ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  BÙI XUÂN HÀO NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO KHỐI U THỰC NGHIỆMCÂY TƠ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) VÀ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG (STREPTOCAULON JUVENTAS (LOUR.) MERR.) Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số chuyên ngành: 62 44 27 01 Phản biện 1: PGS TS TRẦN HÙNG Phản biện 2: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẠNH Phản biện 3: GS TS NGUYỄN KIM PHI PHỤNG Phản biện độc lập 1: PGS TS PHẠM THÀNH QUÂN Phản biện độc lập 2: PGS TS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TRẦN LÊ QUAN GS TS NGUYỄN MINH ĐỨC Tp Hồ Chí Minh-Năm 2013 MỞ ĐẦU Đã từ lâu, người ta biết rằng, ung thư bệnh hiểm nghèo, di tế bào ung thư nguyên nhân gây tử vong cho bệnh nhân Thông thường, ung thư điều trị phẫu thuật, xạ trị hóa trị, nhiên, nhiều trường hợp, sau điều trị, khối u tiếp tục phát triển di tế bào ung thư khơng bị tiêu diệt hồn tồn Các tia phóng xạ hầu hết thuốc dùng điều trị ung thư thường có tác dụng phụ, gây tổn hại đến tế bào lành thể; chúng thường gây hậu nghiêm trọng rụng tóc, ức chế hoạt động tủy xương, gây nơn mửa Vì thế, loại thuốc hỗ trợ điều trị ung thư hữu hiệu tìm kiếm Ngày nay, hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế phát triển khối u sử dụng cho kết điều trị tốt, chẳng hạn alkaloid từ dừa cạn, taxol từ thông đỏ, alkaloid từ trinh nữ hoàng cung Năm 2011, tác giả Marie Jensen cộng [29] cho biết năm gần đây, số hợp chất dẫn xuất cardenolid hợp chất bán tổng hợp từ dẫn xuất cardenolid hợp chất dùng để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư phổi Việt Nam nằm vùng nhiệt đới gió mùa nên có nguồn dược liệu dồi phong phú Y học cổ truyền Việt Nam từ lâu dùng cỏ để trị nhiều chứng bệnh khác Với mong muốn đóng góp phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành phần hóa học hoạt tính sinh học thuốc Việt Nam, luận án này, giới thiệu số kết nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học thử nghiệm hoạt tính sinh học chất tinh khiết cô lập từ rễ hà thủ ô trắng lõi gỗ thân tô mộc, hai thuốc nhà khoa học Việt Nam Nhật Bản khảo sát, cho thấy có độc tính mạnh dịng tế bào ung thư phổi, ung thư cổ tử cung… Nội dung luận án bao gồm: - Cơ lập hợp chất tinh khiết từ rễ hà thủ ô trắng lõi gỗ thân tô mộc - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất lập - Thử nghiệm độc tính tế bào hợp chất tinh khiết cô lập CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN s : mũi đơn (singlet) brs : mũi đơn bầu (broad singlet) brps : mũi giả đơn bầu (broad pseudosinglet) d : mũi đôi (doublet) dd : mũi đôi đôi (doublet – doublet) t : mũi ba (triplet) brd : mũi đôi bầu (broad doublet) m : mũi đa (multiplet) J : số ghép (coupling constant) SKC : sắc ký cột SKLM : sắc ký lớp mỏng PTLC : sắc ký lớp mỏng điều chế RP-18 : Reversed Phase C-18 LC-MS : sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy) MS : khối phổ (Mass Spectroscopy) HR-ESI-MS : High Resolution-Electro Spray Ionization-Mass Spectrometry UV : Ultraviolet Spectroscopy NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) HSQC : tương quan H-C qua nối (Heteronuclear Single Quantum Coherence) HMBC : tương quan H-C qua 2, nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) H-H COSY : tương quan H-H (H-H Correlation Spectroscopy) ROESY : Rotating-frame Effect Spectroscopy DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO : Dimetyl sulfoxid TMS : Tetrametylsilan Ac : Acetyl Me : Metyl M : khối lượng phân tử [α]D : Năng lực triền quang (Specific Optical Rotation) MeOH : Metanol MeCN : Acetonitril EtOAc : Etyl acetat Ac : Acetyl (CH3CO) SRB : Sulfohrodamin B Dig : β-D-digitoxopyranose Dtl : β-D-digitalopyranose Cym : β-D-cymaropyranose Glc : β-D-glucopyranose Rha : β-D-rhamnopyranose DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU Trang  DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây hà thủ trắng Hình 1.2 Rễ hà thủ trắng Hình 1.3 Hóa học lập thể khung cardenolid 13 Hình 1.4 Quả tô mộc 15 Hình 1.5 Thân tô mộc 15 Hình 3.1 Hóa học lập thể C-3 hợp chất cardenolid 42 Hình 3.2 Hóa học lập thể hợp chất H1 46 Hình 3.3 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H1 48 Hình 3.4 Hóa học lập thể hợp chất H2 50 Hình 3.5 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H2 50 Hình 3.6 Hóa học lập thể hợp chất H3 54 Hình 3.7 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H3 55 Hình 3.8 Hóa học lập thể hợp chất H4 58 Hình 3.9 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H4 58 Hình 3.10 Hóa học lập thể hợp chất H5 62 Hình 3.11 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H5 64 Hình 3.12 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H6 69 Hình 3.13 Tương quan H-H ROESY quan trọng H6 70 Hình 3.14 Hóa học lập thể hợp chất H7 73 Hình 3.15 Tương quan HMBC quan trọng H7 74 Hình 3.16 Hóa học lập thể hợp chất H8 77 Hình 3.17 Tương quan HMBC COSY quan trọng H8 78 Hình 3.18 Tương quan HMBC H-H COSY quan trọng H9 80 Hình 3.19 Hóa học lập thể hợp chất H9 81 Hình 3.20 Hóa học lập thể hợp chất H10 85 Hình 3.21 Tương quan HMBC quan trọng H10 85 Hình 3.22 Hóa học lập thể hợp chất H11 88 Hình 3.23 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H11 90 Hình 3.24 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H12 92 Hình 3.25 Tương quan H-H ROESY quan trọng H12 93 Hình 3.26 Hóa học lập thể hợp chất H13 97 Hình 3.27 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H13 97 Hình 3.28 Hóa học lập thể hợp chất H14 102 Hình 3.29 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H14 103 Hình 3.30 Hóa học lập thể hợp chất H15 105 Hình 3.31 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H15 107 Hình 3.32 Hóa học lập thể hợp chất H16 109 Hình 3.33 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H16 111 Hình 3.34 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng T1 114 Hình 3.35 Cấu trúc hợp chất sappanon A (T2) 115 Hình 3.36 Cấu trúc hợp chất sappanon B (T3) 117 Hình 3.37 Cấu trúc hợp chất 3-deoxysappanon B (T4) 120 Hình 3.38 Cấu trúc hợp chất brazilin (T5) 122 Hình 3.39 Tương quan HMBC quan trọng T6 124 Hình 3.40 Hỗn hợp hai xuyên lập thể phân T6 T7 126 Hình 3.41 Hóa học lập thể aglycon 127 Hình 3.42 Cấu trúc hóa học đơn vị đường 129 Hình 3.43 Cấu trúc hóa học hợp chất phenol 132  DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Cơ lập hợp chất có rễ hà thủ ô trắng 36 Sơ đồ 2.2 Cơ lập hợp chất có lõi gỗ thân tô mộc 37 Sơ đồ 2.3 Quy trình khảo sát độc tính tế bào phương pháp SRB 40  DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất cô lập từ rễ hà thủ ô trắng Bảng 1.2 Các hợp chất cô lập từ rễ Streptocaulon tomentosum Streptocaulon griffithii Bảng 1.3 Các hợp chất cô lập từ lõi gỗ thân tô mộc 17 Bảng 1.4 Các hợp chất cô lập từ hạt tô mộc 22 Bảng 2.1 Kết sắc ký cột cao clorofom rễ củ hà thủ ô trắng 30 Bảng 2.2 Kết sắc ký cột phân đoạn C-II cao clorofom 31 Bảng 2.3 Kết sắc ký cột pha đảo phân đoạn C-IIB 31 Bảng 2.4 Kết sắc ký cột phân đoạn C-IIB3 31 Bảng 2.5 Kết sắc ký cột pha đảo phân đoạn C-IIC 31 Bảng 2.6 Kết sắc ký cột pha đảo phân đoạn C-IIC2 32 Bảng 2.7 Kết sắc ký cột phân đoạn C-IIC2Y 32 Bảng 2.8 Kết sắc ký cột Diaion HP-20 dịch sệt nước rễ củ hà thủ ô trắng 32 Bảng 2.9 Kết sắc ký cột phân đoạn H-III 33 Bảng 2.10 Kết sắc ký cột phân đoạn IIIB 33 Bảng 2.11 Kết sắc ký cột pha đảo phân đoạn IIIB2 33 Bảng 2.12 Kết sắc ký cột phân đoạn IIIB2Y 33 Bảng 2.13 Kết sắc ký cột cao etyl acetat lõi gỗ thân tô mộc 34 Bảng 2.14 Kết sắc ký cột phân đoạn TM-IV 35 Bảng 2.15 Kết sắc ký cột pha đảo phân đoạn TM-IVC 35 Bảng 2.16 Kết sắc ký cột phân đoạn TM-IVC2 35 Bảng 3.1 So sánh số liệu phổ NMR H1 digitoxigenin 47 Bảng 3.2 So sánh số liệu phổ NMR H2 digitoxigenin 3-O--glucopyranosid 51 Bảng 3.3 So sánh số liệu phổ NMR H3 digitoxigenin 3-O--gentiobiosid 54 Bảng 3.4 So sánh số liệu phổ NMR H4 digitoxigenin -D-sophorosid 59 Bảng 3.5 So sánh số liệu phổ NMR H5 dẫn xuất cardenolid 63 Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR H6 68 Bảng 3.7 So sánh số liệu phổ NMR H7 acovenoxigenin A 72 Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H 13C-NMR H8 76 Bảng 3.9 So sánh số liệu phổ NMR H9, acovenosigenin A 3-Odigitalosid periplogenin 3-O-(4-O--glucopyranosyl-digitalopyranosid) 82 Bảng 3.10 So sánh số liệu phổ NMR H10 periplogenin 86 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR H11 periplogenin glucopyranosid 89 Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR H12 94 Bảng 3.13 So sánh số liệu phổ NMR H13 periplogenin 3-O-D-digitoxopyranosyl-(14)-O--D-glucopyranosid 98 Bảng 3.14 So sánh số liệu phổ NMR H14 periplogenin-3-O-βcymaropyranosyl-(14)-O--D-glucopyranosid 101 Bảng 3.15 So sánh số liệu phổ NMR H15 periplogenin-3-O-βdigitalopyranosyl-(14)-O-β-D-glucopyranosid 106 Bảng 3.16 So sánh số liệu phổ NMR H16 periplogenin 3-O-β(2-O-acetyl) digitalopyranosyl-(14)- β-D-glucopyranosid 110 Bảng 3.17 So sánh số liệu phổ NMR T1 sappanchalcon 113 Bảng 3.18 So sánh số liệu phổ NMR T2 sappanon A 115 Bảng 3.19 So sánh số liệu phổ NMR T3 sappanon B 117 Bảng 3.20 So sánh số liệu phổ NMR T4 3-deoxysappanon B 119 Bảng 3.21 So sánh số liệu phổ NMR T5 brazilin 121 Bảng 3.22 So sánh số liệu phổ NMR hợp chất T6, T7 protosappanin B, isoprotosappanin B 125 Bảng 3.23 Kết thử nghiệm gây độc tế bào dòng ung thư phổi NCI–H460, ung thư cổ tử cung Hela ung thư vú MCF–7 134 Bảng 3.24 Giá trị IC50 gây độc tế bào dòng ung thư phổi NCI–H460 135 Bảng 3.25 So sánh giá trị IC50 gây độc tế bào dòng ung thư phổi NCI–H460 dòng ung thư phổi A549 138 Bảng 3.26 So sánh thu suất cô lập hợp chất cardenolid 139 Bảng 3.27 So sánh thu suất cô lập hợp chất phenol 141 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VÀI NÉT CHUNG VỀ CHI STREPTOCAULON 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI STREPTOCAULON 1.2.1 Thành phần hóa học rễ hà thủ ô trắng 1.2.2 Thành phần hóa học thuộc chi Streptocaulon 1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG 11 1.3.1 Tính chất dược lý 11 1.3.2 Hoạt tính sinh học 11 1.4 ĐẠI CƯƠNG VỀ HỢP CHẤT CARDENOLID 12 1.4.1 Đại cương 12 1.4.2 Hóa học lập thể dẫn xuất cardenolid 13 1.4.2.1 Hóa học lập thể khung aglycon 13 1.4.2.2 Các đơn vị đường có dẫn xuất cardenolid 13 1.5 VÀI NÉT CHUNG VỀ CHI CAESALPINIA 14 1.6 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY TÔ MỘC 14 1.6.1 Thành phần hóa học lõi gỗ thân tô mộc 14 1.6.2 Thành phần hóa học hạt tô mộc 22 1.7 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY TƠ MỘC 23 1.7.1 Tính chất dược lý 23 1.7.2 Hoạt tính sinh học 23 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1.1 Phương pháp cô lập hợp chất 26 2.1.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 26   Hợp chất homoisoflavon Hợp chất chalcon Hợp chất brazilin Hợp chất dibenz[b,d]oxocin Hình 3.43 Cấu trúc hóa học hợp chất phenol Khi phân tích đặc điểm phổ nghiệm hợp chất phenol trên, chúng tơi có nhận xét sau: Hợp chất khung homoisoflavonoid: - Tín hiệu năm proton nhân thơm cộng hưởng dạng mũi đôi mũi đôi đôi, H khoảng 6,50-7,80, tương ứng với độ chuyển dịch hóa học carbon nhân thơm C khoảng 103,0-146,0 ppm Dựa vào giá trị số ghép J proton hình dạng mũi, xác định vị trí proton nhân thơm ghép orto, meta, para - Tín hiệu nhóm metylen gắn oxygen H-2 thường xuất dạng mũi đôi đôi khoảng 4,02-4,32 ppm, tương ứng với C-2 khoảng 67,0-74,0 ppm - Tín hiệu cộng hưởng proton metylen H-9 thường xuất dạng mũi đôi, khoảng 2,50-3,10, tương ứng với giá trị C C-2 khoảng 33,0-41,0 ppm - Tín hiệu cộng hưởng carbon carbonyl diện khoảng 180,0-195,0 ppm - Tín hiệu cộng hưởng carbon tứ cấp nhân thơm khoảng 110,0-170,0 ppm 132 Hợp chất khung brazilin: Đặc điểm tín hiệu cộng hưởng proton carbon hợp chất khung brazilin phổ NMR tương tự tín hiệu cộng hưởng proton carbon khung homoisoflavon Điểm khác biệt để phân biệt hai khung brazilin dẫn xuất brazilin, có diện tín hiệu cộng hưởng mũi đơn metin H-12, khoảng 4,00 ppm, tương ứng với carbon C-12, khoảng 51,0-52,0 ppm Ngoài ra, phổ NMR brazilin dẫn xuất brazilin không cho thấy diện carbon carbonyl Hợp chất khung chalcon: Đặc điểm tín hiệu proton carbon hợp chất sappanchalcon dẫn xuất sappanchalcon phổ NMR tương tự tín hiệu cộng hưởng proton carbon khung homoisoflavon; điểm khác biệt rõ để phân biệt hai khung sappanchalcon dẫn xuất sappanchalcon, có diện tín hiệu dạng mũi đôi hai proton metin olefin, vị trí trans nhau, với số ghép J 15,5 Hz Ngồi ra, phổ sappanchalcon khơng cho thấy diện hai nhóm metylen phổ hợp chất homoisoflavon brazilin Hợp chất khung dibenz[b,d]oxocin: Đặc điểm tín hiệu proton carbon hợp chất khung dibenz[b,d]oxocin phổ NMR tương tự tín hiệu proton carbon khung homoisoflavon, phổ hợp chất khung dibenz[b,d]oxocin thường không cho thấy diện carbon carbonyl Ngoài ra, hợp chất dibenz[b,d]oxocin, C-7 thường gắn nhóm -CH2OH, -OCH3, nên phổ HMBC thường xuất tương quan proton nhóm với C-6 C-8 Nhờ vào đặc điểm này, phân biệt khung dibenz[b,d]oxocin homoisoflavon 133 3.6 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH TẾ BÀO 3.6.1 Hoạt tính gây độc tế bào Các hợp chất cô lập từ dịch chiết metanol rễ hà thủ ô trắng tô mộc thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp SRB ba dòng tế bào ung thư ung thư phổi NCI-H460, ung thư cổ tử cung Hela ung thư vú MCF–7 nồng độ 100 g/ml (được trình bày bảng 3.24) Một vài hợp chất cô lập được, có khối lượng q nhỏ nên khơng đủ mẫu thử nghiệm độc tính tế bào Với hợp chất có khối lượng đủ lớn, thử nghiệm độc tính dịng tế bào ung thư phổi NCI-H460 để tìm giá trị IC50 (được trình bày bảng 3.25) Bảng 3.23 Kết thử nghiệm gây độc tế bào dòng ung thư phổi NCI–H460, ung thư cổ tử cung Hela ung thư vú MCF–7 (Nồng độ 100 µg/ml) Tỉ lệ (%) gây độc tế bào STT Ký hiệu mẫu NCI-H460 HeLa MCF–7 H1 89,61 ± 0,60 80,54 ± 6,40 77,66 ± 4,90 H2 89,30 ± 0,50 84,51 ±4,50 74,48 ± 6,50 H3 88,67 ± 2,05 75,94 ± 3,66 85,31 ± 3,47 H4 89,79 ± 0,70 86,68 ± 2,60 73,06 ± 6,40 H5 89,66 ± 0,7 77,35 ± 4,9 75,17 ± 7,2 H6 72,85 ± 5,00 80,86 ± 0,99 71,09 ± 5,18 H7 89,19 ± 1,00 82,92 ± 3,50 71,66 ± 4,70 H8 85,77 ± 0,45 83,28 ± 1,24 76,11 ± 3,84 H10 89,66 ± 0,5 73,75 ± 3,70 69,56 ± 2,60 10 H11 89,25 ± 0,30 84,02 ± 2,10 72,86 ± 7,40 11 H12 71,87 ± 2,31 60,16 ± 0,48 47,72 ± 5,77 12 H13 87,33 ±2,45 69,54 ± 5,52 83,88 ± 3,15 13 H14 87,54 ± 1,02 80,60 ± 1,58 74,60 ± 5,70 14 H15 87,99 ± 1,85 73,69 ± 4,41 80,83 ± 3,53 15 T1 86,95 ± 1,07 94,32 ± 4,33 93,62 ± 1,41 16 T2 98,96 ± 0,34 97,09 ± 3,30 97,68 ± 0,51 134 17 T3 80,89 ± 0,70 41,36 ± 2,80 48,85 ± 3,50 18 T4 90,26 ± 0,6 68,16 ± 6,7 77,21 ± 4,3 19 T5 12,52 ± 1,51 5,38 ± 1,38 9,38 ± 1,75 20 T6 + T7 58,00 ± 2,80 11,99 ± 1,70 16,97 ± 10,90 Chứng dương Camptothecin 77,90 ±2,30 49,57 ±1,25 (ở µg/ml) 47,00 ±1,86 Bảng 3.24 Giá trị IC50 gây độc tế bào dòng ung thư phổi NCI–H460 (*) IC (µM) 50 STT Mẫu Lần Lần Lần TB ± ĐLC H1 0,246 0,251 0,273 0,257 ± 0,014 H2 0,017 0,017 0,016 0,017 ± 0,001 H5 0,037 0,037 0,041 0,038 ± 0,002 H7 0,154 0,128 0,179 0,154 ± 0,026 H10 0,282 0,256 0,487 0,342 ± 0,127 H11 0,065 0,062 0,077 0,068 ± 0,008 T4 34,010 26,780 44,970 35,250 ± 9,160 Ghi chú: (*) chứng dương dùng thử nghiệm IC50 camptothecin 3.6.2 Nhận xét hoạt tính gây độc tế bào 3.6.2.1 Nhận xét thử nghiệm in vitro hoạt tính gây độc tế bào Qua kết thử nghiệm sàng lọc in vitro độc tính tế bào, chúng tơi có nhận xét sau: - Mười bốn hợp chất cardenolid cô lập từ rễ hà thủ ô trắng thử nghiệm cho thấy có độc tính tế bào sàng lọc thơ ba dịng ung thư, ung thư phổi NCI–H460, ung thư cổ tử cung Hela ung thư vú MCF–7 - Nhìn chung, độc tính hợp chất cardenolid dòng ung thư phổi NCI– H460 mạnh hai dòng tế bào ung thư lại ung thư cổ tử cung Hela ung thư vú MCF–7 135 - Dẫn xuất glycosid cardenolid có ba đơn vị đường digitoxigenin 3-O-[-Dglucopyranosyl-(16)--D-glucopyranosyl-(14)--D-2-O-acetyldigitalosid] (H6) có độc tính dịng tế bào ung thư phổi NCI–H460 yếu so với dẫn xuất aglycon glycosid cardenolid khác; đó, hợp chất digitoxigenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(16)--D-glucopyranosyl-(14)--Dcymaropyranosid] (H5), lại có độc tính mạnh hợp chất H6 dòng tế bào ung thư phổi NCI–H460, điều giải thích cấu trúc đơn vị đường khác ảnh hưởng đến hoạt tính gây độc tính tế bào hợp chất - Hợp chất digitoxigenin 3-O--gentiobiosid (H3), digitoxigenin -D-sophorosid (H4) có cấu trúc phần aglycon phần đường hồn tồn giống nhau, khác cách gắn vị trí đơn vị đường thứ hai vào đơn vị đường thứ nhất, hợp chất H3 có độc tính tế bào dòng ung thư vú MCF–7 lớn dịng ung thư cổ tử cung Hela; đó, hợp chất H4 có độc tính tế bào dịng ung thư cổ tử cung Hela lớn dòng ung thư vú MCF–7, điều cho thấy vị trí khác đơn vị đường có ảnh hưởng đến hoạt tính gây độc tính tế bào chất - Hợp chất periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(14)--D-digitoxosid] (H13), periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(14)--D-cymaropyranosid] (H14), có cấu trúc tương tự nhau, có điểm khác biệt phần đường hợp chất H14 có thêm nhóm metoxy (đường cymarose) Kết thử nghiệm in vitro cho thấy H13 có độc tính tế bào dịng ung thư vú MCF–7 lớn dòng ung thư cổ tử cung Hela; với hợp chất H14 độc tính tế bào cho kết ngược lại, điều cho thấy nhóm metoxy đơn vị đường có ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất - Trong hợp chất cô lập từ thân tơ mộc, nhóm hợp chất homoisoflavon sappanchalcon (T1), sappanon A (T2), sappanon B (T3), deoxysappanon B (T4) cho thấy có độc tính tế bào dòng ung thư phổi NCI–H460, hai dòng ung thư cổ tử cung Hela ung thư vú MCF–7, có hợp chất T1 T2 cho thấy có độc tính, hợp chất phenol cịn lại có độc tính yếu Ngồi ra, brazilin 136 (T5) hỗn hợp gồm protosappanin B (T6), isoprotosappanin B (T7) cho thấy có độc tính yếu ba dịng tế bào ung thư Như vậy, nhận định sơ hợp chất phenol có thân tơ mộc, nhóm chất homoisoflavon có độc tính tế bào ba dịng ung thư nói Kết thử nghiệm sơ góp phần định hướng lập nhóm chất có hoạt tính sinh học thân tô mộc - So sánh cấu trúc T2 với T3, T2 với T4, chúng tơi có nhận xét khử nhóm -OH vị trí C-3 hợp chất homoisoflavonoid để tạo nối đôi C=C C-3 C-9 làm tăng hoạt tính hợp chất 3.6.2.2 Nhận xét giá trị IC50 Dựa vào kết giá trị IC50 thử nghiệm độc tính tế bào dịng ung thư phổi NCI–H460 (được trình bày bảng 3.25), chúng tơi có nhận xét sau: - Sáu hợp chất cardenolid thử nghiệm có độc tính mạnh dịng ung thư phổi NCI–H460, hợp chất 3-deoxysappanon B (T4) có độc tính yếu, yếu - Các monoglycosid cardenolid H2 H11 có độc tính tế bào mạnh aglycon cardenolid tương ứng Giá trị IC50 hợp chất digitoxigenin (H1), digitoxigenin glucosid (H2), periplogenin (H10), periplogenin glucosid (H11) 0,257 ± 0,014; 0,017 ± 0,001; 0,342 ± 0,127; 0,068 ± 0,008 M; qua cho thấy hợp chất H2 có độc tính mạnh gấp khoảng 15 lần so với hợp chất H1, hợp chất H11 có độc tính mạnh gấp khoảng lần so với hợp chất H10 Điều cho thấy gắn đơn vị đường glucopyranose vào khung aglycon làm tăng độc tính tế bào hợp chất - Hợp chất digitoxigenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(16)--D-glucopyranosyl(14)--D-cymaropyranosid] (H5) chứa ba đơn vị đường, có giá trị IC50 0,038 ± 0,002, cho thấy có độc tính mạnh gấp khoảng 6,5 lần aglycon tương ứng (H1) Điều cho thấy glycosid cardenolid gắn nhiều đơn vị đường có khả làm tăng độc tính tế bào - Các giá trị IC50 H1, H7, H10 cho thấy acovenosigenin A (H7) có độc tính mạnh gấp khoảng 1,6 lần digitoxigenin (H1), mạnh gấp khoảng 2,2 lần 137 periplogenin Như vậy, gắn nhóm hydroxyl vị trí C-1 khung aglycon làm độc tính tế bào tăng gắn vị trí C-5 khung aglycon Khi so sánh giá trị IC50 nhóm chúng tơi thực tác giả Ueda khảo sát năm 2003 (được trình bày bảng 2.6), cho thấy hợp chất cardenolid có độc tính mạnh dịng tế bào ung thư phổi người Bảng 3.25 So sánh giá trị IC50 gây độc tế bào dòng ung thư phổi NCI–H460 dòng ung thư phổi A549 STT Ung thƣ phổi N-460 IC50 (µM) Mẫu Ung thƣ phổi A549 IC50 (µM) TB ± ĐLC Digitoxigenin (H1) 0,257 ± 0,014 0,530 Digitoxigenin glucosid (H2) 0,017 ± 0,001 - glucopyranosyl-(14)--D-cymaropyranosid] (H5) 0,038 ± 0,002 0,016 Acovenosigenin A (H7) 0,154 ± 0,026 0,310 Periplogenin (H10) 0,342 ± 0,127 0,260 Periplogenin glucosid (H11) 0,068 ± 0,008 0,040 Digitoxigenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(16)--D- Trong q trình lập hợp chất từ cao metanol rễ hà thủ ô trắng, nhận thấy hợp thành phần chính, chiếm khối lượng lớn aglycon digitoxigenin (H1), acovenosigenin (H7) periplogenin (H10) Như vậy, chất xem “marker”, đóng vai trị định hoạt tính gây độc tế bào khảo sát sơ độc tính loại cao 138 3.7 NHẬN XÉT VỀ THU SUẤT CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT 3.7.1 Nhận xét thu suất cô lập hợp chất cardenolid Trong phần thử nghiệm độc tính tế bào, cho thấy hợp chất dẫn xuất cardenolid có độc tính dịng tế bào ung thư phổi người Thu suất cô lập nhóm chất cardenolid chúng tơi tác giả Ueda thực hiện,[60] trình bày bảng 3.27 Từ kết thu suất lập, chúng tơi có nhận xét sau:  Các hợp chất cardenolid chiếm hàm lượng thấp rễ hà thủ ô trắng  Cho đến nay, biết có hai sáu hợp chất cardenolid diện trong rễ hà thủ trắng, nhóm chất có hoạt tính sinh học  Thành phần thu suất cô lập hợp chất cardenolid nhóm chúng tơi Ueda thu từ rễ hà thủ ô trắng khác Điều giải thích thành phần hàm lượng hợp chất phụ thuộc vào thời điểm thu hái mẫu nguyên liệu tuổi (Ueda thu hái mẫu vào năm 2003, chúng tơi thu hái vào năm 2007) Ngồi ra, điều kiện thổ nhưỡng nơi sinh sống ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chất Bảng 3.26 So sánh thu suất cô lập hợp chất cardenolid Thu suất cô lập (%), (*) Hợp chất STT Chúng Ueda [60] Digitoxigenin 0,001750 0,000527 Digitoxigenin glucosid 0,000067 - Digitoxigenin 3-O- -gentiobiosid 0,000091 0,000686 Digitoxigenin  -D-sophorosid 0,000056 0,001034 Digitoxigenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(16)- -D0,000156 glucopyranosyl-(14)- -D-cymaropyranosid] - Digitoxigenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(16)- -D0,000044 glucopyranosyl-(14)- -D-2-O-acetyldigitalosid] - Acovenosigenin A 0,000875 139 0,000096 Acovenosigenin A glucosid 0,000065 - 1,14 -Dihydroxycard-20(22)-enolid glucopyranosyl-(14)- -D-digitalosid]) 0,000044 - 10 Periplogenin 0,002062 0,000283 11 Periplogenin glucosid 0,000081 0,000634 12 5,14 -Dihydroxycard-20(22)-enolid glucopyranosyl-(16)- -glucopyranosid] 0,000047 - 13 Periplogenin digitoxosid] 0,000069 - 14 Periplogenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -D0,000081 cymaropyranosid] - 15 Periplogenin digitalosid] 16 Periplogenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -D-20,000044 O-acetyldigitalosid] 17 Periplocymarin - 0,000917 18 Acovenosigenin A3-O- -digitoxosid - 0,000272 19 Digitoxigenin 3-O-[-glucopyranosyl-(16)-O-glucopyranosyl-(14)-3-O-acetyl- -digitoxopyranosid] - 0,0003724 20 Digitoxigenin 3-O-[ O--glucopyranosyl-(16)-O-glucopyranosyl-(14)-O--digitalopyranosyl-(14)-cymaropyranosid] - 0,001614 21 Digitoxigenin 3-O-[O--D-glucopyranosyl-(16)-O-D-glucopyranosyl-(14)--D-digitoxopyranosid] - 0,0007448 22 Echujin - 0,003755 23 Periplogenin digitalopyranosid) - 0,000376 24 Periplogenin 3-O- -digitoxosid - 0,004017 25 Corchorusosid C - 0,005120 26 Subalpinosid - 0,000176 3-O-[ -D- 3-O-[- 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -D- 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -D- 0,000042 3-O-(4-O- -glucopyranosyl-- (*) Thu suất lập tính khối lượng nguyên liệu khô ban đầu 140 - 3.7.2 Nhận xét thu suất cô lập hợp chất phenol Thu suất cô lập chất phenol tác giả Mai T T N.,[27] trình bày bảng 3.28 Bảng 3.27 So sánh thu suất cô lập hợp chất phenol Thu suất cô lập (%), (*) Hợp chất STT Chúng Mai T T N.[27] Sappanchalcon 0,000275 0,000884 Sappanon A 0,000325 - Sappanon B 0,000900 0,000544 Deoxysappanon B 0,000525 0,001142 Brazilin 0,006000 0,001795 Hỗn hợp protosappanin B isoprotosappanin B 0,007500 0,002169 (*) Thu suất cô lập tính khối lượng ngun liệu khơ ban đầu Từ kết thu suất lập, chúng tơi có nhận xét sau:  Hợp chất sappanchalcon hợp chất có khung homoisoflavon, sappanon A, sappanon B, deoxysappanon B, hợp chất có hoạt tính sinh học chiếm hàm lượng thấp lõi gỗ thân tơ mộc  Các hợp chất có hoạt tính sinh học yếu brazilin, protosappanin B, isoprotosappanin B chiếm khối lượng nhiều so với chất homoisoflavon Kết cho thấy, để cô lập hợp chất homoisoflavon với khối lượng đủ lớn dùng thử nghiệm độc tính tế bào dịng ung thư, thử nghiệm độc tính để xác định giá trị IC50, cần thực q trình lập chất lượng lớn cao thô ban đầu 141 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Luận án nghiên cứu hóa học thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng tế bào khối u thực nghiệm – tô mộc (Caesalpinia sappan L.) hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Lour Merr.) đạt kết sau:  VỀ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC Từ dịch chiết metanol bột rễ thô hà thủ ô trắng, lập 16 hợp chất tinh khiết, có hợp chất kiểm tra phần mềm Scifinder Các hợp chất là:  14-Hydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[-D-glucopyranosyl-(16)--D- glucopyranosyl-(14)--D-2-O-acetyldigitalosid] (H6)  1,14-Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[-D-glucopyranosyl-(14)--D- digitalosid] (H9)  5,14-Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[- D-glucopyranosyl-(16)--Dglucopyranosid] (H12) Bốn hợp chất lần cô lập từ dịch chiết metanol bột rễ thô hà thủ ô trắng là:  Digitoxigenin 3-O--glucopyranosid (H2)  Acovenosigenin A 3-O-β-D-glucopyranosid (H8)  Periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(14)--D-cymaropyranosid] (H14)  Periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(14)--D-2-O-acetyldigitalosid] (H16) Chín hợp chất dẫn xuất cardenolid biết, nhận danh xác định cấu trúc Từ dịch chiết metanol bột lõi gỗ thân tô mộc, cô lập hợp chất tinh khiết hỗn hợp gồm hai xuyên lập thể phân Các hợp chất thuộc nhóm chất phenol, trước công bố diện tô mộc tạp chí chuyên ngành 142  VỀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH TẾ BÀO Đã thử nghiệm sàng lọc sơ độc tính tế bào hai mươi hợp chất tinh khiết cô lập được, gồm mười bốn hợp chất dẫn xuất cardenolid sáu hợp chất phenol theo phương pháp SRB ba dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư phổi NCI–H460, ung thư cổ tử cung Hela ung thư vú MCF–7 Khi thử nghiệm độc tính dịng tế bào ung thư phổi NCI-H460 để tìm giá trị IC50 bảy hợp chất tinh khiết cô lập được, cho thấy giá trị IC50 sáu hợp chất cardenolid nhỏ, từ cho thấy chúng có độc tính mạnh dịng tế bào ung thư phổi NCI-H460 Ngồi ra, thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất homoisoflavonoid ba dịng tế bào ung thư nói thử nghiệm mới, lần thực hợp chất Tổng hợp hợp chất cô lập từ rễ hà thủ ô lõi gỗ thân tô mộc nêu đây: Digitoxigenin (H1) Acovenosigenin A (H7) Periplogenin (H10) Acovenosigenin A glucopyranosid (H8) 143 Periplogenin glucopyranosid (H11) Digitoxigenin glucopyranosid (H2) 1,14-Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O[-D-glucopyranosyl-(14)--Ddigitalopyranosid] (H9), hợp chất Digitoxigenin 3-O--gentiobiosid (H3) 5,14-Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O[-glucopyranosyl-(16)-glucopyranosid] (H12), hợp chất Digitoxigenin -D-sophorosid (H4) Periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl(14)--D-digitoxopyranosid] (H13) Periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl(14)--D-cymaropyranosid] (H14) 144 Periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl(14)--D-2-O-acetyldigitalopyranosid] (H16) Periplogenin 3-O-[-D-glucopyranosyl(14)--D-digitalopyranosid] (H15) Digitoxigenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(16)--D-glucopyranosyl-(14)--Dcymaropyranosid] (H5) Digitoxigenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(16)--D-glucopyranosyl-(14)--D2-O-acetyldigitalopyranosid] (H6), hợp chất Sappanchalcon (T1) Sappanon A (T2) 145 Sappanon B (T3) Deoxysappanon B (T4) Hỗn hợp protosappanin B (T6) isoprotosappanin B (T7) Brazilin (T5)  KIẾN NGHỊ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Cô lập hợp chất cardenolid với lượng lớn để thử nghiệm tìm giá trị IC50 dẫn xuất cardenolid thử nghiệm sơ độc tính tế bào dòng ung thư phổi Tiếp tục thử nghiệm độc tính tế bào dẫn xuất cardenolid dịng ung thư khác, thí dụ dịng ung thư ruột kết… Tiếp tục khảo sát, cô lập hợp chất homoisoflavon phân đoạn lại cao etyl acetat lõi gỗ thân tô mộc thử nghiệm độc tính hợp chất dòng tế bào ung thư 146 ... Tất L? ??i,[2] Việt Nam có loài Streptocaulon juventas (Lour .) Merr. , Streptocaulon horsfieldii Miq Streptocaulon kleinii W  Arn Cây hà thủ ô trắng có tên khoa học Streptocaulon juventas (Lour .) Merr. ,... STREPTOCAULON Các thuộc chi Streptocaulon nghiên c? ?u từ l? ?u chúng dùng l? ?m thuốc y học cổ truyền Cho đến nay, thấy có ba l? ??i Streptocaulon juventas (Lour .) Merr. , Streptocaulon tomentosum Streptocaulon... pseudosinglet) d : mũi đôi (doublet) dd : mũi đôi đôi (doublet – doublet) t : mũi ba (triplet) brd : mũi đôi b? ?u (broad doublet) m : mũi đa (multiplet) J : số ghép (coupling constant) SKC : sắc