Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
m BÔ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI KIỂU THỊ HƯỜNG XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG • • • ALPHA-TOCOPHEROL TRONG DẦU GÂC BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2002-2007) Người hướng dẫn: Th.s Nguyễn Tường Vy DS Bùi Đinh Sơn Nơi thực hiện: Bộ môn hóa phân tích- Trường ĐH Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: Tháng 11/2006- 4/2007 Hà Nôi - 5/2007 m LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được thực hiện tại bộ môn hóa phân tích trường đại học Dược Hà Nội. Trong thòi gian thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô hướng dẫn, các giảng viên của bộ môn hóa phân tích và cán bộ các bộ môn trong trường. Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành tới cô giáo Th.s Nguyễn Tường Vy, giảng viên bộ môn hóa Dược là người đã chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn DS Bùi Đình Sơn, giảng viên bộ môn hóa phân tích, là người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tiến hành khóa luận. Cho phép tôi được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong bộ môn hóa phân tích đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện thí nghiệm tại bộ môn. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình bạn bè đã giúp đỡ và ở bên tôi trong thời gian qua. Hà nội, tháng 5 năm 2007 Sinh viên Kiều Thị Hường. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 3 1.1 DẦU GẤC 3 1.1.1. Nguồn gốc, phương pháp điều chế [9] 3 1.1.2. Tính chất [5] 3 1.1.3. Thành phần hoá học 3 1.1.4. Tác dụng dược lí [9] 4 1.1.5. Công dụng và liều dùng [9] 5 1.2. ALPHA-TOCOPHEROL (AT) 5 1.2.1. Công thức [23] 5 1.2.2. Nguồn gốc [2] 5 1.2.3. Tính chất [2,24] 5 1.2.4. Công dụng [2,17] 6 1.2.5. Một số phương pháp định lượng AT 6 1.3. Tổng quan về phương pháp HPLC [4,10,12] 8 1.3.1. Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao 8 1.3.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cột [10] 8 1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký [4] 9 1.3.4. Cơ sở lí thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký[4,12] 12 1.3.5. Các cách tính kết quả [2,3,7]: 14 PHẦN 2:THựC NGHIỆM VÀ KẾT Q U Ả 16 2.1. ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHAT, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 16 2.1.1. Đối tượng 16 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 16 2.1.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 17 2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 19 2.2.1. Lựa chọn quy trình chiết vit E: 19 2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc k ý 21 2.2.3. Thẩm định phương pháp định lượng 23 2.3. ÁP DỤNG PHUƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỤNG ĐỊNH LUỢNG AT TRONG CHẾ PHẨM DẦU GẤC 30 2.4. BÀN LUẬN VỀ PHƯƠNG PHÁP 32 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUÂT 34 3.1. KẾT LUẬN 34 3.2. ĐỀ XUẤT 34 CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT AT : Alpha-tocopherol. DAD : Detector tử ngoại-khả kiến. FID : Detector ion hóa ngọn lửa. HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao. STT : Số thứ tự. Vit : Vitamin. TB : Trung bình. USP : Dược điển Mỹ. ĐẬT VÂN ĐỂ Gấc (Momordỉca chochinchinensis. spreng) là loại cây mọc hoang dại và được trồng khắp nơi ở Việt Nam, nhiều nhất ở các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ. Bên cạnh việc dùng quả gấc như một loại thực phẩm độc đáo, nhân dân ta đã biết khai thác nhiều công dụng khác nhau từ rễ gấc và hạt gấc [9]; Trong đó, dầu gấc ép từ màng đỏ bao quanh hạt gấc đã được sử dụng từ năm 1942. Cho đến nay, nhờ những nghiên cứu chứng minh về tác dụng sinh học của nó đối với sức khỏe con người [9,18] dầu gấc đã trở thành một chế phẩm được đầu tư sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng nhu cầu đang ra tăng của thị trường dược phẩm trong và ngoài nước. Việc xây dựng được các quy trình định tính và định lượng các thành phẩn hoá học trong dâu gấc không chỉ có ý nghĩa minh chứng khoa học cho những công dụng đã được thừa nhận mà còn là cơ sở cho việc định hướng biện pháp trồng trọt, thu hái và chế biến gấc một cách khoa học, hợp lí. Thành phần hóa học của dầu gấc đã được một số tác giả nghiên cứu, cho thấy dầu gấc là một loại thực phẩm giàu Carotennoid, acid béo no và không no [9,13], bên cạnh đó dầu gấc còn có các kim loại vi lượng và vitamin E [7,9,18]. Vitamin E là một trong 13 vitamin thiết yếu cho sự trao đổi chất, sự phát triển của cơ thể và là chất chống lão hóa toàn diện. Trong số 8 vitamin E tồn tại trong tự nhiên, alpha-tocopherol là quan trọng nhất vì nó chiếm tới 90% trong số các Tocopherol trong các tổ chức của động thực vật và có hoạt tính vitamin E cao nhất [2]. Hiện nay phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) được áp dụng rộng rãi để phân tích định tính và định lượng vitamin E vì phương pháp này cho kết quả có độ chính xác cao và phù hợp vói điều kiện của nhiều phòng thí nghiệm. Ngoài vitamin E, trong dầu gấc còn chứa một lượng lớn các chất như acid béo, carotenoid nên trước khi đem định lượng bằng HPLC cần phải có 1 giai đoạn tách chiết và làm sạch mẫu phân tích. Trên cơ sở tham khảo một số quy trình đã công bố và điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm của Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tài: " Định lượng alpha-Tocopherol trong dầu gấc bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) ” với các mục tiêu cụ thể như sau: - Xây dựng một quy trình định lượng alpha-tocopherol trong dầu gấc đảm bảo chính xác và tin cậy. - Áp dụng quy trình để định lượng alpha-tocopherol trong một số nguồn dầu gấc khác nhau. 2 PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1 DẦU GẤC 1.1.1. Nguồn gốc, phương pháp điều chế [9] Nguồn gốc: Dầu gấc (oleum Momordica) là dầu ép từ màng đỏ phơi hay sấy khô của hạt cây gấc (Momordica cochinchinensis. spreng), họ bí (c ucurbỉtaceae). Phương pháp điều chế: Dầu gấc được điều chế bằng cách sấy khô màng hạt gấc, sau đó tán nhỏ, rồi áp dụng một trong các phương pháp sau đây: > Chiết bằng dung môi: lấy kiệt dầu bằng dung môi hữu cơ, sau đó thu hồi dung môi, cặn còn lại là dầu gấc. > Phương pháp ép: màng đỏ đã sấy khô tán nhỏ, đem đồ lên rồi ép ra được dầu gấc. Dầu ép khi để lâu hay để trong tủ lạnh cũng phân thành hai lớp như dầu chiết bằng dung môi. > Phương pháp thủ công nghiệp: cho màng hạt gấc đã sấy khô tán nhỏ vào dầu lạc hay mỡ lợn đã đun nóng ở nhiệt độ 60-70°C. Dầu lạc hay mỡ lợn sẽ hòa tan chất dầu trong màng gấc. Dầu này dùng trong gia đình hay dùng trong một thời gian ngắn. 1.1.2. Tính chất [5] Dầu gấc có tính chất lỏng sánh, trong, màu đỏ máu, mùi thơm đặc biệt, vị béo, không khé cổ. Nếu để lâu hoặc ở nhiệt độ 0-5°C có cặn thì cặn đó thuộc loại tinh thể Carotenoid. Độ hoà tan: dễ tan trong ether dầu hỏa, cloroform và ether. Tỷ trọng dầu gấc ở 15°c là 0,9151- 0,9156 Chỉ số khúc xạ của dầu gấc ở 20°c là 1,4681- 1,4685. 3 1.1.3. Thành phần hoá học Theo tài liệu nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi và một số tác giả khác về thành phần hóa học trong dầu gấc cho thấy dầu gấc giàu beta-caroten, lycopen và các acid béo không no. Trong dầu gấc có trên 0,1% â-caroten, lycopen, các acid béo không no (acid oleic 44,4%, acid palmatic 33,8%, acid linoleic 14,7%, acid stearic 7,69%) [1,9] Ngoài ra, trong dầu gấc còn có một số kim loại vi lượng cần thiết cho cơ thể như đồng, sắt, coban, và đặc biệt là kẽm và selenium (một chất mới được biết rất cần thiết để phòng chống ung thư) [9,17]. Bên cạnh đó, vitamin E cũng đã được phát hiện là một thành phần của dầu gấc [7,18] 1.1.4. Tác dụng dược lí [9] Dầu gấc có tác dụng như những thuốc có vitamin A, đặc biệt khi bôi lên các vết thương, vết loét dầu gấc làm vết thương chóng lành và mau lên da non. Uống dầu gấc, bệnh nhân chóng lên cân. Trên súc vật thí nghiệm và trên người bệnh, dầu gấc có khả năng sửa chữa các hư hỏng của nhiễm sắc thể, các khuyết tật về phôi thai do dioxin gây trên động vật, khả năng phòng ung thư cho người bị bệnh xơ gan. 1.1.5. Công dụng và liều dùng [9] Công dụng: dùng trong những trường hợp cần vitamin A hay caroten: bệnh chậm lớn của trẻ em, biến chứng về mắt (khô mắt, quáng gà), chữa các vết loét, triệu chứng của sức chống đỡ kém của cơ thể, làm cho mau lên da non, trong những vết bỏng, vết thương. Cách dùng và liều dùng: Dùng trong: với liều 5 giọt một lần, ngày hai lần trước 2 bữa ăn chính, có thể dùng tới 20 giọt, đối với trẻ em dùng 5 đến 10 giọt một ngày. Dùng ngoài: dưới hình thức thuốc mỡ có 5-10% dầu gấc, có thể dùng dưới hình thức dầu nguyên chất để bôi bỏng. 4 1.2. ALPHA-TOCOPHEROL (AT) 1.2.1. Công thức [23] . Công thức phân tử: QgHjoOj - Trọng lượng phân tử: 430,7. - Tên khoa học: (2/?)-2,5,7,8-Tetramethyl-2-[(4/?,8/?)-4, 8, 12- trimethyltridecyl]-3,4-dihydro-2H-chromen-6-ol. - Tên gọi khác: vitamin E. 1.2.2. Nguồn gốc [2] Trong tự nhiên, AT cũng như các chất khác trong nhóm vit E có nhiều trong mầm hạt (lúa, mì, ngô và các hạt khác), có trong rau diếp, đậu tương và dầu bông. Tất cả cây xanh đều có chứa vit E. Ngoài ra, vit E còn có trong các sản phẩm bơ sữa, trong thịt, trứng, cà rốt, cà chua. Về điều chề: Vitamin E có thể được phân lập từ các sản phẩm tự nhiên, ngày nay chủ yếu được điều chế bằng phương pháp tổng hợp hóa học. 1.2.3. Tính chất [2,24] Lí tính: - Là chất lỏng dầu, dính dạng sền sệt. - Trong, không màu hoặc có màu vàng sáng. - Độ tan: không tan trong nước, tan trong ethanol, các dung môi hữu cơ và dầu béo. 5 [...]... mẫu 2.1.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu a Nghiên cứu quy trình chiết tách và xây dựng điều kiện sắc kí phù hợp để định lượng a- Tocopherol trong dầu gấc - Khi nghiên cứu định lượng AT trong dầu gấc chúng tôi đã tham khảo các phương pháp tách chiết và định lượng Vit E trongdầu thực vật và dầu động vật đang được áp dụng Từ đó lựa chọn quy trình tách chiết vit E để định lượng bằng HPLC - Trên cơ sở... pic T nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phương pháp định lượng được chấp nhận 11 1.3.4 Cơ sở lí thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký[ 4,12] a Lựa chọn cột (pha tình) trong HPLC Vì phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu này là sắc ký hấp phụ nên các phân tích dưới đây chỉ tập trung vào lựa chọn pha tĩnh cho sắc ký hấp phụ Sắc ký hấp phụ có hai loại là: • Sắc ký hấp phụ pha thuận • Sắc ký hấp phụ... theo phương pháp lần lượt là 8,8 và 26,4|ig/ml Hình 4: sắc đồ giói hạn phát hiện của AT [' DAD1A, Sig=230,8 Ref=400,100 (NTVY-VTE\0604VTE5.D) mAU I I 25 õ 2.3 Áp dụng phương pháp đã xây dựng định lượng AT trong chê phẩm dầu gấc Dựa trên phương pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành định tính và định lượng các mẫu dầu gấc có nguồn gốc khác nhau 30 Trên nguyên tắc so sánh thời gian lưu thu được từ mẫu dầu. .. 1.3 Tổng quan về phương pháp HPLC [4,10,12] 1.3.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao Khái niệm về sắc ký: sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lí dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ trên... điều kiện sắc kí bao gồm: > Lựa chọn thành phần pha động > Tốc độ dòng pha động > Với detector UV-VIS có sẵn, lựa chọn bước sóng phát hiện thích hợp b Thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng Phương pháp định lượng đã xây dựng được đánh giá trên các thông số sau: - Tính thích hợp của hệ thống sắc ký - Độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất - Độ chính xác của phương pháp - Độ đúng... dầu gấc với thời gian lưu của AT chuẩn, chúng tôi đã xác định sự có mặt của AT trong các mẫu dầu gấc khảo sát Từ đó tính hàm lượng của AT có trong mẫu dầu gấc theo phương pháp đã xây dựng Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn đúng theo quy trình đã nêu ở mục 2.2.1 Chuẩn bị và cho hệ thống sắc kí chạy ổn định với pha động trong khoảng thời gian 30 phút Tiêm mẫu thử và mẫu chuẩn vào hệ thống sắc kí trong. .. thành tín hiệu điện Detector được sử dụng thuộc loại ion hoá ngọn lửa (FID) với nguyên tắc cơ bản là: nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ bị bẻ gãy mạch và bị ion hóa chuyển thành tín hiệu điện và cho kết quả dưới dạng sắc đồ bao gồm các pic Diện tích pic là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu > Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Là phương pháp được... mỉr Hình 1: sắc kí đồ của a- Tocopherol trong mẫu dầu gấc DAD1 A, Sig=230,8 Ref=400,100 (E:\HPLC-D~1\NTVY-VTE\0904SE44.D) mAỤ V Q_ o Ọ 0 H 1 SZ 250 I ro JZ Q_ 20Ồ 03 150 100 ỉ 50 LO CÓ 0 0 10 15 20 25 Hình 2: sắc kí đồ của a -Tocopherol trong mẫu chuẩn 22 m ỉ 2.2.3 Thẩm định phương pháp định lượng 2.2.3.I Khảo sát tính thích hợp của hệ thông sắc ký Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, chúng... động lỏng dưới áp suất cao [4] 1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cột [10] Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kĩ thuật nhất định Pha tĩnh là một yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo Pha tĩnh được liên kết với một nhóm chức khác ta có sắc ký pha liên kết Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký. .. pic (a=31,6; b= 6,91) Khối lượng thu hồi của chuẩn là: ™ , h = m t+c- m , (m) Trong đó: • mth: lượng chất chuẩn thu hồi • mt+c: tổng lượng chất thử và chuẩn trong mẫu dầu gấc • mt: lượng chất thử có ban đầu trong mẫu dầu gấc Phần trăm lượng chất chuẩn được thu hồi : T =^ x mc 100 (%) mc là lượng chất chuẩn thêm vào mẫu dầu gấc Tiến hành: > Cân 30,4mg chuẩn AT-acetat hòa tan trong 100 ml methanol thu . " Định lượng alpha- Tocopherol trong dầu gấc bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) ” với các mục tiêu cụ thể như sau: - Xây dựng một quy trình định lượng alpha- tocopherol trong dầu. YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI KIỂU THỊ HƯỜNG XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG • • • ALPHA- TOCOPHEROL TRONG DẦU GÂC BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2002-2007) Người. 95-5 290 0,4 15 7 1.3. Tổng quan về phương pháp HPLC [4,10,12] 1.3.1. Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Khái niệm về sắc ký: sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lí dùng để tách các