Đang tải... (xem toàn văn)
Để diệt muỗi, một biện pháp phổ biến là dùng thuốc diệt muỗi hóa học, tuy nhiên, tính kháng lại thuốc hóa học của muỗi ngày càng tăng. Hơn nữa việc sử dụng thuốc hóa học còn gây độc hại cho người, động vật và gây ô nhiễm môi trường, không diệt trừ được tận gốc mầm bệnh. Do vậy một biện pháp an toàn và hiệu quả nhất để phòng và chống các bệnh do muỗi truyền là sử dụng chế phẩm vi sinh vật để diệt muỗi (bọ gậy) từ vi khuẩn có tên Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti), và bacillus sphaericus (Bs) được sản xuất từ các chủng có hoạt tính diệt muỗi cao được phân lập tại những vùng có muỗi cư trú
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học tơi Các số liệu kết nêu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Kiều Oanh LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khố luận tốt nghiệp tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giúp đỡ Lời đầu tiên, xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngơ Đình Bính phụ trách phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành khố luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn KS Nguyễn Thị Luy, toàn thể cán phòng Di truyền Vi sinh vật, tận tình bảo giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công Nghệ Nông - Lâm Thực phẩm trường Đại học Thành Tây tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè giúp đỡ, động viên suốt trình học tập hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ nhiệt tình q báu Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Kiều Oanh DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ae Aedes B thuringiensis Bacillus thuringiensis Bt Bacillus thuringiensis Bti Bacillus thuringiensis subsp Israelensis Bp base pair CFU Colony forming unit DNA Acid deoxyribonucleic dNTP Deoxy Ribonucleotid Triphosphat kDa Kilo Dalton LB Môi trường Lauria Betani MPA Môi trường Meat Pepton Agar PCR Polymerase Chains Reaction TAE Tris - Acetate EDTA MỞ ĐẦU Là nước nằm khu vực có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, lại có vị trí địa lý thuận lợi, Việt Nam thiên nhiên ưu đãi ban tặng hệ sinh thái đa dạng phong phú Việt Nam nơi để nhiều lồi trùng có hại phát triển Một số muỗi, vector truyền bệnh dịch nguy hiểm sốt rét, sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản, sùi chân voi, giun chỉ, sốt vàng da… Hiện có khoảng 2,37 tỉ người giới sống vùng sốt rét Hàng năm có khoảng 500 triệu người mắc bệnh sốt rét, làm chết hàng triệu người, hàng triệu người bị bệnh sốt xuất huyết bệnh khác [34, 35] Để diệt muỗi, biện pháp phổ biến dùng thuốc diệt muỗi hóa học, nhiên, tính kháng lại thuốc hóa học muỗi ngày tăng Hơn việc sử dụng thuốc hóa học cịn gây độc hại cho người, động vật gây ô nhiễm môi trường, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh Do biện pháp an toàn hiệu để phòng chống bệnh muỗi truyền sử dụng chế phẩm vi sinh vật để diệt muỗi (bọ gậy) từ vi khuẩn có tên Bacillus thuringiensis subsp israelensis (Bti), bacillus sphaericus (Bs) sản xuất từ chủng có hoạt tính diệt muỗi cao phân lập vùng có muỗi cư trú [16] Ở Việt Nam, nhiều phịng thí nghiệm nghiên cứu sản xuất ứng dụng chế phẩm sinh học Bt trừ sâu hại trồng nông lâm nghiệp thu kết định Tuy nhiên, chế phẩm Bt diệt ấu trùng muỗi chưa quan tâm phát triển Để sản xuất chế phẩm có hoạt tính mạnh phù hợp với điều kiện sinh thái Việt Nam, cần thiết phải nghiên cứu, tuyển chọn chủng Bt có hoạt tính cao Việt Nam Thái Bình là một tỉnh ven biển ở đồng bằng sông Hồng, miền Bắc Việt Nam, có diện tích tự nhiên là 1.542 km Địa hình khá bằng phẳng với độ dốc thấp 1%, độ cao phổ biến từ 1-2 m mực nước biển, thấp dần từ Bắc xuống Đông Nam, Thái Bình nằm vùng khí hậu cận nhiệt đới: mùa hè nóng ẩm, mưa nhiều từ tháng đến tháng 9; mùa đông khô lạnh từ tháng 11 năm trước đến tháng năm sau; tháng 10 đến tháng là mùa thu và mùa xuân Là một tỉnh đồng bằng không có đồi núi, Thái Bình lại có 54 km bờ biển trải dài suốt huyện Thái Thụy và Tiền Hải, nơi có hàng ngàn rừng ngập mặn bao bọc, tạo thành bức tường xanh vững chắc mang lại hiệu quả cao và phòng chống thiên tai, bảo vệ môi trường Vùng đất ngập mặn ven biển Thái Bình là một những khu dự trữ sinh quyển thế giới tạo sự đa dạng và phong phú về động vật, thực vật cũng các loài vi sinh vật đó có vi khuẩn Bacillus thuringiensis Việc tìm kiếm, nghiên cứu hoạt tính diệt m̃i của các chủng Bt phân lập ở Việt Nam nói chung và ở vùng đất ngập mặn tỉnh Thái Bình nói riêng là cần thiết nhằm tìm những chủng mang gene tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ cho sản xuất thuốc diệt muỗi sinh học Xuất phát từ mục đích này, chúng tiến hành nghiên cứu đề tài: “Sàng lọc một số chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi phân lập từ đất rừng ngập mặn tỉnh Thái Bình” Mục tiêu đề tài: Sàng lọc được chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi tốt nhất để sản xuất thuốc diệt muỗi sinh học Để đạt mục tiêu đề tài cần cần thực nội dung sau: Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất rừng ngập mặn thuộc tỉnh Thái Bình Thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi của các chủng Bt đã được phân lập Phân loại Bt bằng phương pháp huyết Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi bằng phương pháp sinh học phân tử Chọn chủng Bt có hoạt tính diệt bọ gậy tốt nhất để thành lập công thức chế phẩm nhằm đưa vào ứng dụng sản xuất chế phẩm Bt diệt ấu trùng muỗi PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis Trên thế giới Trong trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) coi vi khuẩn nghiên cứu nhiều số tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng [1] Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis bắt nguồn từ năm kỉ 20 Từ năm 1870 Loius Pasteur phát thấy lồi vi khuẩn có khả gây bệnh cho tằm ông đặt tên Bacillus bombyces Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Shigetane Ishiwata nghiên cứu bệnh tằm dâu, ông phát nguyên nhân gây bệnh cho tằm loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn Bacillus sotto Đến mười năm sau (1911), loài vi khuẩn nhà khoa học người Đức E Berliner phân lập từ xác ấu trùng bướm Địa Trung Hải, Anagasta kuhniella ơng có mơ tả lồi vi khuẩn đất, tế bào hình que, có khả sinh bào tử Đến năm 1915, vi khuẩn thức mang tên Bacillus thuringiensis phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringen Đức Về sau chủng bị thất lạc Mattes cộng phân lập lại từ A.kuhniella vào năm 1927 Chế phẩm Bt sử dụng lần vào năm 1930 để kiểm sốt lồi trùng hại có tên Angasta kuehnella, loài sâu đục thân Châu Âu Chế phẩm thương mại tung thị trường vào năm 1938 để diệt lồi trùng hại mùa màng Pháp Năm 1953, Hannay Fitzjame phát thể vùi cơng bố tinh thể có chất protein Năm 1956, Angus chứng minh hoạt tính diệt sâu tinh thể độc tách từ tế bào bào tử Năm 1962, de Barjac Bonnefoi đưa phương pháp phân loại cho chủng Bt Bacillus sphaericus (Bs) phương pháp huyết Năm 1977, Goldberg Margarit phát Bacillus thuringiensis subsp isralensis (Bti) Israel, có khả diệt ấu trùng muỗi ruồi thuộc hai cánh (Diptera) [1] Năm 1981, gene mã hóa protein tinh thể diệt sâu tách dịng đọc trình tự Từ lượng lớn gen tách dòng nghiên cứu đặc tính chúng Trong năm 1987–1992, người ta tiếp tục nghiên cứu phát thấy Bt có khả diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc Trematoda diệt kiến thuộc Hymenoptera Ở Việt Nam Việt nam có nhiều cơng trình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis Trong 35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringensis (Bt) nhà khoa học Việt Nam đạt nhiều thành tựu nghiên cứu, sản xuất đưa kết nghiên cứu ứng dụng vào đời sống, góp phần giảm thiệt hại kinh tế cho ngành nông, lâm nghiệp Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu Bt ứng dụng Viện bảo vệ thực vật năm 1971 Năm 1973, Nguyễn Cơng Bình cộng đã tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bt tại Viện Sinh vật với môi trường đặc với chủng giống có nguồn gốc từ Trung Quốc thuộc dưới loài Bt subsp thuringiensis, Bt subsp kurstaki Các chế phẩm này được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã đạt được những kết quả đáng quan tâm Năm 1982, Viện Công nghiệp Thực phẩm sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men 5m3 Từ năm 1984-1993, việc sản xuất chế phẩm Bt giảm sút chế phẩm Bt sản xuất có chất lượng khơng cao tốc độ tiêu thụ giảm Trong khoảng 10 năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt mở rộng Hiện có nhiều quan sâu vào nghiên cứu Bt như: Viện Công nghệ Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Công nghiệp Thực phẩm Phòng Di truyền vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học thực hiện đã phân lập, sàng lọc và lựa chọn được một số chủng Bti và Bs ở Việt Nam có hoạt lực diệt muỗi cao, đã tách được các gen mã hóa protein độc tố diệt muỗi cry4 và cry2, đã sản xuất được một lượng chế phẩm để thử nghiệm phòng thí nghiệm và bước đầu đưa áp dụng thực tế Kết quả cho thấy hiệu quả diệt ấu trùng muỗi sốt rét (Anopheles minimus), muỗi vằn truyền bệnh sốt xuất huyết (Aedes aegypti), muỗi truyền bệnh viêm não Nhật Bản, bệnh sùi chân voi, giun chỉ (Culex quinquefasciatus, Culex pipiens) đạt 95,0 – 100% sau giờ xử lý phòng thí nghiệm Trong tự nhiên (ao, hồ, sông, ngòi) đạt tỷ lệ chết trung bình từ 85,0 – 93,6% sau ngày xử lý [2] Dự án “Sản xuất thử chế phẩm diệt muỗi” năm 2007 Viện Khoa học Việt Nam cấp quản lí đã sản xuất được chế phẩm diệt muỗi dạng dịch thể và đặc biệt là dạng bánh tan chậm Chế phẩm dạng bánh lõi ngô tan chậm đã cho hiệu quả diệt bọ gậy rất cao (100% hiện trường) và hiệu quả diệt bọ gậy kéo dài sau tháng đạt từ 90–100% Bánh lõi ngô diệt bọ gậy là chế phẩm đã được Cục Sáng chế phát minh chấp nhận đăng công báo [37] 1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1 Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, ngành Firmicutes Nhóm gồm 20 lồi khác nhau, ngồi Bt cịn có vi khuẩn B suBtilis, B.cereus (vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy), vi khuẩn B anthracis (vi khuẩn gây bệnh than) Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus thường coi vi khuẩn đất Chúng sống môi trường đất, côn trùng bề mặt tiếp xúc với côn trùng [22] Bacillus thuringiensis hình que, có khả di động nhờ có tiêm mao mọc bề mặt tế bào, bắt màu Gram dương Vi khuẩn Bt hơ hấp hiếu khí kị khí khơng bắt buộc Mỗi tế bào Bt có khả sinh bào tử tinh thể độc có chất protein có khả diệt trùng Kích thước tế bào khoảng 0,81,4µm x 2,5-10µm Đặc điểm chung bào tử hình oval, kích thước 0,5 - 1,2µm x 1,5 - 2,6 µm, q trình hình thành bào tử khơng làm thay đổi hình dạng tế bào Một đặc điểm quan trọng trình hình thành bào tử hầu hết chủng Bacillus thuringiensis tổng hợp protein tinh thể Protein tinh thể chủng khác có hình dạng, kích thước số lượng khác nhau, nhiên chúng mang đặc điểm chung có khả gây độc nhiều lồi trùng Khi tế bào sinh dưỡng, tinh thể thường nằm kề với bào tử, tế bào tan tinh thể bào tử thoát Khi nhuộm tế bào Bt thuốc nhuộm fucshin quan sát kính hiển vi thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm cịn bào tử bắt màu hồng nhạt (hình 1.1) [1, 5, 6] Tinh Thể Bào tử Tế bào Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Bacillus thuringiensis kính hiển vi độ phóng đại 100X Trong mơi trường lỏng Bacillus thuringiensis có khả chuyển động, khả có nhờ lơng roi (flagellar) bề mặt tế bào có kích thước lớn 0,9 µm B thuringiensis xem loài vi khuẩn địa tồn nhiều môi trường khác Meadows phân chia ổ sinh thái phổ biến B thuringiensis môi trường tự nhiên côn trùng, thực vật đất [13] 1.2.2 Phân biệt Bt với các loài khác nhóm Bacillus cereus Việc sinh protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, nhiên đó chỉ là tiêu chuẩn cho mục đích phân loại Các loài thuộc nhóm B cereus gồm B cereus, B thuringiensis, B anthracis, B mycoides, B megaterium, mới đã phát hiện thêm hai loài là B weihenstephanensis và B peseudomycoides [39] Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài nhóm chi Bacillus Đặc điểm Nhuộm Gram Phản ứng catalase Khả chuyển động Phản ứng khử nitrate Bc +(a) + +/-(b) + Bt + + +/+/ Phân hủy tyrosine + + Kháng lysozyme + + Phản ứng với lòng đỏ trứng + + Lên men glucose kị khí + + Phản ứng P-V + + Sinh axit từ mannitol Làm tan huyết + + Sinh protein tinh thể + Chú thích: a +: 90-100% số chủng phản ứng dương tính b +/-: 50-50% số chủng phản ứng dương tính c -: 90-100% số chủng phản ứng âm tính d -: hầu hết các chủng phản ứng âm tính Bmy + + -© + Ba + + + Bme + + +/-(d) +/-(d) +/+ + + + + + + + + (d) + Bc: Bacillus cereus Bt: Bacillus thuringiensis Bmy: Bacillus mycoides Ba: Bacillus anthracis Bme: Bacillus megaterium 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa B thuringiensis khơng lên men sinh axit mơi trường chứa arrabinoza, xylose, manitol, tạo axit môi trường chứa glucose Có khả thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển môi trường có chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH=5,7, có phản ứng với lịng đỏ trứng gà Khơng có khả khử amin phenilalamin, không sử dụng axit citric, không khử muối sunphat [36] B thuringiensis có khả sinh trưởng phát triển nhiệt độ dao động từ 15-45oC Nhiệt độ tối ưu 28-30oC B thuringiensis không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho phát triển Bt pH=7 Bt có khả oxy hoá hydrocacbon đến axit hữu dioxit cacbon theo chu trình Embden- Meyerhoff- Panas [1, 36] phân lập STT Ký hiệu chủng Gene cry4A Gene cry4B TB1.3 - + TB1.4 - + TB1.5 + + TB3.7 - + TB6.5 - + TB6.8 - + TB33.1 + + TB33.4 - + TB33.6 - + 10 TB38.5 - + 11 TB39.5 - + 12 Chủng chuẩn (4Q1) + + Trong số 11 chủng phân lập có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi cao, tiến hành khuyếch đại gene cry4A cry4B chúng tơi thu được: • chủng chứa gene cry4A cry4B chiếm 18,2% • chủng mang gene cry4B chiếm 81,8 % Các chủng tách DNA chạy PCR, sản phẩm PCR tiến hành điện di gel 1% agarose, kết trình bày ở4hình 3.5, hình 3.6 1000 bp 1035 bp Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene cry4A Giếng Marker Giếng ĐC (+) Giếng Chủng TB 1.5 Giếng Chủng TB 33.1 321 bp 300 bp Hình 3: Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene cry4B Giếng Marker Giếng TB1.5 Giếng TB33.1 Giếng ĐC (+) Giếng TB38.5 Từ kết cho thấy chủng TB1.5 TB33.1 mang gen cry4A cry4B có hoạt lực diệt ấu trùng muỗi tốt nhất, sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo: tìm hiểu khả ứng dụng sản xuất nghiên cứu thành lập công thức chế phẩm 3.6 Xác định LC50 số chủng Bt Kết nồng độ gây chết nửa (LC50) xác định theo phân tích probit chủng 4Q1, TB33.1 TB1.5 sau: 3,09; 4,3 1,48µg/ml Từ kết cho thấy chủng TB1.5 có hoạt tính cao gấp lần so với chủng chuẩn (4Q1) cao gấp lần so với chủng TB33.1 Như chủng TB1.5 có nguồn gốc từ rừng ngập mặn Thái Thụy–Thái Bình chọn để đưa vào sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi 3.7 Khả ứng dụng chế phẩm Lựa chọn mơi trường thích hợp cho sản xuất chế phẩm từ chủng TB1.5 Sinh khối (CFU) sau ngày lên men với loại môi trường khác trình bày bảng 3.5: Bảng 3.5 Lựa chọn mơi trường thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng TB1.5 Môi trường Số lượng bào tử/ml Mơi trường 15 × 107 Mơi trường 20,5 × 107 Môi trường × 107 Từ Bảng 3.5 cho thấy môi trường số (môi trường lên men) đạt kết tốt cho nuôi cấy chủng TB1.5 Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm dạng bánh tan chậm: Phối trộn môi trường: Môi trường nuôi cấy gồm có: 30g bột đậu tương, 10g glucose, 1,2g pepton, 1g KH2PO4, 1g K2HPO4, 0,5g MgSO4, 2g NaCl, 2g (NH4)2SO4, 1l nước cất, 1ml vi lượng, pH = Đậu tương hòa vào với nước lạnh, đun sôi, khuấy phút đem lọc qua rây lọc bỏ cặn, bổ sung thêm thành phần khác khử trùng Phối trộn môi trường Gia nhiệt nước Khử trùng (1210, 30 phút) Làm nguội Nhân giống Cấp giống Lên men (280C, 72 giờ) Li tâm kết tủa (4000 v/p, 15 phút) Thu cặn Trộn ngâm bão hòa với cặn kết tủa Lõi ngơ bọt xốp Sấy khơ 450C Đóng gói Hình 3.7 Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất thuốc sinh học trừ muỗi dạng bánh tan chậm Gia nhiệt khử trùng: môi trường khử trùng nước bão hịa có nhiệt độ 1210C, áp suất atmosphere, thời gian 30 phút Làm nguội: môi trường làm nguội cách để nguội tự nhiên dùng nước làm mát đến nhiệt độ thường Chuẩn bị giống: chủng giống cấy từ ống thạch nghiêng chứa mơi trường MPA vào bình tam chứa môi trường LB, lắc qua đêm 200 v/p 280C Cấp giống: tỷ lệ cấp giống 5% điều kiện vơ trùng Ni cấy: chế độ ni cấy trì pH 7-7,5, nhiệt độ 28 0C, trì độ hịa tan oxy 90%, kết thúc nuôi cấy sau 72 sau tinh thể giải phóng khoảng 95% Ly tâm kết tủa: + Kết tủa: sinh khối dịch nuôi cấy kết tủa cách bổ sung chất trợ lắng diatomite 0,5%, ly tâm 3000-4000 v/ph, bỏ dịch thêm lượng thể tích cặn thu dung dịch lactose 4-6%, hòa tan cặn 30 phút cách khuấy đều, thêm gấp lần thể tích acetone, tiếp tục khuấy liên tục cho hồn tồn đồng nhất, sau để lắng 10 phút để kết tủa lọc qua màng lọc, bỏ dịch Rửa cặn lượng nhỏ acetone để khô nhiệt độ phịng dùng máy sấy hút chân khơng + Ly tâm: để thu hồi chế phẩm phương pháp ly tâm, chế độ ly tâm phù hợp cho dịch sau lên men 4000 v/p thời gian 15 phút, thu cặn bỏ dịch Chất mang: - Lõi ngô cắt trịn dày 2-3 mm Khử trùng khơ 1000C - Bọt xốp cắt miếng hình khối có kích thước 3×2×2 cm Ngâm dung dịch HNO3 1M xử lý nhiệt độ 90 – 100 0C 30 phút Sau đó, rửa lại nước ngâm acetone 24 giờ, vớt rửa kỹ lại nước sạch, mang phơi khô Khử trùng 1000C Trộn ngâm bão hòa với cặn kết tủa: Cặn kết tủa hòa tan với 1,5 ml nước khử (cho 10 bánh lõi ngô) 3ml nước khử (cho 10 miếng bọt xốp) Sau đó, trộn bánh lõi ngô bọt xốp cắt với dịch đậm đặc sinh khối bào tử tinh thể độc tố với tỷ lệ 150µl dịch sinh khối/1 bánh lõi ngơ 300µl dịch sinh khối/1 miếng bọt xốp, thời gian cần thiết để xảy thấm hút bão hịa vào lõi ngơ bọt xốp Sấy khô: Sản phẩm sấy khô nhiệt độ 45 0C, có thổi thơng gió đến khơ Đóng gói: Sản phẩm đóng gói bao nilon dán nhãn, bảo quản nơi mát, tránh ánh sáng trực tiếp a b Hình 3.8 Hình ảnh chế phẩm TB1.5 chất mang a Chế phẩm bọt xốp sau ngâm bão hòa b Chế phẩm lõi ngơ sau ngâm bão hịa Kết thành lập công thức chế phẩm Để thành lập công thức chế phẩm phù hợp với điều kiện địa lý sinh thái Việt Nam, yêu cầu chế phẩm phải dạng tan chậm nước có hiệu diệt bọ gậy kéo dài Theo sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất thuốc sinh học diệt muỗi (Hình 3.7) Các cơng thức thành lập gồm thành phần nêu bảng 3.6 Bảng 3.6 Thành phần công thức chế phẩm dạng bánh tan chậm Công thức Thành phần Ưu điểm Hạn chế CT1 Lõi ngô Thành phần cellulose, Khả thấm hút nguyên liệu sẵn có, rẻ chế phẩm chậm tiền, chế phẩm tan chậm nước, lõi ngô phân hủy sau thời gian nên an tồn với mơi trường CT2 Bọt xốp Thành phần poliuretano, khả thấm hút chế phẩm nhanh Ngun liệu sẵn có, đắt tiền, bọt xốp tồn lưu gây ảnh hưởng xấu đến môi trường Hoạt lực diệt bọ gậy muỗi Culex quinquefasciatus công thức nêu bảng 3.7 Bảng 3.7 Hoạt lực diệt bọ gậy muỗi Culex quinquefasciatus công thức chế phẩm dạng bánh Công thức Tỷ lệ chết (%) Thí nghiệm 12 24 76,6 86,6 96,6 CT2 Đối chứng CT1 80 90 100 Nước 0 Từ bảng 3.7 cho thấy công thức chế phẩm làm từ bọt xốp cho kết cao chế phẩm làm từ lõi ngô Tuy nhiên từ bảng phân tích ưu nhược điểm loại cơng thức (Bảng 3.6), lựa chọn sử dụng lõi ngô làm nguyên liệu cho sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi Tuy nhiên trường hợp phát sinh thành dịch, số lượng ổ muỗi nhiều, dùng chế phẩm làm từ bọt xốp để dập dịch Sau thu hồi bọt xốp mặt nước Thành phần chế phẩm bánh lõi ngô tan chậm: lõi ngô, vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp israelensis (TB1.5) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ 39 mẫu đất thu thập từ đất rừng ngập mặn tỉnh Thái Bình, phân lập 38 chủng Bt để bổ sung vào tập đoàn chủng giống Bt Viện Công nghệ sinh học Đã phân loại 11 chủng thuộc loài Bacillus thuringiensis subsp israelensis chiếm 29% tổng số chủng phân lập Đã tuyển chọn 11 chủng có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus cao với tỷ lệ chết đạt 100% sau 12 giờ, chiếm tỷ lệ 29% số chủng Bt phân lập Bằng phương pháp PCR xác định chủng Bt mang đoạn gene cry4A cry4B, chủng Bt mang đoạn gene cry4B Đã tuyển chọn chủng TB1.5 có hoạt tính cao với giá trị LC 50 1,48 µg/ml cao gấp lần so với chủng ĐC (+) (4Q1) Đã tìm mơi trường lên men thích hợp cho chủng vi khuẩn TB1.5 sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp protein tinh thể diệt côn trùng: môi trường dinh dưỡng số sử dụng 30 g bột đậu tương, 10 g glucose muối vi lượng Đã thành lập công thức chế phẩm dạng bánh lõi ngơ có kết thử nghiệm tối ưu phịng thí nghiệm KIẾN NGHỊ Từ kết cho thấy chủng TB1.5 có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus cao Từ thành lập cơng thức chế phẩm diệt ấu trùng muỗi tối ưu Tuy nhiên kết nghiên cứu hoạt tính phịng thí nghiệm Bởi cần nghiên cứu đánh giá hiệu loại muỗi khác (Anophenles, Aedes…) nghiên cứu thời gian tồn lưu chế phẩm mơi trường, từ xây dựng cơng thức chế phẩm tối ưu nhằm ứng dụng rộng rãi thực địa TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Ngơ Đình Bính (2005), Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Ngơ Đình Bính ( 2007), Báo cáo tổng kết dự án SXTN cấp viện KHCNVN “Sản xuất thử nghiệm ứng dụng chế phẩm sinh học diệt muỗi” (GIAI ĐOẠN 1) Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis Kỷ yếu 2001-2002 Viện Công nghệ Sinh học, trang 396-302 5 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Phạm Minh Hương, Vi Thị Đoan Chính (1995), Nghiên cứu bảo quản lâu dài chủng giống vi sinh vật Kỷ yếu NXB Khoa học kĩ thuật, trang 378383 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học NXB giáo dục Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình trùng học nơng nghiệp tập 2, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 122-167 Vũ Thị Phan (1996), Dịch tễ học bệnh sốt rét phòng chống sốt rét Việt Nam, Hà Nội, NXB Y học, 295 tr Tài liệu Tiếng Anh Balaraman, K., Balasubramanian, M & Manonmani L.M (1983), “Bacillus thuringiensis H-14 (VCRC B-17) formulation as mosquito larvicide”, Indian Journal of Medical Research, 77, 33-37 Barjac, H de (1978), “A new subspecies of Bacillus thuringiensis very toxic for mosquitoes: Bacillus thuringiensis var israelensis serotype 14”, C R Acad Sci., 286, 797-800 10 Becker, N & Margalit, J (1993), “Use of Bacillus thuringiensis israelensis against mosquitoes and blackflies”, In Bacillus thuringiensis, an EnvironmentalBiopesticide: Theory and Practice, 147170 11 Becker, N (1992), “Community participation in the operational use of microbial control agents in mosquito control programs”, Bulletin of the Society for Vector Ecology, 17, 114-118 12 Ben-Dov E, M Einav, N Peleg, S Boussiba and A Zaritsky (1996), “Restriction map of the 125 kilobase plasmid of Bacillus thuringiensis subsp israelensis carrying the genes that encode deltaendotoxins active against mosquito larvae”, Appl Environ Microbiol., 62, 3140-3145 13 Bernhard, K., P Jarrett, M Meadows, J Butt, D J Ellis, G M Roberts, S Pauli, P Rodgers, and H D Burges (1997), Natural isolates of Bacillus thuringiensis: worldwide distribution, characterization, and activity against insect pests J Invertebr, Pathol 70:59-68 14 16 17 20 21 22 Bietlot, H P., J P Schernthaner, R E Milne, F R Clairmont, R S Bhella, and H Kaplan (1993), Evidence that the CryIA crystal protein from 15 Bradford MM (1976), A rapid and sensitive method for the quantilation of microgram quanties of protein ulilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem J 72:248-254 Bravo, A (1997), Phylogenetic relationships of Bacillus thurigiensis δendotoxin family proteins anh their functional domains, J Bacteriol., 179, 2793-2801 Burges H D (2001), Bacillus thuringiensis in Pest Control, Pesticide Outlook P 90- 98 18 Carlson, C R., and A.-B Kolstø (1993), “A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome”, J Bacteriol., 175, 1053-1060 19 Clarke, G R (1994), “Bacillus thuringiensis var israelensis in mosquito control”, Proceedings of the 1st Brisbane Symposium Biopesticides: opportunities for Australian Industry, 87-90 Crickmore, N., Bone, E.J., Williams, J.A., Ellar, D.J (1995), “Contribution of the individual components of the delta-endotoxin crystal to the mosquitocidal activity of Bacillus thuringiensis subsp israelensis”, FEMS Microbiol Lett., 131, 249–25 Crickmore, N., D R Zeigler, J Feitelson, E Schnepf, J Van Rie, D Lereclus, J Baum, and D H Dean (1998), Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins Microbiol, Mol Biol Rev 62:807-813 Eugene W Nester, linda S Thomashow, Matthew Metz and Milton Gordon (2002), 100 years of bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with wide spectrum of activities against lepidopteran insects”, Proc Natl Acad Sci USA 93, 5389-5394 23 Federici, B A (1995), “The future of microbial insecticides as vector control agents”, Vector control without chemicals: has it future? A Sixteenth annual meeting of American Mosquito Control Association, 11(2), 260-268 24 Georghiou, G P & Wirth, M C (1997), “Influence of exposure to single versus multiple toxins of Bacillus thuringiensis subsp 27 28 29 30 31 32 israelensis on development of resistance in the mosquito Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae)”, Applied and Environmental Microbiology, 63, 1095-1101 25 Goldberg, I H & Margalit, J (1977), “A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiclata, Culex univattatus, Aedes aegypti and Culex pipien”, Mosquito News 37, 355-358 26 Grochulski, P., L Masson, S Borisova, M Pusztai-Carey, J.-L Schwartz, R Brousseau, and M Cygler (1995), “Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation”, J Mol Biol., 254, 447464http://mmbr.asm.org/cgi/external_ref? access_num=7490762&link_type=MED J Carroll, J.Li and D.J.Ellar, 1989 Crystal Proteolytic procesing of a Celeoptera- specific δ- endotoxin producted by Bacillus thuringiensis var tenebrionis Biochem J.99 :261 Kalman, S., K L Kiehne, N Cooper, M S Reynoso, and T Yamamoto (1995), Enhanced production of insecticidal proteins in Bacillus thuringiensis strains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes, Appl Environ Microbiol 61:3063-3068 Kronstad, J W., and H R Whiteley (1986), Three classes of homologous Bacillus thuringiensis crystal-protein genes, Gene 43:29-40 Li, J., J Carroll, and D J Ellar (1991), Crystal structure of insecticidal δ- endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 Å resolution, Nature 353:815-821 Lecadet M-M, Frachon E., Cosmao Dumanoir V., Ripouteau H., Hamon S., Lauren P., Thiery I (1999), “Updating the H-antigen classification of Bacillus thuringiensis” Journal of Applied Microbiology, 86, 660-672 Lereclus, D., G Menou, and M.-M Lecadet (1983), Isolation of a DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faecalis plasmid pAM 1, Mol Gen Genet.191:307-313 33 Mulla, M S (1990), “Activity, field efficacy, and use of Bacillus thuringiensis israelensis against mosquitoes”, Bacterial Control of Mosquitoes and Black Flies, 134-160 34 Mulla, M S., Federici, B A & Darwazeh, H A (1980), “Effectiveness of the bacterial pathogen Bacillus thuringiensis serotype H-14 against mosquito larvae”, Forty Eighth Annual Conference of the California Mosquito and Vector Control Association, Inc ,1980, 25-27 35 Takashi Yamamoto and Gary K Powell (1993), “Bacillus thuringiensis Crystal Proteins: Recent Advances in Understanding Its Insecticidal Activity”, Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., NY 3-42 36 Thiery and E Frachon (1997), “Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bacteria”, Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology, Edited by Lawrence A Lacey, Aacademic Press, 55-57 37 World Health Organization (1999), Microbial Pest Control Agent Bacillus thuringiensis, Environment Health Criteria 217, Geneve, Switzerland Tài liệu internet 38.http://www.vast.ac.vn/1.0/index.php? option=com_content&view=article&id=1390%3A35-nm-nghien-cu-va-phat-trinthuc-tr-sau-sinh-hc-bacillus-thuringiensis-ti-vit-nam&catid=27%3Asan-phamcong-nghe&Itemid=143&lang=vi 39.http://www.cualuoichongmuoi.com.vn/tim-hieu-loai-muoi/730-mot-vaithong-tin-ve-loai-muoi.html 40.http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoPreview.jsp? ID=4110 41 http://www.cbwinfo.com/Biological/Vectors/Culex.html 42.http://www.impehcm.org.vn/index.php? mod=thongtinvien&dvid=10&tvid=303 ... lọc một số chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi phân lập từ đất rừng ngập mặn tỉnh Thái Bình” Mục tiêu đề tài: Sàng lọc được chủng Bacillus thuringiensis. .. mẫu đất rừng ngập mặn thuộc tỉnh Thái Bình Thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi của các chủng Bt đã được phân lập Phân loại Bt bằng phương pháp huyết Sàng lọc các chủng. .. thuringiensis có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi tốt nhất để sản xuất thuốc diệt muỗi sinh học Để đạt mục tiêu đề tài cần cần thực nội dung sau: Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ