Đang tải... (xem toàn văn)
Phân tích coliform và e coli trong thực phẩm
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM Tiểu Luận Môn: VI SINH THỰC PHẨM Đề tài: Phân Tích Coliform Và E.Coli trong Thực Phẩm Giáo Viên Hướng Dẫn: Th.S Lưu Huyền Trang Nhóm : 07 (CDTP8LT-CDTP10TB) 1. Đỗ Văn Toản 08845384 2. Hoàng Thị Nguyệt 08835414 3. Nguyễn Thị Hà 08844884 4. Vương Thị Thủy MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Xung quanh chúng ta, ngoài các sinh vật lớn mà chúng ta có thể nhìn thấy được, còn có vô vàn vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kính hiển vi, người ta gọi chúng là vi sinh vật. Môn khoa học nghiên cứu về hoạt động sống của các vi sinh vật được gọi là Vi sinh vật học. Vi sinh vật học phát triển rất nhanh và đã dẫn đến việc hình thành các lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology), nấm học (Mycology), tảo học (Algology) virus học (Virolory), Việc phân chia các lĩnh vực còn có thể dựa vào phương hướng ứng dụng. Do đó chúng ta thấy hiện nay còn có y sinh vi sinh vật học, vi sinh vật học thú y, vi sinh vật công nghiệp, vi sinh vật học nông nghiệp. Vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, không khí, trên cơ thể các sinh vật khác, trên lƣơng thực, thực phẩm và các loại hàng hóa. Chẳng những thế, sự phân bố của chúng còn theo một hệ sinh thái vô cùng phong phú, đa dạng, từ lạnh đến nống, từ chua đến kiềm, từ háo khí đến kị khí, Do sự phân bố rộng rãi và do hoạt động mạnh mẽ nên vi sinh vật có tác dụng rất lớn trong việc tham gia các vòng tuần hoàn vật chất trên trái đất cũng như tham gia vào các quá trình sản xuất nông nghiệp. Trong thiên nhiên, vi sinh vật giữ những mắt xích trọng yếu trong sự chu chuyển liên tục và bất diệt của vật chất, nếu không có vi sinh vật hay vì một lý do nào đó mà hoạt động của vi sinh vật bị ngừng trệ dù chỉ trong thời gian ngắn, có thể nó sẽ làm ngưng mọi hoạt động sống trên trái đất. Hiện nay vi sinh vật là một môn khoa học mũi nhọn trong cuộc cách mạng sinh học. Nhiều vấn đề quan trọng của sinh học hiện đại như, nguồn gốc sự sống, cơ chế thông tin, cơ chế di truyền, cơ chế điều khiển học và các tổ chức sinh vật học, vi sinh vật học đang có những bước tiến vĩ đại, đang trở thành vũ khí sắc bén trong tay con người để nhằm chinh phục thiên nhiên phục vụ đắc lực cho sản xuất và đời sống. TỔNG QUAN VỀ COLIFORM VÀ E.COLI I. COLIFORM: 1. Định Nghĩa Coliforms là những trực khuẩn Gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370 o C trong 24 – 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vi sinh vật khác. 2. Đặc Điểm - Hình que, Gram (-), không bào tử - Lên men lactose sinh hơi - Nhiệt độ phát triển; (-) 2-50 o C - pH: 4.4-9.0 - Nguồn nhiễm: nước hoặc thực phẩm nhiễm phân - Loại tiêu biểu: E.Coli, Enterobacter aerogenes, Shigella II. Escherichia coli 1. Định Nghĩa - Thuộc họ Enterobacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), Gram(-) , trực khuẩn ngắn, không tạo bào tử. - Sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài - Có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit - Khả năng gây bệnh đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu; với cơ thể yếu gây nhiễm khuẩn máu; gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh; gây tiêu chảy. 2. Đặc Điểm. - Hình que, không tạo bào tử - Nhiệt độ phát triển: 7-50 o C, nhiệt độ thích hợp: 37 o C - pH thích hợp: 7.0-7.5 - Gây bệnh đường ruột, tiêu chảy, nhiễm khuẩn máu, viêm màng não…. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH COLIFORM VÀ E.COLI TRONG THỰC PHẨM PHƯƠNG PHÁP MOST PROBABLE NUMBER (MPN) THEO TCVN 6505-2:1999 Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Quy trình định lượng: Cho các ống nghiệm chứa môi trường dạng lỏng thích hợp với vi sinh vật cần xác định với 3 mức nồng độ:b 1/10, 1/100, 1/1000 mỗi mức 3 ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ với thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả nhìn thấy chứng minh sự tang trưởng của vi sinh vật cần kiểm định (thường là những hiện tượng như: sinh hơi, đổi màu, đục…) ghi nhân số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng MPN/100ml hay số MPN/gam. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng. Sử dụng môi trường BGBL ở 37oC có thể định lượng nhóm Coliform, cùng môi trường này ở 45oC cho phép định lượng Coliform trong phân. Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương nh ở từng độ pha loãng. Tra bảng Mac Crady Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định Pha loãng mẫu phân ch ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên @ếp. Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu 1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN: Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế phân tích, người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Lượng mẫu với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên. Vậy số liệu của bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi 1ml của các dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3được dùng để phân tích. - Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng tiếp theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng. Ví dụ: sử dụng 1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10- 2, 10-3. Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10. 2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E. COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN. Coliforms E.Coli 3. TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH Mẫu phân tích: Nước mía nguyên chất 3.1. Pha môi trường và dụng cụ Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích SPW (Saline Pepton Water) NaCl : 42.5g Pepton: 5g 500 ml nước cất LSB (LaurylSulphateBr oth) Tryptose: 20g Lactose: 5g Sodiumchloride: 5g KH 2 PO 4 : 2.75g K 2 HPO 4 : 2.75g Lauryl sulphate: 0.1g 1000 ml nước cất pH 6.8 ± 0.2 BGBL(Brilliant Green Bile Lactose Broth) Peptone: 10g Lactose: 10g Mật bò: 20g Brilliant green: 0.0133g 1000 ml nướccất pH 7.4 EC (E.coli medium) Trypticase or tryptose: 20g Muối mật No.3: 1.5g Lactose: 5g KH 2 PO 4 : 1.5g K 2 HPO4: 4g NaCl: 5g 1000 ml nước cất pH 6.9 EMB (Eosin Methylene Blue Agar) Pancreatic digest of gelatin: 10g Lactose: 10g K 2 HPO 4 : 2g Eosin Y: 0.4g Methylene blue: 65mg Agar: 15g 1000 ml nước cất. pH 7.1 ± 0.2 Tryptone water Tryptone hoặc trypticase:10g 1000ml nước cất pH 7.2 ± 0.2 MR-VP Both (Glucose Phosphate) Môi trường 1: Buffered peptone-water powder: 7g Glucose: 5g K 2 HPO 4 : 5g 1000ml nước cất. pH 6.9 ± 0.2 [...]... vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng 3.4 Bảng Tra MPN dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp KẾT LUẬN Phương pháp Most Probable Number (MPN) là phương pháp phổ biến và đạt hiệu quả trong việc xác định Coliform và E. Coli có trong thực phẩm Đây là phương pháp dựa trên bảng MPN để tìm ra có sự hiện diện của Coliform và E. Coli Phương...SCA (Simmons Citrate Agar) 3.2 Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 Sodium citrate: 2g NaCl: 5g K2HPO4: 1g NH4H2PO4: 1g MgSO4: 0.2g Bromothymol blue: 0.08g Agar: 15g 1000ml nước cất Đun nóng nhẹ và thỉnh thoảng lắc Đun sôi 1-2... dụng cụ và môi trường đã pha Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụngcụ, gắn nút và bao gói Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút Tiến hành phân tích Pha loãng mẫu: 3.3 a Ống Mẫu Cấy mẫu vào canh LSB Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ b Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng c Định lượng Coliform và E. Coli Định lượng Coliform. .. vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước tryptone Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24-48... gian tương đối dài và phương pháp thực hiện cũng tương đối phức tạp Các bước thực hiện đảm bảo phải đúng tránh không có sự nhầm lẫn trong các bước nếu không ta sẽ phải thực hiện làm lại từ đầu TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 2 3 4 Giáo trình phân tích Vi Sinh Thực Phẩm, Ths Lê Thùy Linh , Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM TCVN 6505-2:1999 Sữa và các sản phẩm từ sữa – định lượng E. Coli giả định bằng... mỗi độ pha loãng Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ ở 370C, 24 giờ Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh) (xem hình 4 ), cấy vào Trypton, MRVP, SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ d Thử nghiệm IMViC Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C (Anne Hanson, University of Maine, Orono) Ống A: dương... 370C trong khoảng 2-5 ngày Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay Thử nghiệm MR Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử (-) khi có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm Thử nghiệm Citrate (iC)... của indol, tạo ra Thử nghiệm Methyl Red (MR): Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH6.0 màu vàng Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth) Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn... indole trên môi trường tryptone Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi cho thuốc thử Barritt’s A và Barritt’s B Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc trong. .. Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu cơ Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ Thử nghiệm Indol Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường (-) lớp màu vàng của thuốc thử Đôi khi có sự xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa của