Y học thực hành (764) - số 5/2011 86 Nam. Kết quả PCR trên một nhóm gồm 75 bệnh nhân cho độ nhậy là 92% và độ đặc hiệu là 100% và các phản ứng PCR trên ADN sinh thiết của một nhóm bệnh nhân khác gồm 38 bệnh nhân cho độ nhậy là 82% và độ đặc hiệu là 100%. Cặp mồi cagA có thể sử dụng để phát hiện vi khuẩn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao TàI liệu tham khảo 1. Marshall, B. F and Warren J. R (1984). Unidentified curved bacilli in the stomach of patient with gastritis and peptic ulceration. Lancet, pp 311 - 315. 2. Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Thanh Lợi (2001). Sự tồn tại của các chủng Helicobacter pylori khiếm khuyết gene urease B ở các bệnh nhân viêm loét và ung th dạ dày Việt Nam. Đại hội lần thứ hai hội nghị khoa học hoá sinh y dợc năm 2001- Các báo cáo khoa học. Trang106 -113. 3.Trần Quỳnh Hoa., Lê Băng Sơn, Nguyễn Thị Thanh Lợi., Hoàng Tuấn Anh, Nguyễn Thị Nguyệt, Bùi Phơng Thuận, Đặng Đức Trạch và Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2001). Sự đứt đọan của hai nucleotide ở đầu 5 của gien cagA của vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng Việt Nam. Hội thảo quốc tế về Sinh học. Hà Nội- Việt Nam 2-5 tháng 6 / 2001. 4.Vũ Văn Hạnh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Xác định độ nhậy và tính đặc thù của cặp mồi PCR nhằm phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori (in press) 5. Nguyễn Thị Nguyệt và Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Tính nhậy và tính đặc thù của của hai cặp mồi PCR TH1 và TH2 trong phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori (in press) 6. Lê Băng Sơn và Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2001). Nghiên cứu vi khuần Helicobacter pylori, chủng Việt Nam. Hội thảo quốc tế về Sinh học. Hà Nội - Việt Nam 2-5 tháng 6/2001. Tr 414 - 417. ĐặC ĐIểM PHÂN Tử CủA VIRúT CúM A/H5N1 LƯU HàNH TạI MIềN BắC VIệT NAM, 2003-2008 LÊ QUỳNH MAI - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương TóM TắT Virút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 đã đợc ghi nhận không chỉ gây bệnh cho gia cầm mà còn gây bệnh viêm đờng hô hấp cấp nguy hiểm cho ngời. Trờng hợp nhiễm virút cúm gia cầm đầu tiên tại Việt Nam đợc xác định vào cuối năm 2003 và đến nay đã có 119 trờng hợp đợc ghi nhận trong đó 59 trờng hợp tử vong. Virút cúm gia cầm A/H5N1 có đặc điểm tiến hóa về di truyền học tơng tự các virút cúm A đã biết. Nghiên cứu của chúng tôi trên 23 chủng virút cúm gia cầm độc lực cao phân lập trên ngời tại miền Bắc Việt Nam, 2003-2008 cho thấy hầu hết các phân đoạn gen của virút cúm A/H5N1 nhóm vào 2 kiểu hình kháng nguyên là clade 1 và clade 2.3.4. Tuy nhiên gen NA lại biểu hiện trên 3 kiểu hình kháng nguyên là clade 1, clade 2.3.2 và clade 2.3.4 tơng tự với virút cúm gia cầm A/H5N1 lu hành trên gia cầm tại Việt Nam và Trung Quốc trong cùng thời gian. Từ khóa: virút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1, kiểu hình kháng nguyên, gen HA, gen NA. SUMMARY The highly pathogenic avian influenza (HPAI) A/H5N1 virus are causing of poultry outbreak as well as acute severe pneumonia in human. The 1 st confirmed A/H5N1 case was recognized in Vietnam in the end of 2003 and up to now, 119 confirmed cases were reported, of those 59 deaths. The genetic evolution of HPAI/H5N1 is similar known influenza A viruses and leaded to antigen changing that caused of endemic or pandemic so far. Our study analyzes 23 strains of A/H5N1 isolated from A/H5N1 patients in the North of Vietnam during 2003-2008 period by molecular characterization. The results showed that most of genetic fragments clustered into clade 1 and clade 2.3.4, however, the NA gen have diverged into clade 1, clade 2.3.2 and clade 2.3.4 that referred to poultry isolates in Vietnam and China at same period. Keywords: Highly pathogenic avian influenza (HPAI) A/H5N1 virus, clade, HA gene, NA gene ĐặT VấN Đề Virút cúm gia cầm độc lực cao H5N1 (HPAI/H5N1) đợc biết đến nh một tác nhân mới gây viêm đờng hô hấp cấp nặng có tỷ lệ tử vong cao. Trờng hợp nhiễm cúm A/H5N1 đầu tiên đợc ghi nhận tại Hồng Kong năm 1997 và xuất hiện tại Việt Nam vào cuối năm 2003 cùng với dịch bùng phát trên đàn gia cầm ghi nhận tại 59/63 tỉnh/thành trong cả nớc. Đến nay, virút cúm gia cầm A/H5N1 đã thờng xuyên xuất hiện trên đàn gia cầm và tiếp tục gây bệnh cho ngời. Tại Việt Nam, 119 ngời đã đợc xác định nhiễm virút cúm A/H5N1 và 59 ngời tử vong [3]. Virút cúm A với đặc tính tiến hóa nhanh do sự thay đổi vật liệu di truyền trong quá trình nhân lên đã ảnh hởng nhiều đến chiến lợc sản xuất vaccine toàn cầu, virút cúm gia cầm A/H5N1 cũng mang đặc điểm này. Tìm hiểu sự thay đổi về phân tử trong các vật liệu di truyền của virút cúm A/H5N1 phân lập trên ngời tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2003-2008 nhằm đánh giá khả năng tiến hóa của virút liên quan đến thay đổi về đặc điểm kháng nguyên và so sánh với các virút cúm A/H5N1 lu hành trên gia cầm trong cùng thời gian là mục đích nghiên cứu của chúng tôi. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu Hai mơi ba (23) chủng virút cúm A/H5N1 phân lập từ bệnh phẩm đờng hô hấp (dịch họng, dịch phế quản, dịch tỵ hầu) của các bệnh nhân nhiễm virút cúm A/H5N1 tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2003- 2008 (bảng 1). Toàn bộ quá trình phân lập virút cúm A/H5N1 đợc thực hiện tại phòng thí nghiệm (PTN) an toàn sinh học cấp độ 3 (BSL-3) tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng theo thờng quy của Tổ chức Y tế thế giới [4] Y học thực hành (764) - số 5/2011 87 Phơng pháp nghiên cứu Vật liệu di truyền của virút (ARN) đợc tách chiết từ nớc nổi nuôi cấy tế bào (Tissue Culture Fluid- TCF) bằng bộ sinh phẩm tách chiết ARN -QIAamp, Qiagen- Mỹ. Quy trình tách chiết thực hiện theo thờng quy của bộ sinh phẩm. - Sử dụng primer U12 (5-AGCAAAAGCAGG-3) để tổng hợp cADN từ ARN theo quy trình của bộ sinh phẩm SuperScript TM III reverse transcriptase (Invitrogen). - Sản phẩm cADN thu đợc sẽ đợc sử dụng để khuếch đại toàn bộ 8 phân đoạn gen của virút cúm A/H5N1 (HA; NA; NP; NS1; M; PB1; PB2 và PA) bằng phơng pháp PCR chuẩn khi sử dụng bộ sinh phẩm ProofStart DNA Polymersase (Qiagen- Mỹ) với DNA polymerase và các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi phân đoạn gen của virút cúm A/H5N1. - Sản phẩm PCR đợc tinh khiết bằng bộ sinh phẩm MinElute PCR Purification (Qiagen- Mỹ). Hỗn hợp sequencing bao gồm BigDye@ 3.1. Sản phẩm PCR cùng với các cặp mồi thích hợp. Phản ứng Sequencing thực hiện trên máy giải trình tự ABI 3100 (ABI, Foster City, Mỹ) và đợc kiểm tra trên cả hai đầu 3và 5. Trình tự chuỗi nucleotide đợc sắp xếp và thu thập bằng phần mềm SeqSpace 2.1 (ABI- Mỹ). - Cây gia hệ đợc xây dựng trên các thông số đã biết đợc xử lý bằng phần mềm ClustalW và dựng cây bằng phơng pháp Neighbor-Joining (NJ), độ tiến hóa đợc ớc tính toán theo chỉ số nhân lên của bootstrap (100 neighbor-joining bootstrap). KếT QUả NGHIÊN CứU Toàn bộ 8 phân đoạn gen của 23 chủng virút cúm A/H5N1 phân lập tại miền Bắc Việt Nam, 2003-2008 đã đợc phân tích sự tiến hóa về mặt di truyền. Các chủng virút cúm A/H5N1 Việt Nam cũng đợc so sánh với các chủng virút A/H5N1 đại diện lu hành trên thế giới trong cùng thời gian. Cây gia hệ của các phân đoạn gen đều lấy gốc là chủng virút cúm A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1). Chủng virút cúm A/H5N1 này phân lập trên ngỗng tại Miền Nam Trung Quốc đợc cho là tổ tiên của virút cúm A/H5N1 đang lu hành hiện nay [2]. Bảng 1: Các chủng virut cúm A/H5N1 phân lập tại miền Bắc Việt Nam 2003-2008. Tên chủng virut Ngày thu thập mẫu Địa chỉ Tình trạng bệnh nhân Loại bệnh phẩm A/Vietnam/UT3028/2003 12/2003 Ha Nam Tử vong DPQ a A/Vietnam/UT3028II/2003 12/2003 Ha Nam Tử vong DPQ A/Vietnam/UT3030/2003 12/2003 Nam Định Tử vong DPQ A/Vietnam/UT3035/2003 12/2003 Bac Giang Hồi phục DH b A/Vietnam/UT3040/2004 1/2004 Bac Ninh Tử vong DTH c A/Vietnam/UT3040II/2004 1/2004 Bac Ninh Tử vong DPQ A/Vietnam/UT3047III/2004 1/2004 Bac Binh Tử vong DTH A/Vietnam/UT3062/2004 1/2004 Bac Giang Tử vong DTH A/Vietnam/UT30259/2004 7/2004 Ha Tay Tử vong DPQ A/Vietnam/30262III/2004 8/2004 Ha Tay Tử vong DPQ A/Vietnam/UT30408III/2005 2/2005 Thai binh Hồi phục DTH A/Vietnam/UT30850/2005 10/2005 Ha Noi Tử vong DPQ A/Vietnam/UT31203A/2007 5/2007 Vinh Phuc Hồi phục DTH A/Vietnam/UT31239/2007 6/2007 Thanh Hoa Hồi phục DH A/Vietnam/UT31244II/2007 6/2007 Ha Nam Tử vong DTH A/Vietnam/UT31244III/2007 6/2007 Ha Nam Tử vong DTH A/Vietnam/UT31312II/2007 6/2007 Ha Tay Tử vong DPQ A/Vietnam/31388/2007 12/2007 Son La Tử vong DPQ A/Vietnam/UT31394II/2008 1/2008 Tuyen Quang Tử vong DPQ A/Vietnam/UT31412II/2008 2/2008 Hai Duong Tử vong DPQ A/Vietnam/UT31413II/2008 3/2008 Ninh Binh Tử vong DPQ A/Vietnam/31432/2008 4/ 2008 Phu Tho Tử vong DTH a : Dịch phế quản; b : Dịch hang; c : Dịch tỵ hầu Sự tiến hóa về di truyền của virút cúm A/H5N1 đợc ghi nhận thông qua các kiểu hình kháng nguyên (clade) đợc hình thành. Tại gen HA có 9 clade đã đợc hình thành và các virút cúm A/H5N1 phân lập trên ngời tại Việt Nam tập trung vào clade 1 và 2.3.4 (hình 1). Trên cây gia hệ của gen NA, sự khác biệt của các clade không rõ ràng, tuy nhiên có hai clade chính là clade 1 và clade 2 cũng đợc ghi nhận trong đó các virút cúm A/H5N1 của nghiên cứu đợc nhóm vào clade 1, clade 2.3.2 và clade 2.3.4 (hình 1). Tơng tự nh vậy, các gen còn lại M, NS, PB1, PB2., PA và NP, các virút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu cũng tập trung nhóm tại clade 1 và clade 2.3.4 (hình 2,3,4). 2.3.4 2.3.3 2.3.2 2.3.1 2.2 2.5 2.4 2.1 1 9 8 6 5 7 4 3 0 A/goose/Guangdong/1/96 0.005 Clade 2.2 Clade 2.1 Clade 2.3.4 Clade 1 A/Vietnam/HN31432M/2008 A/Viet nam/UT30850/2005 Clade 2.3.2 G V Z Gs/ GD X-series 20 aa deletion Gs/ GD B C W Z+ (no deletion) HK/97-like 19 aa deletion A/African starling/England/983/79 H7N1 0.01 Gen HA Gen NA Hình 1. Cây gia hệ gen HA và NA của virút cúm A/H5N1 lu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2003-2008 Y häc thùc hµnh (764) - sè 5/2011 88 Clade 2.3.4 Clade 1 Aquatic B C V Z Z+ H9N2 X-series Early Ck/Bei Gs/ GD Aquatic W G Early Early G1 Aquatic A/equine/Prague/1/1956 (H7N7) 0.02 Aquatic V (clade 2.3.4) H9N2 Gs/ GD B C G W Z Z+ (clade 1) Aquatic Early G1 Ck/ Bei X-series A/t urkey/England/N28/73 H5N2 0.01 Gen PB2 Gen PA H×nh 2. C©y gia hÖ gen PB2 vµ PA cña virót cóm A/H5N1 lu hµnh t¹i miÒn B¾c ViÖt Nam, 2003-2008 clade 2.3.4 clade 1 B G W V Z Z+ Gs/ GD H9N2 Outliers G1 Early Aquatic X-series Outliers Outliers Ck/Bei A/pintail duck/ALB/628/1979(H6N8) 0.02 Clade 2.3.4 Clade 1 G V X-series Z Z+ Aquatic W G1 B Gs/GD C Ck/Bei Early Early Early Early Aquatic A/equine/Prague/1/1956(H7N7)(8) 0.02 Gen PB1 Gen NP H×nh 3. C©y gia hÖ gen PB1 vµ NP cña virót cóm A/H5N1 lu hµnh t¹i miÒn B¾c ViÖt Nam, 2003-2008 Clade 2.3.4 A/Vietnam/HN31432M/2008 A/Vietnam/UT30850/ 2005 Clade 2.3.2 Clade 1 B C G W V Z Z+ X-series Gs/ GD Aquatic Aquatic Early G1 Ck/Bei A/equine/Prague/1/1956(H7N7)(8) 0.02 Clade 2.3.4 Clade 1 B C G W V Z Z+ Early Aquatic Aquatic X-series Ck/Bei G1 Gs/ GD 0.05 Gen M Gen NS H×nh 4. C©y gia hÖ gen M vµ NS cña virót cóm A/H5N1 lu hµnh t¹i miÒn B¾c ViÖt Nam, 2003-2008 Y học thực hành (764) - số 5/2011 89 BàN LUậN Sự tiến hóa về di truyền học của virút cúm A là một trong những đặc tính quan trọng của virút trong quá trình duy trì sự tồn tại của mình trên các vật chủ. Đặc tính này đã làm thay đổi đặc tính kháng nguyên giúp cho virút cúm A trốn khỏi các miễn dịch bảo vệ đã biết và tạo ra các vụ dịch hoặc đại dịch mới ảnh hởng lớn tới sức khỏe cộng đồng. Các vụ dịch hoặc đại dịch đã đợc ghi nhận trong suốt thế kỷ 20 nh đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918, đại dịch cúm Hồng Kông năm 1968 và gần đây nhất là đại dịch cúm A/H1N1/2009. Virút cúm gia cầm A/H5N1 đã vợt qua hàng rào loài gây bệnh cho một số động vật có vú khác nh ngựa, hổ và ngời Các đột biến về di truyền là nguyên nhân chính giúp virút cúm gia cầm A/H5N1 có thể vợt qua hàng rào loài và có thể là tiềm tàng của các vụ dịch/ đại dịch cúm cho ngời trong tơng lai. Nghiên cứu tìm hiểu sự tiến hóa thông qua việc phân tích đặc điểm vật liệu di truyền của virút cúm A/H5N1 phân lập trên ngời tại miền Bắc Việt Nam trong những năm 2003-2008 sẽ phần nào giúp tìm hiểu khả năng tiến hóa của virút và hiệu quả của vaccine (nếu có) để góp phần phòng bệnh có hiệu quả. Đặc điểm di truyền học trong kết quả của chúng tôi đã cho thấy: clade 1 và clade 2.3.4 tơng ứng với đặc tính kháng nguyên là các kiểu gen (genotype) chính lu hành trên các virút cúm A/H5N1 gây bệnh cho ngời tại miền Bắc cũng nh toàn lãnh thổ Việt Nam. Nghiên cứu của Wan và cs [5] trên toàn bộ các virút cúm gia cầm A/H5N1 lu hành tại Việt Nam trong giai đoạn 2001-2007 cho thấy có 9 loại kiểu gen (từ genotype 1 VN1 đến genotype 9 VN9) tơng đơng với 6 kiểu hình kháng nguyên (clade 0, clade 1, clade 2.3.2, clade 2.3.4, clade 3, và clade 5) nhng chỉ có clade 1 và clade 2.3.4 đợc ghi nhận gây bệnh cho ngời tại Việt Nam. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy trong hầu hết các phân đoạn gen của virút cúm A/H5N1 đều nhóm vào 2 nhóm chính là clade 1 và clade 2.3.4. Tuy nhiên tại gen NA các virút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu lại nhóm vào 3 phân nhóm chính là clade 1, clade 2.3.2 và clade 2.3.4. Kiểu hình 2.3.2 cùa virút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu này đợc ghi nhận tại các virút phân lập trên gia cầm tại Việt Nam và Trung Quốc trong cùng thời gian, kết quả trên cho phép nghĩ đến sự đột biến, trao đổi và tích hợp giữa virút cúm gia cầm A/H5N1 gây bệnh cho ngời và gia cầm vẫn đang tiếp tục, khả năng tiềm tàng xuất hiện một kiểu hình kháng nguyên mới là có thể [1]. Vì vậy, việc theo dõi, kiểm soát sự tiến hóa của virút cúm gia cầm A/H5N1 là một công việc cần thiết trong hoạt động phòng chống cúm gia cầm tại Việt Nam. KếT LUậN - 7 phân đoạn gen (HA, NP, M, NS, PB1, PB2 và PA) của virút cúm A/H5N1 đều thuộc 2 kiểu hình kháng nguyên là clade 1 và clade 2.3.4. - Phân đoạn gen NA virút cúm A/H5N1 biểu hiện trên 3 kiểu hình kháng nguyên là clade 1, clade 2.3.2 và clade 2.3.4 tơng tự với virút cúm gia cầm A/H5N1 lu hành trên gia cầm tại Việt Nam và Trung Quốc trong cùng thời gian. TàI LIệU THAM KHảO 1. Nguyen TD, Nguyen TV, Vijaykrishna D, Webter RG, Guan Y, Peiris MJS and Smith GJD (2008), Multipe sublineages of influenza A virus (H5N1), Vietnam, 2005- 2007, Emerg Infect Dis, 14, pp. 632-636. 2. Wallace RG, Hodac H, Lathrop RH, Fitch WM (2007), A statitistical phylogeography of influenza A H5N1, Proc Natl Acad Sci USA, 104, pp. 4473-4478. 3. World Heath Organization (WHO). Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO, 16 March 2011. Available: http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/ca ses_table_2011_03_16/en/index.html. Accessed 2011 March 18. 4. World Heath Organization (WHO). Recommendations and laboratory procedures for detection of avian influenza A (H5N1) virus in specimens from suspected human cases. Available: http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/ RecAIlabtestsAug07.pdf. Accessed 2011 March 17. 5. Xiu-Feng Wan, Tung Nguyen, C. Todd Davis, Catherin B. Smith, Zi-Ming Zhao, Margaret Carrel, Kenjiro Inui, Hoa T.Do, Duong T.Mai, Samadhan Jadhao, Amanda Balish, Bo Shu, Feng Luo, Micheal Emch, Yumiko Matsuoka, Stephen e Lindtrom, Nancy J Cox, Cam V Nguyen, Alexander Klimov, Ruben O. Donis (2008), Evolution of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza Viruses in Vietnam between 2001 to 2007, PloS ONE, 3 (10), e3462. NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM VI KHUẩN HọC ở Đờm và dịch rửa Phế quản qua nội soi Phế quản ống mềm ở bệnh nhân giãn phế quản lý tuấn hồng - Bệnh viện 354 đặt vấn đề Nớc ta là một nớc nông nghiệp, khí hậu nhiệt đới gió mùa, đang trong giai đoạn phát triển, tỷ lệ trẻ suy dinh dỡng còn cao. Vấn đề bụi, khí thải công nghiệp, chất thải của bệnh nhân (Bn) và ngời lành mang mầm bệnh, chất thải bệnh viện, cũng nh ý thức phòng bệnh của đại bộ phận ngời dân còn hạn chế nếu không muốn nói là còn kém. Do đó nhiễm khuẩn hô hấp, bệnh lao phổi, giảm không đáng kể, hậu quả là giản phế quản (GPQ) không giảm [1],. Các nớc kém phát triển trong đó có vùng Tây Nam Thái Bình Dơng và Đông Nam á, GPQ còn là nguyên nhân nhập viện, tàn phế và tử vong không