BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 HOÀNG ÁNH SÁNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN KOMBUCHA TỪ TRÀ SHAN TUYẾT HÀ GIANG CHUYÊN NGÀNH: SINH THÁI HỌC MÃ SỐ: 60 42 01 20 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN ______***______ Trong quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thiện Luận văn, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều tập thể, cá nhân. Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung - người đã tận tình hướng dẫn, cung cấp cho tôi nhiều kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thiện đề tài. Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, các thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh Kỹ Thuật nông nghiệp, Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài. Xin gửi lời cảm ơn sự giúp đỡ các anh chị trong phòng Vi sinh, các em sinh viên K37 đang làm đề tài tại phòng Vi sinh, Thư viện Trường ĐHSP Hà Nội 2, bạn bè, người thân và đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, 16 tháng 11 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Hoàng Ánh Sáng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là kết quả của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả bất kỳ của tác giả nào đã công bố. Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho luận văn của mình. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TÁC GIẢ LUẬN VĂN Hoàng Ánh Sáng TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT 1. ADP: Adenozin diphotphat 2. ATP: Adenozin triphotphat 3. CFU: Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) 4. FAD: Flavin adenine dinucleotide 5. GlcUA: Glucuronic acid 6. MT: Môi trường 7. NADP: Nicotiamide adenine 8. PABA: Para – amino benzoic acid 9. PQQ: Pyrroloquinoline Quinone 10. PQQH 2 : Hydroquinone 11. SCOBY: Symbiotic Colony of Bacteria and Yeast 12. STT: Số thứ tự 13. TCVN: Tiêu chuẩn Việt nam 14. VSV: Vi sinh vật DANH MỤC HÌNH, BẢNG * Danh mục hình 1.1. Kombucha bị nhiễm nấm mốc 6 1.2. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất trong trà kombucha 6 1.3. “Con nấm” (SCOBY) 7 1.4. Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và hình dạng khác nhau 8 1.5. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men 12 1.6. Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic 13 1.7. Trà Shan tuyết Hà Giang 17 3.1. Sản phẩm kombucha sử dụng phân lập vi khuẩn 31 3.2. Ảnh mẫu vi khuẩn X 4 nhuộm Gram 32 3.3. Chuyển hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuẩn 32 3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter 35 3.5. Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter X 4 trên môi trường thạch đĩa 36 3.6. Mẫu vi khuẩn Acetobacter X 4 trên môi trường thạch nghiêng 37 3.7. Hình thái của chủng vi khuẩn X 4 và 4 chủng vi khuẩn X 1 , X 2 , X 5 , và X 6 trên kính hiển vi điện tử có độ phóng đại 10.000 lần 37 3.8. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X 4 42 3.9. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của (NH 4 ) 2 SO 4 đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X 4 43 3.10. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgSO 4 . 7H 2 O đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X 4 45 3.11. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của KH 2 PO 4 đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X 4 46 3.12. Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X 4 bổ sung hàm lượng KH 2 PO 4 1,0 và 1,5 (g/l) 46 3.13. Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X 4 với thời gian lên men 5, 7 và 9 ngày 49 3.14. Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X 4 ở nhiệt độ 20 0 C và 30 0 C 52 3.15. Quy trình lên men Kombucha quy mô phòng thí nghiệm 54 * Danh mục bảng 1.1. Thành phần hóa học trà kombucha 15 2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 28 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 29 2.3. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 29 3.1. Đặc điểm sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter 38 3.2. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 5 chủng vi khuẩn Acetocbacter 39 3.3. Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha từ 5 chủng vi khuẩn Acetobacter 40 3.4. Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter X 4 42 3.5. Mẫu thử thay đổi tỉ lệ đường, trà trong 1000 ml nước 47 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X 4 49 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X 4 50 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X 4 51 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X 4 52 3.10. Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng phương pháp cảm quan 57 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 1 LỜI CAM ĐOAN 3 TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT 4 DANH MỤC HÌNH, BẢNG 5 MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 1 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2 5. Những đóng góp mới của đề tài 2 6. Phương pháp nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tổng quan về Kombucha 4 1.1.1. Sơ lược về kombucha 4 1.1.2. Đặc điểm cấu tạo kombucha. 7 1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha 8 1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 11 1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha 14 1.2. Một số đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang 16 1.2.1. Phương pháp sản xuất trà 17 1.2.2. Đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang 17 1.3. Tình hình nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam và trên thế giới 18 1.3.1. Trên thế giới 18 1.3.2. Ở Việt Nam 19 CHƯƠNG 2 21 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 21 2.1.1. Đối tượng 21 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 21 2.1.3. Môi trường 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Phương pháp vi sinh 22 2.2.2. Phương pháp hóa sinh 25 2.2.3. Phương pháp cảm quan 27 2.2.4. Phương pháp toán học 29 CHƯƠNG 3 31 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang 31 3.1.1. Tạo sản phẩm kombucha 31 3.1.2. Phân lập vi khuẩn lên men kombucha 31 3.1.3. Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 34 3.1.4. Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn 37 3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha 39 3.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn 39 3.2.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha 40 3.2.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X 4 41 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha 43 3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lên men kombucha 43 3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha 48 3.4. Thực hiện lên men kombucha 53 3.4.1. Sơ đồ lên men kombucha 53 3.4.2. Thuyết minh quy trình 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 1. Kết luận 58 2. Kiến nghị 58 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Kombucha là thức uống lên men có lợi cho sức khỏe, đã được nhiều người biết đến với các tên gọi khác nhau “trà nấm”, “thủy sâm”, “thủy hoài sâm”… nó có vị ngọt và hương thơm của rượu táo lên men. Trên thế giới, kombucha đã được sản xuất và tiêu thụ dưới nhiều tên gọi khác nhau như: Machurian, Mo-Gu, Kocha kinoko,… Ở Việt Nam, kombucha mới chỉ được lên men tại hộ gia đình từ các nguồn nguyên liệu như trà xanh, trà lipton…. Cách tạo sản phẩm kombucha được nhiều người quen gọi là “cách nuôi nấm thủy sâm”, nhưng bản chất là quá trình các vi sinh vật truyển hóa đường (trong dung dịch trà đường) thành acid với một lượng nhỏ hàng trăm các sản phẩm phụ khác nhau. Chất lượng thành phẩm kombucha phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ môi trường, thời gian lên men, độ pH của dung dịch, loại trà, thành phần các vi sinh vật,… Trong đó, vi khuẩn đóng vai trò rất quan trọng để tạo ra sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng. Trong những năm gần đây, đã có một số công trình nghiên cứu về nấm men, vi khuẩn, tác dụng của kombucha…Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào đánh giá đầy đủ về sự về sự ảnh hưởng của vi khuẩn, môi trường lên men, loại vi khuẩn lên men kombucha. Chính vì vậy tôi quyết định lựa chọn đề tài "Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn tới quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang". 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn, đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn tới quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha. 3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên mem kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của của một số yếu tố tới động thái phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. 3.4. Thực hiện quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Chủng vi khuẩn có khả năng lên men Kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. 5. Những đóng góp mới của đề tài Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về đối tượng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. Đặc biệt, đã phân lập, được 5 chủng vi khuẩn có khả năng tạo sản phẩm kombucha; xác định được động thái sinh trưởng, điều kiện môi trường phù hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. 6. Phương pháp nghiên cứu 6.1. Phương pháp vi sinh Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật; phương pháp bảo quản chủng giống. 6.2. Phương pháp hóa sinh Phát hiện hoạt tính catalase; khả năng oxy hoá acid acetic; chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone; sinh trưởng trên môi trường Hoyer; phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị; phát hiện khả năng tổng hợp cellulose. [...]... nghiên cứu về chủng vi khuẩn, ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn trong lên mem kombucha hầu như không có 21 2 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn thuần khiết phân lập từ kombucha được lên men từ trà Shan tuyết Hà Giang trong phòng thí nghiệm vi sinh, trường... Savatovic, Sladjana (2007) vi t về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha [48] Z Kovacevic, G.Davidovic (2014) vi t về vi m gan vàtác dụng gây độc của trà kombucha [55] 1.3.2 Ở Vi t Nam Ở Vi t Nam, những công trình nghiên cứu về kombucha còn rất ít và chưa đầy đủ, hoàn chỉnh về khu hệ nấm men, vi khuẩn lên men kombucha Tác dụng chữa bệnh và độ độc hại của loại trà này cần phải được nghiên cứu, ... giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn 1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá trình lên men. .. Hồng Liên (2013), Đại sư phạm Hà Nội 2 đã thực hiện đề tài Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang đã tuyển chọn được 2 chủng nấm men Saccharomyces M1 và Saccharomyces M2 phù hợp cho quá trình lên men kombucha, khảo sát 20 được ảnh hưởng của hàm lượng men giống, pH ban đầu, nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của hai chủng nấm men M1, M2 Nữ Liên Hương thuộc... phẩm trà Shan tuyết 1.2.2 Đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang - Ngọn chè Shan Tuyết tươi phủ một lớp phấn trắng như tuyết - Thành phẩm trà xoăn chặt, màu xanh đen, cánh trà có tuyết - Nước trà sau khi pha có màu vàng sậm có hương thơm, uống lúc đầu chát gắt, có vị đắng, sau có vị ngọt kéo dài, pha nhiều lần vẫn đậm Hình 1.7 Trà Shan tuyết Hà Giang Do quá trình diệt men làm đình chỉ hoạt động của enzyme,... dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau: * Lên men ethanol Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2 Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối và thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2 Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình. .. sát ảnh hưởng của thời gian chế biến tới một số tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha , tháng 3 năm 2013 Nội dung của bản báo cáo khoa học: giới thiệu trà giấm kombucha, định hướng nghiên cứu thực nghiệm, tóm tắt các kết quả nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt kết quả khảo sát hàm... 1.6 Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic 14 * Lên men lactic: Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết quả là hàm... trường lên men kombucha (MT3) Saccharose : 100g Trà Shan Tuyết: 15g Nước máy : 1000ml 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh 2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram a Phân lập vi khuẩn theo phương pháp Vinogradski Để có được chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập từ nguồn nguyên liệu là kombucha Trước hết cần thực hiện quá trình lên men. .. lượng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt về một số hoạt tính sinh học của trà giấm Kombucha: tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thư, theo thời gian lưu mẫu, trên từng loại trà giấm Như vậy, có thể thấy các nghiên cứu về kombucha ở Vi t Nam còn rất ít, các nghiên cứu về . đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn tới quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha. . lên men kombucha. Chính vì vậy tôi quyết định lựa chọn đề tài " ;Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn tới quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang& quot;. 2. Mục đích nghiên cứu Phân. chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang 31 3.1.1. Tạo sản phẩm kombucha 31 3.1.2. Phân lập vi khuẩn lên men kombucha 31 3.1.3. Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng vi khuẩn