B ộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THUÝ HIỂN m NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TổNG HỢP « KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 27.222 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006) Người hướng dân Nơi thực hiện Thời gian thực hiện : PGS.TS. CAO VẢN THU Th.s. ĐỖ NGỌC QUANG : BỘ MÔN VI SINH - SINH HỌC : 2-5/2006 HÀ NỘI, 5/2006 m LỜI CẢM Ơ5V Với lòng biết cfn sâu sắc tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tớ i: Thầy giáo PGS.TS. Cao Ván Thu là người trực tiếp hướng dẫn tôi làm luận văn tốt nghiệp, đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này. Thầy giáo Th.s, Đố Ngạc Quang, thầy giáo Th.s. Nguyễn Đinh Luyện cùng các kỹ thuật viên thuộc bộ môn Vi sinh - sinh học và phòng thí nghiệm GMP đã nhiệt tinh giúp đỡ tôi trong thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên trong trường đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thcâ gian học tập ở trường cũng như trong thời gian thực nghiệm. Xin cảm cfn gia đình, bạn bè tôi, những người đă động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian qua. Do sự hiểu biết của bản thân chưa nhiều, luận văn còn nhiều điểm thiếu sót, rất mong sự chỉ bảo cuả thầy cô giáo và sự đóng góp ý kiến của bạn bè. Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2006. Sinh viên: OHíẬUiỊĨn ^h l ^ kittị 'Sôỉền MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN Đ Ề 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Kháng sinh 2 1.1.1. Lịch sử 2 1.1.2. Định nghĩa 2 1.1.3. Sơ đồ sản xuất kháng sinh 2 1.1.4. Phân loại kháng sinh 4 1.2. Đại cưoìig về Streptomyces 4 1.2.1. Một số đặc điểm chung của Streptomyces 4 1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chi Streptomyces 5 1.2.3. Phân loại Streptomyces 6 1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 7 1.3. Cải tạo giống vi sinh vật 7 1.3.1. Mục đích 7 1.3.2. Các phưoíng pháp giống cải tạo vi sinh vật 8 1.4. Lên men sinh tổng họrp kháng sin h 9 1.4.1. Lên men bề mặt 9 1.4.2. Lên men chìm 9 1.5. Chiết tách và tinh chế 11 1.5.1, Chiết xuất 11 1.5.2. Tách, tinh chế 12 1.6. Một sô' thành tựu trong nghiên cứu kháng sinh 13 1.6.1. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ Streptomyces sp 13 1.6.2. Sản xuất 8-Demethỵlgeldanamycin và 4,5-Epoxy-8- demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus 14 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KỂT q u ả 16 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiêm: 16 2.1.1. Nguyên vật liêu 16 2.1.2. Phưcíng pháp nghiên cứu 20 2.2. Kết quả thực nghiệiTi và nhận xét 27 2.2.1. Kết quả phân loại theo ISP 27 2.2.2. Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy và các v s v kiểm định của chủng Streptomyces 27.222 28 2.2.3. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 30 2.2.4. Kết quả đột biến bằng ánh sáng ư v 30 2.2.5. Kết quả lựa chọn dung môi chiết thích hợp 31 2.2.6. Kết quả lên men chìm 32 2.2.7. Kết quả chọn chủng có hoạt tính tốt khi lên men chìm 33 2.2.8. Kết quả thử ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bềti kháng sinh 33 2.2.9. Kết quả thử ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh 34 2.2.10. Kết quả thử kháng sinh nội b ào 34 2.2.11. Kết quả thử tác dụng chống nấm của kháng sinh 35 2.2.12. Kết quả sắc kí lớp mỏng 35 2.2.13. Kết quả chạy sắc ký cột 36 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 40 3.1. Kết luận 40 3.2. Đề xuất 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ADN AIDS A.nỉger B.cereus B.pumilus B.subtiìis Đ(mm) DMHC E.coli Gy Ha HIV KS MT MTdd N p .aeruginosa p.mừabỉỉỉs RA RF s s s. aureus s.flexneri S.lutea S.typhi Sm vsv Acid deoxyríbocucleic Acquired immonodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải). AspergHỉus niger Bacciỉlus cereus ATCC 9946 BacciUus pumiỉiỉs ATCC 10241 Bacciỉlus subtiỉìs ATCC 6633 Đường kính vòng vô khuẩn trung bình Dung môi hữu cơ Escherichia coli ATCC 25922 Grey (xám) Hair (có tóc) Human immunodeficiency virus (virus gây suy giảm miẽn dịch ở người) Kháng sinh Môi trường Môi trường dịch thể Pha nước Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabiỉis Retinaculiaperti (móc, xoắn đofn) Rectiflexibiles (thảng, uốn cong) Độ lệch chuẩn đã hiệu chỉnh Spirales (xoắn) Staphylococcus aureus Shigelìa fiexner Sarcìna ỉutea Salmonella typhi Smooth (nhẩn) Vi sinh vât ĐẶT VẤN ĐỂ « Hiện nay, với số lượng kháng sinh được tìm ra rất nhiều và nó vẫn đóng vai trò quan trọng trong việc phòng và điều trị các bệnh nhiễm trùng, thậm chí một số kháng sinh còn có phổ tác dụng đối với virus và tế bào ung thư. Tuy nhiên, do sử dụng không đúng cách và sự phát triển tự nhiên của v s v mà đã xảy ra hiện tượng kháng kháng sinh, việc điều trị các bệnh do một số chủng vi khuẩn nguy hiểm gây nên đã trở nên khó khăn hơn. Trước tình hình ấy, các nhà khoa học tiếp tục cải tạo các kháng sinh cũ và tìm kiếm kháng sinh mới để tâng hiệu lực điều trị các bênh nhiễm trùng. Sự phát triển của khoa học công nghệ đã góp phần giúp các nhà khoa học trong nghiên cứu, giữa các phucfng pháp nghiên cứu hiện đại như: tổng hợp, bán tổng hợp hoá học, thì công nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh vẫn là phưoíng pháp cơ bản để tìm kiếm kháng sinh mới, và tạo ra những ứng dụng có ích trong thực tế. Trong số hơn 8000 kháng sinh được tìm ra thì có hơn 60% kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra và chi Streptomyces đã được chứng minh là một chi xạ khuẩn có nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, với hoạt phổ đa dạng trên vi khuẩn, nấm và một số có khả năng kháng tế bào ung thư và HIV. Trên cơ sở đó, bộ môn Vi sinh - sinh học, đại học Dược Hà Nội đã tiến hành phân lập và nghiên cứu một số chủng Streptomyces có trong bùn, đất ở Việt Nam. Và Streptomyces 27.222 là chủng xạ khuẩn có độ ổn định di truyền học tốt, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, có tiềm nâng ứng dụng trong công tác phòng và điều trị bệnh nhiễm trùng. Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài: “ Nghiên cứu lén men sinh tổng hợp kháng sinh iừ Streptomyces 27.222 ” với mục tiêu: Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh bằng sàng lọc và đột biến cải tạo giống. Bước đầu nghiên cứu vể chiết tách và tinh chế kháng sinh. Xác định đặc điểm hình thái và sinh lý để phân loại, xác định tên khoa học của Streptomyces 27.222 theo khoá phân loại ISP. Phần 1 TỔNG QUAN 1.1. Kháng sinh [1] [2] [7] [10] 1.1.1 Lịch sử Kháng sinh đầu tiên được tìm ra là Penicillin. Năm 1928, khi Alexander Fleming trong khi nghiên cứu tụ cầu khuẩn, ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp Petri nuôi tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn, sau khi nghiên cứu ông xác định tên của loài mốc xanh đó là Penỉcilỉium notatum. Phát hiện của ông đã mở ra một kỷ nguyên mới cho nhân loại trong việc sử dụng kháng sinh để điều trị các bệnh nhân nhiễm trùng, là căn nguyên chính gây tử vong trong những năm trước đấy. 1.1.2. Định nghĩa Thuật ngữ kháng sinh theo quan niệm của các nhà sinh học được định nghĩa là những hợp chất hoá học do vsv tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vsv xác định (vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus) hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp. Ngày nay do thành tựu khoa học phát triển, kháng sinh không chỉ được tạo ra bởi các vsv mà còn được tạo ra bằng quá trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hoá học, do đó định nghĩa kháng sinh cũng thay đổi, hiện nay kháng sinh được định nghĩa như sau: Kháng sinh là những chất có nguồn gốc v sv hay các nguồn tự nhiên khác, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hoá học có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt v sv gây bệnh hoặc tế hào ung thư ỏ nồng độ thấp. 1.1.3. Sơ đồ sản xuất kháng sinh Lên men trong sản xuất kháng sinh thường được sản xuất theo quy trình như ỏ hình 1.1. Hình l.ỉ: Sơ đồ sản xuất kháng sinh 1.1 A Phân loại kháng sinh Phân loại kháng sinh có thể dựa vào: - Tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh. Cơ chế tác dụng của kháng sinh. Cấu trúc hoá học của kháng sinh. Trong đó phân loại theo cấu trúc hoá học là thường được sử dụng nhất, bao gồm các nhóm chính sau: • Nhóm ß lactam: gồm phân nhóm penicillin, cephalosporin, các p lactam khác. • Nhóm aminoglycosid ( aminosid); streptomycin, gentamycin, tobramycin • Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromycin, spiramycin • Nhóm lincosamid: lincomycin, clindamycin • Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol • Nhóm tetracyclin: tetrecyclin, doxycylin • Nhóm peptiđ: gồm phân nhóm glucopeptid (vancomycin) và phân nhóm polypeptid (polymycin, bacitracin). • Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin, ofloxacin • Nhóm co-trimoxazol: CO-trimoxazol. 1.2. Đại cương về Streptomyces [4] [5] [7] [10] [12] [13] 1.2.1. Một số đặc điểm chung của Streptomyces Streptomyces là một chi thuộc lớp phụ Atinomycetales phân bổ rất rộng rãi trong tự nhiên như: đất, nước, bùn ao và các chất thải hữu cơ. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram dương, hiếu khí hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty). Trong mỗi gam đất nói chung thường có trên một triệu xạ khuẩn (tính theo số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch). Số lượng xạ khuẩn trong một gam đất ở các mẫu đất khác nhau là khác nhau phụ thuộc vào độ ẩm, nhiệt độ, pH, dinh dưỡng Một số đặc điểm của xạ khuẩn: - Đường kính khuẩn ty xấp xỉ trong khoảng từ 0,2-1,0 Ịim đến 2-3 ịim. Màu sắc của khuẩn ty rất phong phú: trắng, vàng, đỏ lục, tím, nâu, đen - Thành tế bào xạ khuẩn dày khoảng 7,5-100 nm, không có cellulose, kitin. - Sinh sản vô tính bằng cách phân bào. - Nhuộm màu Gram dưoíng. Nhóm phân loại: Actinomycetales Actinoplanaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae Streptomyces Micromonospora Hình 1.2: Sơ đồ vị trí phân loại của Streptomyces 1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chi Streptomyces • Khuẩn lạc: - Bề mặt: thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ, vì vậy mới có tên là xạ khuẩn. - Khuẩn lạc có chân vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi cấy. • Khuẩn ty cơ chất: - Mọc sâu trong môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển. - Bề mặt nhẫn hoặc sần sùi. - Khuẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tô' chỉ tan trong dung môi hữu cơ. • Khuẩn ty khí sinh: khuẩn tỵ cơ chất phát triển một thòi gian thì dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh và có đường kính 1 - l,4iam. • Chuỗi bào tử: được hình thành từ khuẩn ty khí sinh, có nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, uốn cong hoặc xoắn lò xo. [...]... trạng thái sinh " lý của tế bào v s v cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng u v 1.4 L ên m en sin h tổn g hợp k h án g sinh [7] [10] Trừ một số rất ít các kháng sinh có thể tổng hợp toàn phần như chloramphenicol, hầu hết các kháng sinh hiện có đều là sản phẩm lên men hoặc bán tổng hợp Lên men là quá trình sinh học diễn ra liên tục, bát đầu từ khâu tạo giống nhân giống, sinh khối, lên men và... Streptomyces sinh tổng hợp đã được nghiên cứu và sử dụng, được trình bày ỏ bảng 1.1: Bảng 1.1: Một sô chủng Streptomyces sinh kháng sinh được ứng dụng Kháng sinh v s v sản xuất Phổ tác dụng Streptomycin s griseus Kháng khuẩn Tetracyclin s aureofaciens Kháng khuẩn Chloramphenicol s Venezuela Kháng khuẩn Oxytetracyclin s rimosus Kháng khuẩn Erythromycin s erythreus Kháng khuẩn Spiramycin s ambofaciens Kháng. .. 30,61 0,59 116,30 11 17 ,27 0,25 117,48 30,99 0,89 117,74 12 17,02 0,66 115,78 31 .27 0.09 118,80 13 17,00 0,20 115,65 30,98 1,00 117,70 Gốc 14,70 0,42 100,00 27, 39 2,87 100,00 chủng hoạt tính hoạt tính Dựa vào bảng kết quả trên chúng tôi lựa chọn các chủng có sự biến đổi hoạt tính kháng sinh cao để tiếp tục làm các nghiên cứu tiếp theo: 27. 222. 3.2; 27. 222 3 3 ; 27. 2223 .5; 27. 2223 7; 272 223.9 2.2.5 Kết quả... khí sinh Nhận xét: Qua bảng so sánh trên đây, về cơ bản chúng tôi kết luận Streptomyces 27. 222 có thể có tên là Streptomyces sỉnensis 2.2.2, Kết quả lựa chọn môi trường nuối cấy và các vsv kiểm định của chủng Streptom yces 27. 222, Để đánh giá ảnh hưỏfng của môi trường đinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của ^trepỉomyces 27. 222 và để chọn môi trường tốt nhất cho quá trình nuôi cấy và lên men, ... định kháng sinh nội bào Dịch lên men sau khi lọc, thu lấy sinh khối, rửa sạch bằng nước cất, lấy sinh khối sấy khô ở 50°c Cân lấy một lượng sinh khối nhất định, nghiền bàng dung môi hữu cơ chiết dịch lên men, tỷ lệ là 2 ml dung mồi: 1 mg sinh khối Dịch nghiền sinh khối đem thử hoạt tính kháng sinh nội bào bằng phưcmg pháp khoanh giấy lọc H Phương pháp lên men gián đoạn • Tạo giống cấp I: chủng giống Streptomyces. .. và 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin là những kháng sinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tạt hiên nay được sinh tổng hợp từ Streptomyces sp Phần 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT quả 2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm: 2.1.1 Nguyên vật liệu: • Chủng xạ khuẩn: Ca\ing(Steptomyc^ 272 22 do phòng thí nghiệm Vi sinh - Kháng sinh, bộ môn Vi sinh và sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp... công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất dừng ỏ pha nào trong chu kì sinh trưởng của v s v , hoặc khi việc sinh tổng hợp hoạt chất bắt đầu chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế mà thậm chí còn tăng lượng tạp trong sản phẩm thu được • Lên men bổ sung: Nồng độ cao của một số chất dinh dưỡng sẽ ức chế quá trình sinh trưởng và tạo ra... xét: Từ kết quả chọn lọc ngẫu nhiên trên đây, chúng tôi chọn ra các chủng có hoạt tính sinh kháng sinh cao để tiếp tục tiến hành các nghiên cứu tiếp theo : 272 22.1, 27. 222. 2, 27. 222. 3, 27. 222. 7 2.2.4 Kết quả đột biến bàng ánh sáng u v Tiến hành đột biến Streptomyces 272 22 bằng ánh sáng u v thu được kết quả sau: - Độ sống sót sau đột biến: 0,12% - Sàng lọc sau đột biến: tuyển chọn ngẫu nhiên được 36... dịch lên men hay sinh khối để tách lấy riêng chất kháng sinh (có thể là một chất hay một nhóm chất) • Phân loại: - Chiết đofn (chiết một lần) - Chiết lặp (chiết nhiều lần) - Chiết ngược dòng ( gồm chiết liên tục và bán liên tục) 1.5.2 Tách, tinh chẽ • Định nghĩa: Là một nhóm các phưcmg pháp nghiên cứu hoá học, vật lý, hoá lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến một hỗn hợp đcfn giản, từ một hỗn hợp đơn... vú từ Streptomyces hygroscopicus [14] Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã gây được sự thu hút bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức chế enzym sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng virus, kháng ung thư với IC50 là 13nM khi tiến hành test với dòng tế bào NCL Đặc tính kháng ung thư của gendanamycin là do gây ức chế mạnh ATP, làm bất hoạt sinh tổng hợp . “ Nghiên cứu lén men sinh tổng hợp kháng sinh iừ Streptomyces 27. 222 ” với mục tiêu: Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh bằng sàng lọc và đột biến cải tạo giống. Bước đầu nghiên cứu. tổng hợp kháng sinh của Streptomyces Một số kháng sinh do loài Streptomyces sinh tổng hợp đã được nghiên cứu và sử dụng, được trình bày ỏ bảng 1.1: Bảng 1.1: Một sô chủng Streptomyces sinh kháng. B ộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THUÝ HIỂN m NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TổNG HỢP « KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 27. 222 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006) Người hướng dân Nơi