sắc ký trao đổi ion Ớ nước ta hiện nay, đa số các chế phẩm acid amin phải nhập từ nước ngoài trong khi nhu cầu sử dụng các chế phẩm này làm thuốc lại rất lớn. Do vậy việc nghiên cứu về acid amin đóng một vai trò quan trọng và có nhiều ý nghĩa trong thực tế. 1.1.2. Cấu tạo hoá học của acid atnin Acid amin là những hợp chất acid hữu cơ mạch thẳng trong đó một hay hai nguyên tử hydro trên carbon a được thay thế bằng nhóm amin. Các acid amin trong tự nhiên đều là acid L- a amin. H lĩ 0 Acid a -amin 2 Tất cả các acid amin trừ glycin (R-H) đều có carbon a bất đối mang hoạt tính quang học làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực. Mặc dù trong tự nhiên có khoảng 300 acid amin nhưng cũng chỉ có 20 acid amin được tìm thấy trong protein. Người ta gọi đó là những acid amin chuẩn. [4] 1.1.3. Phân loại acid amỉn [4] • Theo mức độ phụ thuộc vào gốc R có trong phân tử acid amìn có thể chia các acid L- a amin thành 2 nhóm lớn: acid amin phân cực và acid amin không phân cực. Không phân cực Alanin, Isolcucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Tryptophan, Valin. Phân cực Acid aspartic, Acid glutamic, Arginin, Asparagin, Cystein, Glutamin, Glycin, Histidin, Lysin, Serin, Threonin, Tyrosin. • Mặt khác, theo cấu tạo hóa học của nhóm R: Các acid L- a amin được phân thành 7 nhóm : o Nhóm acid amin mạch thẳng: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin. o Nhóm acid amin chứa hydroxyl (OH): Serin, Threonin, Tyrosin. o Nhóm acid amin chứa lưu huỳnh: Cystein, Methionin. o Nhóm acid amin acid (chứa carboxyl hay amid): Acid aspartic, Asparagin, Acide Glutamic, Glutamin. o Nhóm acid amin kiềm (chứa nhóm basic): Arginin, Lysin, Histidin. 3 o Nhóm acid amin chứa nhân thơm: Histidin, Phenylalanin, Tyrosin, Trytophan. o Nhóm imin: Prolin. 1.1.4. Tính chất của acid amin • Tính tan và điểm chảy của acid amiti [4] Sự có mặt của nhiều nhóm ion hoá trên acid amin làm cho chúng dễ tan hơn trong dung môi phân cực như: nước, ethanol, không tan trong các dung môi không phân cực như: benzen, hexan hay ete. Điểm chảy của chúng thường cao (trên 200°C) do lực ion của mạng kết tinh. • Các phản ứng hoá học đặc trưng của acid amin Đó là các phán ứng đặc trưng cho các nhóm amin và carboxyl như phản ứng acetyl hoá, phản ứng formyl hóa hay este hóa: 1.2. Cấu trúc hóa học của nguyên liệu Keratin [2][4] Keratin là protein rắn chắc, không tan trong nước, chiếm tỷ lệ cao trong tóc, sừng, móng và lông của hầu hốt các loài động vật kể cả con người. o Phản ứng với Ninhydrin. o Phản ứng với Fluorescamin. o Phản ứng Biurê. o Phản ứng Foln xác định acid amin chứa lưu huỳnh (a) Ị ht \Ị tt* tutr \'1 //»< ỉutit 1'tilb (b) Hình l: ịa): cấu trúc tóc; (h): cấu tạo sợi tóc;(c): Keratin Thông thường Keratin có 2 cấu dạng chính đó là a-keratin và p-keratin, a-keratin thường được tìm thấy ở người và động vật có vú còn p-keratin thường có trong các loài chim và bò sát. Cấu trúc của ị3-keratin cứng rắn hơn so với a-keratin. Ngoài vai trò giúp ổn định cấu trúc tế bào Keratin còn có tác dụng bảo vệ cơ thể tránh được các tác nhân có hại từ môi trường bên ngoài. 1.2.1. Cấu dạng xoắn a Là cấu dạng điển hình cho cấu trúc của a-keratin. Khoảng cách một chu kỳ xoắn là 0,54 nm (gồm 3,5 gốc acid amin). Các nhóm R của nguyên tử carbon a đều chĩa ra ngoài trung tâm xoắn. Cấu dạng xoắn a (hình 2) có những đặc điểm quan trọng sau đây : • Cấu trúc bền vững nhờ có các liên kết Hydro tạo ra giữa H (thuộc nhóm NH của mỗi liên kết peptid) với o (của nhóm c o thuộc gốc acid amin thứ 4 trong chuỗi). Như vậy mỗi liên kết peptid đều góp phần tạo sự bền vững tối đa cho phân tử Keratin. • Liên kết Hydro nói trên làm giảm tính chất ưa nước của vùng xoắn a. • Là cấu dạng bền vững nhất của chuỗi polypeptid do có thể tạo xoắn a một cách tự nhicn mà không cần nhiều năng lượng. Hình 2: Cảu dạng xoắn a-keratin 1.2.2. Cấu dạng gấp nếp p Là điển hình cho cấu trúc của P-keratin. Nó có hình dáng giống như một tờ giấy gấp nếp và hầu như hoàn toàn duỗi thẳng hình zigzag (không bị cuộn lại như cấu dạng xoắn a). Trong cấu dạng p : 6 [...]... L- cystin có thể được điều chế bằng nhiều phương pháp khác nhau Người ta đã tổng hợp được L- cystin từ Serin hay Acid acrylic, hoặc có thể sinh tổng hợp từ các enzym, Tuy nhiên phương pháp thủy phân L- cystin từ protein vẫn đơn giản và có ý nghĩa thực tế hơn cả Qua điều tra nghiên cứu người ta thấy L- cystin có tỷ l cao trong Keratin của l ng, tóc, sừng, móng: [9] Tóc 14% Sừng 12, 1% L ng l n 14,4% Len... l ợng: % L- cystin = (Vtrắng - Vthử) X 2,403 -m Trong đó m (g) l khối l ợng L- cystin cân ban đầu Hàm l ợng L- cystin phải đạt từ 98,5- 101,0% C6H 1N20 4S2 tính theo 2 chế phẩm đã được l m khan 2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT : Trong phần này chúng tôi tiến hành khảo sát một vài yếu tố ảnh hưởng tới quy trình điều chế L- cystin nhằm hoàn thiện quy trình và tạo ra l ợng sản phẩm L- cystin. .. phân tích METTLER TOLEDO AB204S-Thụy Sỹ • Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S-ĐỨC • Phân cực kế A-KRUSS PlOOO-Đức • Máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp • Tủ sấy Memmert-Đức 1.4 .Phương pháp nghiên cứu và cách xác định hàm l ợng L- cystin tạo thành 1.4.1 Phương pháp nghiên cứu: Như đã trình bày ở phần tổng quan ,phương pháp nghiên cứu mà chúng tồi l a chọn để điều chế L- cystin l thủy phân tóc, sừng trong môi... nhiều l n hòa tan kết tủa Đối với L- cystin thô người ta hay dùng than hoạt, có the sử dụng than hoạt ở tỷ l 2-5% so với dung dịch và xử l như vậy từ 2-5 l n 1.3.2 Câu tạo hoá học 9 L- cystin có cấu trúc ổn định, l sản phẩm oxy hóa của L- cystein Lcystin được biết đến như một disulfide amino acid bởi nó được cấu thành từ 2 phân tử Cystcin nối với nhau bằng cầu nối disulfide L- cystin có thể tạo thành L- cystein... trường acid Phương pháp này được khái quát hóa dưới dạng sơ đồ như sau: * 21 Hình 6: Sơ dồ điều ch L- cystin 22 1.4.2 Phương pháp định l ợng L- cystỉn theo Dược điển A n h BP 1998: [ 13] Cách tiến hành: Trong bình nón có nút mài, hoà tan chính xác khoảng 0,100 g L- cystin vào hỗn hợp 2 ml NaOH loãng và 10 ml nước Thêm 10ml dung dịch KBr 200g/t, 50ml dung dịch K Br03 0,0167M và 15ml dung địch acid HC1 loãng... trường quá kiềm l m L- cystin bị phá hủy Hiệu suất chiết tách L- cystin thường đạt cao nhất (5%) khi sử dụng nguyên liệu l tóc, tác nhân thủy phân l acid clohydric 37% với tỷ l acid : tóc bằng 2:1 và thời gian thủy phân l 6h nếu đun sôi trực tiếp hoặc 12h nếu đun sôi cách thủy Tuy nhiên một số hạn chế của các phương pháp này còn chưa được giải * quyết như: sử dụng acid clohỵdric đặc l m dung môi thủy... dành cho người l n và trẻ em trên 8 tuổi l 1 viên nang 500mg X 2 l n mỗi ngày, nên dùng liên tục 2-3 Iháng hoặc 10-20 ngày mỗi tháng 2 PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ : 2.1 Phương pháp điều chê theo V o g el: • Nội dung phương pháp [19] Thuỷ phân Keratin (T óc, sừng) — ► HOOC-CH-CH2-S —S-CH2-CH-COOH NH2 0 NH2 L- cystin Cân 500g tóc cho vào bình cầu ba cổ, thêm vào 1000 ml hỗn hợp acid hydrochloric đặc và... đêm, l c và hòa tan trở l i trong acid clohydric 5% L c để loại hợp chất không tan, rửa tủa bằng 50ml HC1 5% (chia 3 l n) Khử màu toàn bộ dung dịch l c bằng cách đun nóng với 20g than hoạt và l c trong 1 giờ L c và rửa than bằng một ít HC1 5% Trung hòa dịch l c màu vàng nhạt bằng dung dịch NaOH 30% đến pH=5 Để kết tủa trong 34h, l c l y tủa, rửa tủa bằng nước nóng để loại Tyrosin Sản phẩm thu được l L- cystin, ... bằng dung dịch NaOH N/50, từ đó tính ra hàm l ợng Nitơ toàn phần có trong dịch thủy phán Phương pháp này đánh giá được hàm l ợng Nitơ toàn phần có trong chế phẩm Tuy nhiên phương pháp này khó phân biệt được l ợng Nitơ trong Lcystin và l ợng Nitơ có nguồn gốc khác ❖ Phương pháp N ỉtơform on (phương pháp Serensen) Serensen đã dựa vào tính chất hóa học của các acid amin để định l ợng Nitơ của acid amin... liệu L- cystin a: Tóc; b: Sừng; c: L ng Do đó nguyên liệu chủ yếu để chiết tách L- cystin l các Keratin Quá trình chiết L- cystin từ protein nhìn chung đều dựa trên sơ đồ nguyên l sau: Thủy phân |/ (H®, OH ®enzym) pH=5 Keratin -► Acidamin - ► L -cystin t° v Để thủy phân Keratin người ta có thể dùng các tác nhân acid hoặc kiềm Nhưng thực tế tác nhân acid phù hợp hơn vì kiềm phá hủy L- cystin . thiện quy trinh điều chế L-cystin, chúng tôi tiến hành đc tài nghicn cứu “ Khảo sát inột sô phương pháp điều chê L-cystin từ tóc, sừng “ với những inục tiêu sau : 1. Khảo sát 1 số điều kiện của. THÁNG 5 - 2é05 K . v ; ; -MÓ V - ý LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp Khảo sát một số phương pháp điều chế L-cystin từ tóc, sừng , được sự giúp đỡ hết sức tận tình của thầy. xác định L-cystin tạo thành 13 1.3.5. Tác dụng sinh học và ứng dụng 15 2. PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ 16 2.1. Điều chế theo Vogel 16 2.2. Điều chế theo Gortner và Hoffman 17 2.3. Các phương pháp điều chẻ