ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Trần Lê Bảo Hà NGHIÊN CỨU XÁC LẬP QUY TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO SỪNG NGƯỜI TRÊN MÀNG COLLAGEN TỪ MÀNG ỐI HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG GHÉP TỰ THÂN ĐIỀU TRỊ CÁC TỔN THƯƠNG MẤT DA Chuyên ngành: Sinh lý học Người và Động vật Mã số: 62 42 30 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. BS. Trần Công Toại 2. TS. Hoàng Nghĩa Sơn Thành phố Hồ Chí Minh - 2010 LỜI CAM ĐOAN TÔI XIN CAM ĐOAN ĐÂY LÀ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA RIÊNG TÔI. NHỮNG KẾT QUẢ TRONG NGHIÊN CỨU NÀY HOÀN TOÀN CHƯA ĐƯỢC CÔNG BỐ BỞI BẤT KỲ TÁC GIẢ NÀO KHÁC. TRẦN LÊ BẢO HÀ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành công trình này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của những người thân, Thầy Cô, bạn bè, đồng nghiệp xung quanh. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với PGS. TS. BS. Trần Công Toại, người đã tạo cho tôi những điều kiện tốt nhất cũng như đã tận tình hướng dẫn giúp tôi hoàn thành luận án. Cảm ơn Thầy đã luôn nhiệt tình hỗ trợ, tạo nhiều thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với TS. Hoàng Nghĩa Sơn, người đã bỏ ra nhiều thời gian giúp tôi hoàn thành luận án. Sự cố vấn của Thầy là nguồn động viên không nhỏ giúp tôi vững bước trên con đường mà tôi đã chọn. Dành cho người luôn động viên, hỗ trợ và gắn bó với tôi từ khi tôi là sinh viên cho đến tận bây giờ và cả sau này, xin đặc biệt cảm ơn Thầy, ThS. Phan Kim Ngọc. Chân thành cảm ơn các anh chị, các em Bộ môn Mô phôi – Di truyền – Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Phạm Ngọc Thạch đã hỗ trợ, chia sẻ vui buồn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Chân thành cảm ơn các Thầy Cô, đồng nghiệp, các em thuộc Bộ môn Sinh lý học và Công nghệ Sinh học Động vật cũng như Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, đặc biệt là các em trong nhóm Vật liệu sinh học, đã luôn bên cạnh và hỗ trợ tôi trong suốt những năm qua. Cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Văn Út đã cho tôi những góp ý chân thành. Luận án này không thể hoàn thành nếu không nhận được nguồn cung cấp nguyên vật liệu. Qua đó, chân thành cảm ơn Bệnh viện Chấn thương Chỉnh hình đã cung cấp nguồn da và Bệnh viện Hùng Vương đã cung cấp màng ối để tôi có thể thực hiện đề tài này. Đề tài được hoàn thiện nhờ sự hỗ trợ kỹ thuật từ nhiều cá nhân và đơn vị. Xin cảm ơn Cô Thoa, Huy - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, anh Bình – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc đánh giá sản phẩm của đề tài. Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến các bác sĩ, kỹ thuật viên thuộc Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhi Đồng I và Trường Đại học Y Dược Tp.HCM đã hỗ trợ tôi trong việc phân tích kết quả mô học. Xa cách về địa lý nhưng rất gần về tấm lòng, xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đối với các chuyên gia Nhật Bản trong việc cố vấn, huấn luyện về mặt kỹ thuật cho tôi: GS. Hirotoshi Miyoshi và GS. Ookawa ở trường đại học Tsukuba, TS. Yuji Shirakata và TS. Lujun Yang thuộc trường đại học y Ehime và TS. Masahiro Kino_oka đến từ trường đại học Osaka. Lời cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với Ba Mẹ, Người đã nuôi nấng, dạy dỗ, luôn tin tưởng và cho tôi niềm thương yêu vô bờ. Cảm ơn các Anh Chị đã luôn yêu thương và dành cho tôi sự quan tâm sâu sắc. Cảm ơn Chồng, người đã cùng chia sẻ, luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi được song hành trên con đường tình yêu và sự nghiệp, là chỗ dựa vững chắc nhất của cuộc đời tôi. Cảm ơn Kirin, Sóc – hai con yêu của Mẹ Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2009 Trần Lê Bảo Hà CÁC CHỮ VIẾT TẮT AEC Amniotic epithelial cells ARN Acid ribonucleic bp Base pair CEA Cultured Epidermal Autograft DEPC Diethylpyrocarbonate DMEM Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline ECM Extracellular matrix EDTA Ethylene diaminetetraacetic acid EGF Epidermal Growth Factor EPU Epidermal proliferative unit FBS Fetal Bovine Serum FDA Food and Drug Administration G banding Giemsa banding HAM Human Amniotic Membrane HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis C virus HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid hESC Human embryonic stem cell HIV Human immunodeficiency virus HLA Human leukocyte antigen ISO International Organization for Standardization kGy Kilogray LSD Least Significant Different MMP Matrix metalloproteinase MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide PAS Periodic acid Schiff PCM Primary culture medium PCR Polymerase chain reaction PEDF Pigment epithelium-derived factor pH Hydrogen ion concentration PROM Premature rupture of the foetal membrane RT Reverse transcriptase SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Scanning Electron Microscopy SFM DK-SFM – Defined keratinocyte serum free medium SLPI Secretory leukocyte proteinase inhibitor TEM Transmission Electron Microscopy BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT Apoptosis Sự chết tế bào được lập trình Cultured Epidermal Autograft Ghép tự thân tấm biểu bì nuôi cấy Defined keratinocyte serum free medium Môi trường không chứa huyết thanh dành cho tế bào sừng Desmosome Thể liên kết Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Dung dịch muối đệm phosphat, không chứa ion Ca 2+ và Mg 2+ Epidermal Growth Factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì Epidermal proliferative unit Đơn vị tăng sinh biểu bì Epidermal stem cell Tế bào gốc biểu bì Extracellular matrix Khuôn ngoại bào Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bò Hemidesmosome Thể bán liên kết Hepatitis B virus Virus gây viêm gan B Hepatitis C virus Virus gây viêm gan C Human Amniotic Membrane Màng ối người Human embryonic stem cell Tế bào gốc phôi người Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở người Keratinocyte Tế bào sừng Label-retaining cell Tế bào giữ chất đánh dấu Ligand Phối tử Marker Yếu tố đánh dấu Polymerase chain reaction Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase Primary culture medium Môi trường nuôi sơ cấp Reverse transcriptase Enzyme phiên mã ngược Scaffold Khung nâng đỡ Transforming growth factor Nhân tố tăng trưởng chuyển dạng Transient amplifying cell Tế bào khuếch đại chuyển Transmission Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử xuyên DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ Bảng 1.1. Hiệu quả của các liều chiếu xạ gamma khác nhau lên khả năng ngăn thấm vi sinh vật của màng ối 12 Bảng 1.2. Tóm tắt các thử nghiệm lâm sàng sử dụng CEA trên thế giới 30 Bảng 3.1. Tóm tắt hiệu quả loại tế bào biểu mô HAM khi sử dụng trypsin/EDTA và cạo 61 Bảng 3.2. Kết quả kiểm nghiệm màng collagen 64 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của màng collagen đến sự thay đổi pH của môi trường SFM 65 Bảng 3.4. Thông tin về các mẫu da đã thu nhận 69 Bảng 3.5. Số tế bào sống và % tế bào sống sau khi phân lập 73 Bảng 3.6. Sự tăng sinh của tế bào sừng sau lần cấy chuyền thứ nhất 77 Bảng 3.7. Kết quả đo mật độ quang đánh giá sự tăng trưởng tế bào sừng trên màng collagen 83 Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào sừng sau lần cấy chuyền thứ nhất 78 Đồ thị 3.2. Đường cong tăng trưởng của tế bào sừng trên màng collagen thông qua kết quả đo mật độ quang 84 [...]... tới ứng dụng ghép tự thân điều trị các tổn thương mất da nhằm đạt các mục tiêu sau: 1 Xây dựng được quy trình chế tạo màng collagen từ màng ối người ứng dụng làm giá thể cấy tế bào 2 Xây dựng được quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào sừng người 3 Tạo được tấm tế bào sừng nhiều lớp trên giá thể collagen từ màng ối người CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3 1.1 MÀNG ỐI NGƯỜI Màng ối là một màng mỏng, dai, trong... có màng ối Thậm chí có nhiều tác giả còn đề xuất việc ứng dụng tế bào nuôi cấy trong việc điều trị Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có công trình khoa học nào về việc tạo vật liệu điều trị tổn thương mất da từ sự kết hợp tế bào nuôi cấy và màng ối được công bố tại Việt nam 2 Vì vậy tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu xác lập quy trình nuôi cấy tế bào sừng người trên màng collagen từ màng ối hướng tới ứng. .. thấy màng ối có hiệu quả trong tái tạo mô trong điều trị các tổn thương giác mạc 1.1.3.4 Ứng dụng màng ối trong điều trị tổn thương mất da Y văn đã ghi nhận có nhiều nghiên cứu ứng dụng màng ối trong điều trị tổn thương mất da Màng bọc thai bao gồm màng ối và màng đệm đã được sử dụng trong phẫu thuật từ năm 1910 bởi Davis trên da bị loét và bỏng Sau đó, nhiều nghiên cứu đã sử dụng màng ối như màng. .. nữa, màng ối còn có đặc điểm nổi bật là cấu tạo collagen của màng cơ bản tương tự màng cơ bản của da người Do đó, việc kết hợp giữa màng collagen từ màng ối và tế bào sừng của người được nuôi cấy để tạo ra tấm tế bào sừng nhằm ứng dụng ghép tự thân là một giải pháp khả thi trong điều trị các tổn thương mất da và bỏng Tại Việt nam đã có nhiều giải pháp điều trị các tổn thương mất da bằng các màng sinh... pháp ghép tấm tế bào nuôi cấy Công nghệ nuôi cấy tế bào là công nghệ hiện đại trong điều trị bỏng, tổn thương mất da, điều trị thẩm mỹ Trên thế giới, công nghệ này liên tục được nghiên cứu để hoàn chỉnh về quy trình công nghệ, về môi trường nuôi cấy Thông qua công nghệ nuôi cấy tế bào, nhiều nước trên thế giới đã đạt được những tiến bộ vượt bậc trong điều trị bỏng và tổn thương mất da, nhiều nạn... vài tế bào trãi rộng trên bề mặt đĩa nuôi Lớp nuôi dưỡng tự thân này hỗ trợ AEC bám dính, tiết ra các nhân tố duy trì AEC ở tình trạng không biệt hóa [101] Nhau thai Các tế bào màng ối Ghép trực tiếp tế bào vào mô Màng ối Biệt hóa Tế bào gan, gan Tế bào sừng, da Tiểu đảo, tụy Ghép bắt cầu trong viêm gan, xơ gan, tổn thương Tiểu đường loại 1 Chữa bỏng Hình 1.3 Minh họa vai trò của các tế bào tách từ màng. .. lựa loại màng ối sử dụng (nguyên hay trần) phụ thuộc vào tế bào hay mô sẽ ứng dụng 1.1.3.3 Ứng dụng màng ối trong điều trị tổn thương biểu mô giác mạc Hiện nay, màng ối người được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng để tái cấu trúc bề mặt biểu mô giác mạc, điều trị tổn thương biểu mô, bỏng hóa chất, suy giảm một phần các tế bào rìa, hội chứng Stevens-Johnson Màng ối được loại bỏ hoàn toàn lớp tế bào biểu... so với màng ối tươi vì các tế bào sống giảm đến 90% Điều này giúp các nhà nghiên cứu sử dụng màng ối bảo quản lạnh sâu hơn là màng ối tươi [88] 1.1.2.4 Đặc điểm gây chết tế bào được lập trình (pro-apoptosis) Màng ối tiết một số chất hoạt động như là tác nhân gây chết tế bào được lập trình Sự chết được lập trình của các đại thực bào hoạt hóa interferon- được màng ối kích thích do sự ngắt quãng các con... đáy Hình 1.8 Tế bào gốc biểu bì ở vùng sâu nhất và nông nhất trong da [33] 1.2.3.2 Các dạng tế bào trong quá trình biệt hóa của tế bào gốc biểu bì Trong quá trình biệt hóa, tế bào gốc biểu bì sẽ sinh ra các tế bào tế bào gốc con và những tế bào khác Trong đó tế bào khuếch đại chuyển là dạng trung gian của tế bào gốc và tế bào biệt hóa cuối cùng Tế bào gốc biểu bì Tế bào gốc biểu bì có các đặc tính:... sinh của tế bào và hạn chế tối thiểu các sai sót sao chép ADN [22], [89], [122] Các tế bào gốc biểu bì có sự phân chia bất ối xứng sinh ra hai tế bào con, một tế bào giống hệt tế bào gốc đang phân chia và một tế bào khuếch đại chuyển Sự phân chia bất ối xứng của tế bào do sự phân tách không đều của các yếu tố quy t định số phận tế bào (các protein hoặc mARN) cho mỗi tế bào con hoặc do sự đáp ứng chọn