Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI — is.EQjgs’ PHẠM THỊ QUỲNH HOA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐổNG THÒI LYCOPEN VÀ BETA- CAROTEN TRONG DẦU GẤC Oleum momordỉcae (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2002- 2007) Người hướng dẫn : Th.s Nguyễn Tường Vy CN Vũ Tùng Lâm Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá phân tích Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: 03/2007- 05/2007 Hà Nội, tháng 5 năm 2007 LỜI CẢM ƠN Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại bộ môn Hoá phân tích trường đại học Dược Hà Nội. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới Th.s Nguyễn Tường Vy và thầy Vũ Tùng Lâm đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này. Đồng thời tôi cũng chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô và cấc kỹ thuật viên tại bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận. Sinh viên Phạm Thị Quỳnh Hoa MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐÈ 1 PHẦN 1: TỎNG QUAN 2 1.1. DẦU GẤC 2 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm 2 1.1.2. Thành phần hoá học 2 1.1.3. Tác dụng và công dụng 2 1.2. BETA- CAROTEN 3 1.2.1. Công thức cấu tạo 3 1.2.2. Tính chất 4 1.2.3. Tác dụng 4 1.2.4. một số phương pháp định lượng 4 1.3. LYCOPEN 5 1.3.1. Công thức cấu tạo 5 1.3.2. Tính chất 5 1.3.3. Tác dụng 5 1.3.4. Phương pháp định lượng . 5 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT LYCOPEN VÀ Ị3-CAROTEN TRONG DẦU GẤC 6 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐồNG THỜI LYCOPEN VÀ Ị3-CAROTEN 7 1.6. PHƯƠNG PHÁP HPLC 8 1.6.1. Khái niệm 8 1.6.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cột 8 1.6.3. Pha tĩnh, pha động trong HPLC 9 1.6.4. Các đại lượng đặc trưng 10 1.6.5. Các cách tính kết quả 12 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 14 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2. Thiết bị và hoá chất 14 2.1.3. Nội dung và phương pháp thực nghiệm 15 2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 16 2.2.1. Xây dựng phương pháp chiết xuất lycopen và ị3-caroten trong dầu gấc 16 2.2.2. Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký 17 2.2.3. Đánh giá phương pháp định lượng 21 2.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 28 2.2.5. ứng dụng chương trình đã xây dựng để định lượng một số mẫu dầu gấc 30 2.3. BÀN LUẬN 33 KẾT LUẬN 34 CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT EtOAC : Ethyl acetat HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao. MTBE : Methyl-tert-butyl ether. MeOH : Methanol STT : Số thứ tự THF : Tetrahydrofuran ĐẬT VẤN ĐÈ Gấc (Momordica cochinchinensỉs (Lour.) Spreng, họ Bí (Curcubitaceae)) là loại cây rất quý của nước ta. Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng quả gấc như một nguồn thực phẩm bổ dưỡng, dùng dầu ép từ màng đỏ quả gấc để làm thuốc. Các nhà khoa học đã nghiên cứu, phát hiện trong màng đỏ bao quanh hạt gấc có rất nhiều chất dinh dưỡng: beta-caroten, lycopen, vitamin E, dầu thảo mộc Khi vào trong cơ thể, beta-caroten sẽ biến thành vitamin A. Vì thế người ta dùng dầu gấc để chữa bệnh trẻ em chậm lớn, thiếu vitamin A, khô mắt, quáng gà, chữa bệnh người lớn kém ăn mệt mỏi. Beta-caroten và lycopen có tác dụng phòng một số loại ung thư. Beta- caroten phòng và chữa bệnh ung thư đường tiêu hóa và dạ dày, ung thư phổi. Lycopen có tác dụng phòng chống ung thư đường tiêu hóa, ung thư tuyến tiền liệt. Do có nhiều tác dụng tốt như vậy, nên việc chiết xuất dầu gấc ngày càng phát triển để đáp ứng đủ nhu cầu nguyên liệu cho công nghệ thực phẩm trong nước và xuất khẩu. Dược điển Việt Nam I, tập 1 đã đưa ra phương pháp định lượng dầu gấc bằng đo phổ hấp thụ u v - VIS. Tuy nhiên phương pháp này chỉ định lượng được (3-caroten trong khi lycopen cũng là một thành phần quan trọng có hoạt tính sinh học cao hiện nay đang được quan tâm rất nhiều. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời p-caroten và lycopen trong dầu gấc ” với mục tiêu cụ thể sau: - Xây dựng một quy trình kỹ thuật thích hợp để định lượng đồng thời [3- '■ - - — _ ___________________ _ _______ _ _______________ J caroten và lycopen trong dầu gấc. - ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng |3-caroten và lycopen trong nguyên liệu dầu gấc. 1 PHẦN 1: TỎNG QUAN 1.1. DẦU GẤC 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm Dầu gấc (Oleum Momordicae) là dầu ép từ màng đỏ phơi hay sấy khô của hạt cây gấc (Momordica cochinchinensis. Spreng), họ bí (Cucurbitaceae). Tính chất: Chất lỏng sánh, trong, màu đỏ máu, mùi thơm ngọt đặc biệt, vị béo, không khé cổ. Nếu để lâu hoặc ở nhiệt độ 0- 5°c có cặn thì cặn đó thuộc loại tinh thể carotenoid. Độ hoà tan: dễ tan trong ether dầu hoả, cloroform và ether. Tỷ trọng: ở 15°c là 0,9151- 0,9156. Chỉ số khúc xạ: ở 20°c là 1,4681- 1,4685 [3]. 1.1.2. Thành phần hoá học Trong dầu gấc có trên 0,1% P-caroten , lycopen, các acid béo không no (acid oleic 44,4%, acid linoleic 14,7%, acid stearic 7,69%; acid palmitic 33,8%) [13]. Ngoài ra còn có một số chất vi lượng cần thiết cho cơ thể như đồng, sắt, coban, kẽm và selen, một chất mới được biết rất cần thiết để phòng chống ung thư [6 ]. 1.1.3. Tác dụng và công dụng *1* Tính vị công năng: dầu gấc có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ tỳ vị, làm sáng mắt [13]. ♦> Công dụng'. - Dầu gấc được dùng trong nhiều trường hợp cơ thể thiếu vitamin A như: biến chứng về mắt (khô mắt, quáng gà), trẻ con chậm lớn, phụ nữ có mang, cho con bú. 2 - Dùng ngoài bôi vào vết thương, vết bỏng làm mau lên da non, chóng lành. Dầu gấc dùng kèm một số kháng khuẩn đặc biệt chữa được bệnh trứng cá kén có nhân. - Dầu gấc nhuận tràng, dùng thích hợp cho người táo bón, người đi lỏng không nên uống dầu gấc [6], [13]. *1* Cách dùng : - Dùng trong với liều 5 giọt một lần, ngày 2 lần trước 2 bữa ăn chính, có thể dùng tới 20 giọt. Đối với trẻ em, dùng 5 đến 10 giọt một ngày. - Dùng ngoài dưới hình thức thuốc mỡ có 5 đến 10% dầu gấc, có thể dùng dưới hình thức dầu nguyên chất để bôi bỏng [6]. 1.1.4. Các phương pháp sản xuất dầu gấc Muốn chế dầu gấc, trước hết cần sấy khô màng hạt gấc, sau đó tán nhỏ rồi áp dụng một trong các phương pháp sau [6]: > Chiết bằng dung môi (ether dầu hoả): Lấy kiệt bằng ether dầu hoả. Sau đó thu hồi ether bằng cách đun cách thuỷ trong bầu khí trơ. Cặn còn lại là dầu gấc. > Ép: Màng đỏ đã sấy khô tán nhỏ, đem đồ lên rồi ép. > Phương pháp thủ công nghiệp: Màng hạt gấc đã sấy khô tán nhỏ cho vào dầu lạc hay mỡ lợn đã đun nóng ở nhiệt độ 60-70°. Dầu lạc hay mỡ lợn sẽ hoà tan chất dầu chứa trong màng dầu gấc. Dầu gấc được bảo quản trong chai màu, nút kín. 1.2 BETA- CAROTEN. 1.2.1. Công thức cấu tạo 3 Tên khác: Ị3,ị3- caroten, carotaben, provaten, solaten. Tên khoa học: (all E)- 3, 7, 12, 16- tetramethyl- 1, 18- bis(2, 6, 6- trimethyl cyclohex- 1-enyl) octadeca-1, 3, 5,7,9,11,13,15,17- nonaene. 1.2.2. Tính chất - Bột kết tinh màu đỏ nâu. - Nhiệt độ nóng chảy: 183°c. - Độ tan: tan trong cyclohexan, cloroform, benzen, ether dầu hoả. Hầu như không tan trong ethanol, nước. - Cho phổ hấp thụ UV-VIS, cực đại hấp thụ (trong chloroform) là 497 và 466nm - Dễ bị biến đổi khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng và nhiệt độ [ 14],[21], 1.2.3. Tác dụng - Về mặt sinh học P-caroten là tiền chất quan trọng nhất của vitamin A. Trong công nghiệp dược được dùng như vitamin A nhưng không gây tích luỹ độc như vitamin A. Cơ thể người tích luỹ (3-caroten ở gan và khi cần thì enzym gan sẽ phần ly P-caroten thành 2 phân tử vitamin A. - Ị3-caroten còn có tác dụng chống oxy hoá, ngăn ngừa ung thư. - Trong công nghiệp thực phẩm P-caroten được dùng làm phẩm màu. 1.2.4. Một số phương pháp định lượng - Sử dụng quang kế với kính lọc màu 347nm, mẫu trắng là ether dầu hoả. Đọc mật độ quang và đối chiếu với đường cong chuẩn của p-caroten kết tinh để tính kết quả [3]. - Đo độ hấp thụ của dung dịch (3-caroten trong cyclohexan ở Ảmax=455nm, E1%!=2500 [14]. - Phương pháp HPLC [24]: • Cột: Vydac 218TP54 • Pha động: Acetonitril: methanol: tetrahydrofuran (40:56:4) 4 • Detector: 470nm 1.3. LYCOPEN. 1.3.1. Công thức cấu tạo v ^5ỵ \ / Tên khác: Ỹ^-caroten Tên khoa học: (6E, 8E, 10E, 12E, 14E, 16E, 18E, 20E, 22E, 24E, 26E)- 2, 6, 10, 14, 19, 23, 27, 31- Octamethyldotriaconta- 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30- tridecaene. 1.3.2. Tính chất - Tinh thể hình kim màu đỏ tía, không mùi. - Nhiệt độ nóng chảy: 172 - 173°c. - Độ tan: tan trong cacbon disulfid, ether dầu hoả, cloroform, benzen. Hầu như không tan trong methanol, ethanol. - Phổ hấp thụ cực đại (trong ether dầu hoả) là 472nm [21]. 1.3.3. Tác dụng - Lycopen là một chất có hoạt tính chống oxy hoá mạnh. - Có tác dụng làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và ung thư, đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt. - Lycopen còn được sử dụng như một chất màu thực phẩm. 1.3.4. Phương pháp định lượng - Phương pháp HPLC [16]: • Cột: YMC ODS -AM, 250mm X 3mm, 5|im, PN AM12S052503WT (hoặc cột tương đương: Phenomenex, LUNA, C18 (2), 150nm X 4,6mm, 5|im PN 00F-4252-E0). • Pha động: MeOH:THF (90:10) Isocratic. 5 [...]... trong khoảng tuyến tính đã được khảo sát Mẫu dầu gấc đã biết trước hàm lượng của lycopen và beta caroten được thêm một lượng chính xác chuẩn hỗn hợp lycopen và beta- caroten lần lượt là 552jLLg và 665 |dg Sau đó mẫu được tiến hành chiết và xác định hàm lượng lycopen và Ị3 -caroten theo phương pháp đã nêu 27 Bảng 5: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp STT Chất cần phân tích lỵcopen Lượng thêm P ~caroten. .. đã xây dựng để xác định hàm lượng một số mẫu dầu gấc 2.1.3.6 Một số công thức tính thống kê xử lý kết quả - Giá trị trung bình: X = - Y Xị nt ỉ E o , -x )2 M - Độ lệch chuẩn: - Độ lệch chuẩn tương đối: n- 1 RSD(% ) = £ X X100 2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 2.2.1 Xây dựng phương pháp chiết xuất Iycopen và p -caroten trong dầu gấc Sau khi tiến hành chiết xuất đồng thời lycopen và P -caroten trong dầu. .. đồng thời |3 -caroten và lycopen: - Khảo sát chọn thành phần pha động - Chọn bước sóng phát hiện - Chọn tốc độ dòng 2.1.3.3 Thẩm định chương trình sắc ký đã xây dựng - Khảo sát độ ổn định của hệ thống sắc ký - Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp - Khảo sát độ chính xác của phương pháp - Khảo sát độ đúng của phương pháp 2.1.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 15 2.1.3.5 ứng dụng phương pháp. .. kali hydroxyd 2N trong ethanol - Dung dịch HC1 đặc - Methanol loại dùng cho HPLC - Acetonitril loại dùng cho HPLC - Dicloromethan loại dùng cho HPLC Chất chuẩn sử dụng trong phân tích gồm: - Chuẩn làm việc lycopen (Roche) - Chuẩn P -caroten 95% (C 9750) Sigma 2.1.3 Nội dung và phương pháp thực nghiệm 2.13.1 Khảo sát xây dựng phương pháp chiết đồng thời lycopen và /?- caroten trong dầu gấc 2.1.3.2 Lựa... giới hạn định lượng cho phép 29 DAD1 A, Sig=476,4 Ref=550,100 (1505LC\1505S103.D)~ m A ir _ H E Z Z Z ! r 9 1 11 ' ' H l 2 _ 13 " Z ' " ' 'mil Hình 10: sắc ký đồ khảo sát giới hạn định lượng của Lycopen và p -caroten 2.2.5 ứng dụng chương trình đã xây dựng để định lượng một số mẫu dầu gấc Các mẫu dầu gấc được tiến hành chiết suất và phân tích theo đúng quy trình đã nêu, kết quả định lượng. .. cách sục khí trơ (khí N2) Phương pháp này vừa rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu, vừa làm giảm nguy cơ chất phân tích bị oxy hoá khi tiếp xúc với môi trường tự nhiên Vì vậy chúng tôi đưa ra phương pháp chiết đồng thời lycopen và [3 -caroten như sau: Cân chính xác khoảng lg dầu gấc vào bình định mức 25mL, thêm 10 mL ether dầu hoả (40-60°C) lắc kỹ cho tan, định mức đến vạch bằng ether dầu hoả Hút chính xác 2,0mL... độ ổn định 2.2.3.2 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp Để đảm bảo sự chính xác của phép định lượng, chúng tôi xác định khoảng phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ lycopen và P -caroten với diện tích các píc tương ứng Pha một dãy 5 dung dịch hỗn hợp lycopen và P -caroten chuẩn trong dicloromethan có nồng độ của lycopen biến thiên trong khoảng 2,208|ig/mL - 22 22,08|ig/mL, của P -caroten biến thiên trong. .. dòng: l,2mL/phút • Detector: 472nm • Thể tích tiêm: 10(0.1 • Nhiệt độ cột: 30°c • Thời gian chạy: 12 phút 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT LYCOPEN VÀ p -CAROTEN TRONG DẦU GẤC ❖ Phương pháp 1 Cân chính xác khoảng 0,5g dầu gấc vào bình nón nút mài dung tích lOOmL, thêm 30mL dung dịch KOH 2N trong ethanol (TT), đung sôi hồi lưu trong cách thuỷ 30 phút Sau đó làm lạnh nhanh rồi dùng 20mL nước cất để chuyển hết... thống kê trong bảng chỉ ra phương pháp có độ chính xác có thể chấp nhận được đối với một hợp chất tự nhiên 2.2.3A Khảo sát độ đúng của phương pháp Độ đúng của phương pháp được tiến hành nhằm đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị được coi là thực Độ đúng của phương pháp được xác định dựa trên phương pháp thêm chuẩn Lượng chuẩn thêm vào phải đảm bảo sao cho nồng độ của mẫu dầu gấc sau... của máy là lượng hoạt chất nhỏ nhất đưa vào máy để thu được pic sắc ký có chiều cao gấp 3 lần độ nhiễu đường nền ở độ nhạy tối đa có thể được khi vận hành 28 Kết quả giới hạn phát hiện lycopen và P -caroten như sau: - Lycopen: 0,33ụ,g/mL - Betacaroten: 0,54|ig/mL 2.1.4.2 Giới hạn định lượng (LOQ) Chuẩn bị mẫu chuẩn dung dịch hỗn hợp lycopen và (3 -caroten có nồng độ lần lượt là 2,21 Ịj,g/mL và 1,33 |J.g/mL . Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời p -caroten và lycopen trong dầu gấc ” với mục tiêu cụ thể sau: - Xây dựng một quy trình kỹ thuật thích hợp để định lượng đồng thời [ 3- '■ - - — _ ___________________ _ _______ _ _______________ J caroten. - — _ ___________________ _ _______ _ _______________ J caroten và lycopen trong dầu gấc. - ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng |3 -caroten và lycopen trong nguyên liệu dầu gấc. 1 PHẦN 1: TỎNG QUAN 1.1. DẦU GẤC 1.1.1. Nguồn gốc và đặc. is.EQjgs’ PHẠM THỊ QUỲNH HOA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐổNG THÒI LYCOPEN VÀ BETA- CAROTEN TRONG DẦU GẤC Oleum momordỉcae (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 200 2- 2007) Người hướng dẫn : Th.s