Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp DHA trong artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI LỀ THÀNH LÂM NGHIÊN CỨU XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TẠP DHA TRONG ARTESUNAT NGUYÊN LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP bược SỸ KHOÁ 2000- 2005) ^ i - Người hướng dẫn: PGS.TS TRẦN ĐỨC HẬU Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Dược Thời gian thực hiện: tháng 10/2004-5/2005 Hà nội, tháng 5-2005 LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành khoá luận tốt nghiệp cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành tới: Thầy giáo PGS.TS TRẦN ĐỨC HẬU, chủ nhiệm bộ môn Hoá Dược đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ của bộ môn Hoá Dược đã giúp đỡ, khuyến khích, động viên tôi hoàn thành khoá luận. Xin được cảm ơn sự giúp đỡ của các bộ môn Phân Tích, Vô Cơ, phòng thí nghiệm Vật Lý trung tâm. Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Hà Nội, tháng 5 năm 2005 Sinh viên Lê Thành Lâm MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỂ 1 PHẦN 1: TỔNG Q U AN 3 1.1 Tổng quan về artesunat 3 1.1.1 Công thức 3 1.1.2 Nguồn gốc và cách điều chế 3 1.1.3 Tính chất 4 1.1.4 Tác dụng 5 1.1.5 Dược động học 5 1.1.6 Tác dụng không mong muốn 5 1.1.7. Chế phẩm 5 1.1.8 Chỉ định 5 1.2 Tổng quan về tạp DHA trong artesunat nguên liệu 5 1.2.1 Tạp DHA và nguyên nhân gây tạp DHA trong artesunat nguyên liệu 5 1.2.2 Tổng quan một số phươQg pháp xác đinh tạp chất liên quan trong thuốc, ưu nhược điểm, các phương pháp xác định tạp DHA 6 1.3. Tổng quan về HPLC 9 1.3.1 Khái niệm về sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng c a o 9 1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 10 1.3.3 Cơ sở lý thuyết sắc k ý 11 1.3.4 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống sắc k ý 11 1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và yếu tố ảnh hưởng 12 1.3.6 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc k ý 15 1.3.7 úhg dụng của H PL C 18 PHẨN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22 2.1 Đối tưọng, hoá chất, thiết bị, nội dung và phưotig pháp nghiên cứu. 22 2.1.1 .Đối tượng 22 2.1.2Phương tiện, dụng cụ, hoá chất 22 2.1.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23 2.1.4 Một số công thức sử dụng tính toán thống kê 23 2.2 Thực nghiệm và kết quả 24 2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện sắc ký 24 2.2.2 Thử tính thích hợp của hệ thống 25 2.2.3 Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệu 27 2.2.4Tínli chính xác của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệu 28 2.2.5 Tính đúng của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệu 29 2.2.6 Tính đặc hiệu của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệu 31 2.2.7 Xác định giới hạn định lượng DHA theo phương pháp xây dựng 34 2.2.8 Xây dựng cách xác định DHA trong nguyên liệu artesunat khi không có DHA chuẩn 35 2.2.9 Kết luận 38 Phần n i: Kết luận và đề xuất 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHỮ VIẾT TẮT DHA : Dihydro Artemisinin HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao NXB : Nhà xuất bản PA : Tinh khiết phân tích SKS : Số kiểm soát UV-VIS : Tử ngoại - Khả kiến VKN : Viện kiểm nghiệm ĐẶT VẤN ĐỂ rét là một bệnh nguy hiểm mang tính xã hội. Bệnh truyền từ người '^ n à y sang người khác do muỗi Anophen. Hàng năm trên thế giới có tới 300- 500 triệu trường hợp bị mắc sốt rét [18] trong đó có khoảng 2,7 triệu ca tử vong do sốt rét mỗi năm [23]. Những vùng có số người bị bệnh sốt rét cao là Châu Phi, Đông Nam Á, Việt Nam là một nước thuộc khu vực Đông Nam Á, và nằm trong vùng sốt rét lưu hành. Hàng năm nước ta có tới 1 triệu ca sốt rét trong đó có 30.000 ca sốt rét ác tính [11]. Việc điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn do ký sinh trùng sốt rét càng ngày càng kháng mạnh với các loại thuốc điều trị sốt rét trước đây như: Cloroquin, Mefloquin, Primaquin, [17]. Trong khoảng mười năm trở lại đây artemisinin (hoạt chất chiết từ cây Thanh Hao Hoa Vàng) và các dẫn chất của nó được đưa vào điều trị cho kết quả rất tốt, đặc biệt là dẫn chất artesunat. Đây là một thuốc cắt cơn sốt nhanh, ít bị tái phát như artemisinin, có tác dụng cả với chủng p.falciparum đã kháng Cloroquin. Thuốc qua được hàng rào máu não nên có tác dụng tốt trong điều trị sốt rét thể não [5]. Tuy vậy phương pháp kiểm tra chất lượng artesunat đang áp dụng ở nước ta còn rất nhiều hạn chế [12], [13], [14], [15], [16], Mặt khác artesunat lại đắt nên rất dễ bị làm giả. Vì là thuốc điều trị sốt rét nên thuốc giả hay kém phẩm chất rất nguy hiểm cho bệnh nhân. Theo một bài báo ở Đông Nam Á artesunat bị làm giả rất nhiều. Mỗi năm thế giói có khoảng 1 triệu người chết vì sốt rét trong đó có tới 200.000 người có thể cứu được nếu dùng đúng thuốc. DHA là một tạp chất chính trong artesunat. Mặc dù DHA là một thuốc điều trị sốt rét mạnh gấp 2 lần artemisinin nhưng tác dụng yếu hơn artesunat 2, 3 lần, DHA lại rất ít tan trong nước nên DHA là một nguyên nhân quan trọng làm giảm hiệu quả điều trị của artesunat [21]. Vì vậy xác định và khống chế hàm lượng DHA trong artesunat là rất quan trọng. Trong điều kiện khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, kỹ thuật phân tích HPLC đang được triển khai áp dụng rộng rãi ờ Việt Nam. Việc nghiên cứu và thực hành phương pháp HPLC đối với một Dược sỹ là rất cần thiết. Nằm trong mảng đề tài xây dựng phương pháp kiểm nghiệm artesunat bằng phương pháp HPLC, trong khoá luận tốt nghiệp của mình tôi tham gia cải tiến điều kiện sắc ký đã xây dựng trong khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học của Nguyễn Thanh Tùng (2004) để rút ngắn thời gian phân tích và xây dựng phương pháp xác định giới hạn DHA trong artesunat nguyên liệu với những mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu và sử dụng được máy HPLC để áp dụng phương pháp HPLC vào kiểm nghiệm trong thời gian làm khoá luận. 2. Học tập cách nghiên cứu, trình bày một vấn đề khoa học. 3. Xây dựng được phương pháp xác định tạp DHA trong nguyên liệu và đánh giá phương pháp vừa xây dựng. PHẦN 1: TỔNG QUAN I.ITỔNG QUAN VỂ ARTESUNAT l.l.lC ông thức [1], [7]. CO OH Công thức phân tử: CigHjgOg Trọng lượng phân tử: 384.4 TKH: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S,12R)- Decahydro-3,6,9-trimethyl-3,12- epoxy-12H-pyrano[4,3-j] 1,2-benzodioxepin-lO-ol,hydrogen succinat. 1.1.2 Nguồn gốc, cách điều chế + Nguồn gốc: Artemisinin phân lập từ cây Thanh Hao Hoa Vàng có tác dụng tốt trong điều trị sốt rét kể cả chủng đã kháng cloroquin. Tuy vậy, artemisinin khó tan và điều trị bằng artemisinin tái phát sớm mặc dù bệnh nhân sạch ký sinh trùng trong máu. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bán tổng hợp ra các dẫn chất của artemisinin có tác dụng tốt hơn là DHA, artemether, arteether, artesunat, artelinic. Trong đó artesunat có tác dụng tốt, tan trong dung dịch kiềm dùng để pha tiêm, điều trị bằng artesunat ít bị tái phát và vì vậy được dùng phổ biến hcfn cả. + Bán tổng hợp: Artesunat là sản phẩm bán tổng hợp của artemisinin qua sản phẩm trung gian là DHA. Trưòỉng Đại học Dược Hà Nội bán tổng hợp artesunat qua 2 giai đoạn như sau [9]: Giai đoạn 1; Artemisinin khử hoá nhóm lacton thành DHA bởi NaBH4/ MeOH ở 0°c - 5°c, phương trình: Giai đoạn 2: DHA được ester hoá thành artesunat khi tác dụng với anhydrit succinic hoặc acid succinic xúc tác là Dimethylamino Pyridin (DMPA) hay hỗn hợp DMPA và Dicyclohexyl Carbodiimid. Phương trình: o ọ / DMAP H31 COOH / ỘH2 / dmap ỉ ỉ o h / DDC C0-(CH2)2-C00H Từ công thức cấu tạo và phương pháp điều chế trên có thể thấy tạp chất chính có trong artesunat nguyên liệu là: DHA và acid succinic. 1.1.3 Tính chất Tinh thể không mầu hay bột kết tinh trắng, không mùi, dễ tan trong ethanol, aceton, cloroíorm, benzen, khó tan trong nước, kém bền trong môi trường kiềm hay acid. [a]°25= +10°+ 14° [1], [26]. 1.1.4 Tác dụng Diệt thể phân liệt trong máu của mọi chủng ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt tốt với sốt rét thể não do p.falciprum, không diệt thể giao bào và không tác dụng trên giai đoạn ngoại hồng cầu, cắt cơn sốt nhanh. 1.1.5 Dược động học Sinh khả dụng đường uống: 24-64%, tj/2= 41phút bị giảm hoạt tính do chuyển hoá qua gan; qua được hàng rào máu não và nhau thai; thải qua nước tiểu: dạng deoxy [2]. 1.1.6 Tác dụng không mong muốn: Nhẹ và thoảng qua: Rối loạn tiêu hoá, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt. 1.1.7 Chế phẩm: Có ba dạng: viên nén 50 mg artesunat, bột pha tiêm 60 mg artesunat, thuốc đạn 50 mg artesunat [8]. 1.1.8 Chỉ định: Điều trị sốt rét do p. falciparum, p. malaria, p. vivax, kể cả p.falciparum đã kháng thuốc khác[2]. 1.2 TỔNG QUAN VỂ TẠP DHA TRONG ARTESUNAT NGUYÊN LIỆU 2.1. Tạp DHA và nguyên nhân gây tạp DHA trong artesunat nguyên liệu Bản thân DHA là thuốc điều trị sốt rét mạnh hơn cả artemisinin. Tuy nhiên, trong artesunat thì DHA lại được coi như là tạp chất, mặt khác DHA rất ít tan, sinh khả dụng thấp, tác dụng kém hơn artesunat. Vì vậy nếu artesunat lẫn nhiều DHA thì hiệu lực điều trị của thuốc sẽ giảm, đồng thời DHA còn là chỉ thị cho mức độ tinh chế artesunat và cũng là yếu tố đánh giá bảo quản thuốc [19], [21]. Nguyên nhân chính gây tạp DHA trong nguyên liệu artersunat: - Tinh chế chưa tốt. - Sản phẩm phân huỷ của artesunat trong bảo quản. [...]... dụng, chú ý phương pháp xác định tạp DHA Phân tích các đặc tính của artesunat, DHA, acid succinic và phương pháp HPLC định lượng artesunat nguyên liệu của sinh viên Lê Thanh Tùng (2004) để tìm cách cải tiến các điều kiện sắc ký ❖ Tiến hành thực nghiệm để lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp và xây dựng phưcmg pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệu bằng HPLC b Đánh giá phương pháp vừa xây dựng: *>... y tế ■ DHA do bộ môn công nghiệp sản xuất đã tinh chế lại ■ Acid succinic chuẩn ■ KH2PO4: PA ■ K O H ; PA ■ MeOH, Acetonitril dùng cho HPLC ■ Chuẩn pH 6 ,88 ; pH 9,22 2.1.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu a Nghiên cứu và cải tiến phương pháp định lượng artesunat nguyên liệu để xây dựng phương pháp xác định tạp DHA trong nguyên liệu ♦ Tham khảo các phương pháp kiểm nghiệm artesunat nguyên liệu đang... đúng của phương pháp xác định DHA trong nguyên liệu artesunat Nguyên tắc: Vì nguyên liệu artesunat chưa xác định rõ hàm lượng DHA nên xác định tính đúng phải theo phương pháp thêm ở 3 mức nồng độ theo dãy nồng độ khảo sát là: 0,2% (0,008mg/ml), 1% (0,04mg/ml), 1,5% (0,06mg/ml) (từ kết quả khảo sát nguyên liêu có hàm lượng DHA khoảng 0,3 %) -Tiến hành: • Pha dung dịch chuẩn DHA: Cân chính xác khoảng... - 2% DHA so với nguyên liệu 2.2.4 Tính chính xác của phưoTig pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệu Xác định ờ nồng độ làm việc của DHA 100% là 0,04mg/ml (1% so với nguyên liệu) Tiến hành: Pha 6 mẫu thử DHA ở nồng độ 1% so với nguyên liệu, đồng thời làm mẫu chuẩn DHA tương đương, rồi sắc ký theo quy trình, lấy kết quả Cách pha: Cân lượng DHA chính xác khoảng 10,0 (mg) rồi pha trong bình định. .. quan về một số phương pháp xác định giói hạn tạp chất liên quan trong thuốc, ưu nhược điểm Các phương pháp xác định tạp DHA a Một số phương pháp xác định tạp chất liên quan trong thuốc và ưu nhược điểm ♦ Làm phản ứng bán định lượng (hay áp dụng đối vói tạp vô cơ) Lấy 2 ống nghiệm giống nhau để thực hiện phản ứng Ống 1 lấy chính xác 1 thể tích dung dịch thuốc đem thử Ống 2 lấy chính xác 1 thể tích dung... lấy chất c Định lưọtig và xác định giói hạn tạp chất; sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất Khi sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất chuẩn Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kỹ thuật HPLC là; • Phương pháp chuẩn... (mg) DHA chuẩn cho vào bình định mức 50 (ml) hoà tan và thêm dung môi đến vạch được dung dịch ( 1) (0,5mg/ml) lấy chính xác 5ml dung dịch ( 1) pha loãng thành 25 ml trong bình định mức 25 ml được dung dịch (2) ( 0,lmg/ml) • Pha dung dịch nguyên liệu artesunat 4m g/m l: Cân chính xác khoảng 0,1000(g) nguyên liệu artesunat pha trong bình định mức 25 ml, làm 5 mẫu, tiến hành sắc ký xác định DHA trong nguyên. .. khi đó hàm lượng của thành phần X tính theo công thức : %x= ^ ^— S,.F,+S^.F^+S,.F,+ prF , /= 1 Đây là phương pháp hay áp dụng để định lượng tạp chất trong thuốc Phương pháp này được chúng tôi chọn áp dụng để xác định tạp DHA • Cách xác định hệ số đáp ứng - Cách 1: Dựa vào phương trình tuyến tính ở nồng độ khảo sát của mỗi chất và tính ra hệ số đáp ứng theo biến đổi toán học Nếu chất A có phương. .. chứa hàm lượng chất chuẩn tạp bằng giới hạn cho phép của tạp đó trong chế phẩm.Sau đó cho vào mỗi ống, thuốc thử như nhau, số lượng như nhau rồi so sánh kết quả phản ứng ở 2 ống; từ đó xác định giói hạn tạp có trong mẫu thuốc đem thử Kết quả thường so sánh về mầu sắc, độ đục [3] Phương pháp này đơn giản, song chỉ cho kết quả bán định lượng ♦ Đo quang Nguyên tắc là làm phản ứng mầu đặc trưng của tạp. .. (As) đều nằm trong khoảng: 0,92,0 và RSD