Y HC THC HNH (856) - S 1/2013 26 pituitary function after brain injury induced hypopiyuitarism: A prospective 12 month study. JCEM 90: 6085 6092. 4. Bondanelli M, de Marinis L, Ambrosio MR, Monesi M, Valle D, Zatelli MC, Fusco A, Bianchi A, Farneti M & degli Uberti EC, (2004) Occurrence of pituitary dysfunction following traumatic brain injury, Journal of Neurotrauma 21: 685696. 5. Brooke AM, Kalingag LA, Miraki-Moud F, et al (2006). Dehydroepiandrosterone (DHEA) replacement reduces growth hormone (GH) dose requirement in female hypopituitary patients on GH replacement. Clin Endocrinol (Oxf) 65(5):67380. 6. Bushnik T, Englander J & Katznelson L (2007). Fatigue after TBI: association with neuroendocrine abnormalities. Brain Injury 21 559566. 7. F. Bernard1, J. Outtrim, D. K. Menon and B. F. Matta (2006). Incidence of adrenal insufficiency after severe traumatic brain injury varies according to definition used: clinical implications. British Journal of Anaesthesia 96 (1): 726 8. Ghigo E, Masel E, Aimaretti G, et al (2005), Consensus guidlines on screening for hypopituitarism following traumatic brain injury, Brain Injury 19:711 724. 9. Herrmann BL, Rehder J (2006). Hypopituitarism following severe traumatic brain injury. Experimental and Clinical Endocrinology and Diabetes 114 316321. 10. Kelly DF, Gaw Gonzalo IT, Cohan P, Berman N, Swedloff R, Wang C (2000), Hypopituitarism following traumatic brain injury and aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a preliminary report, Journal of Neurosurgery 93:743752. Kỹ THUậT NUÔI CấY Và BảO QUảN P.FALCIPARUM DàI NGàY TRONG PHòNG THí NGHIệM Lê Thành Đồng, Trịnh Ngọc Hải Vin St rột - KST - CT TP H Chớ Minh T VN Nhm ỏp ng nhu cu nghiờn cu khoa hc v thc hin cỏc th nghim ỏnh giỏ hiu lc ca cỏc thuc iu tr st rột, ng thi phc v cho cụng tỏc ging dy. Sau mt thi gian di thc hin vic nuụi cy, bo qun ký sinh trựng st rột Plasmodium falciparum trong phũng thớ nghim, Vin St rột - Ký sinh trựng - Cụn trựng TP. H Chớ Minh ó nghiờn cu, b sung hon thin cỏc ni dung k thut, cỏc thnh phn, tiờu chun, iu kin nuụi cy, bo qun v t chc biờn son thnh ti liu hng dn k thut nuụi v bo qun Plasmodium falciparum phũng thớ nghim. Ti liu ny ó c Hi ng Khoa hc k thut v cỏc chuyờn gia, cỏc nh khoa hc gúp ý v thng nht thụng qua. K THUT NUễI CY V BO QUN 1. iu kin phũng nuụi cy v trang thit b, dng c, vt t 1.1. iu kin phũng Phũng nuụi cy phi m bo din tớch lp t cỏc bung nuụi, cú li i, ni ng thao tỏc, cú iu ho khụng khớ, mỏy hỳt m v ốn cc tớm. 1.2. Trang thit b, dng c, vt t a) Trang thit b, dng c c nh: - Box vụ trựng, - T sy, t m, t lnh thng v t lnh sõu - Ni cỏch thu, ni hp, bỡnh ng nit lng - Phớch ỏ, cõn phõn tớch, mỏy o pH, kớnh hin vi - Mỏy ct nc 1 v 2 ln, bỡnh nuụi (dessicator), chai 20ml,100ml - T CO 2, mỏy ly tõm ln, nh; mỏy sy túc, l thy tinh 5ml - iu hũa khụng khớ, mỏy hỳt m, ốn cc tớm - Pipett eppendoft 5,10,100,200,500,1000àl - Qu búp cao su, pipett aid b) Vt t, dung mụi, húa cht tiờu hao: - Mng lc millipore kớch thc 0,22àl - Kim bm, bm tiờm 1, 2, 5 v 10 ml - Nit lng, mu mỏu, lam kớnh - Dung dch sulfocromic m c - Ethanol v methanol - Cht chng ụng: heparin 5000 IU - NaHCO3 5%, sorbitol 5%, RPHS, pH, bt RPMI 1640, glucoza - Giemsa vi dung dch m pH 7,2 - Gentamicine - NaOH, axit citric, natricitrat, NaCl 0,9%, glyxerol Lu ý: Cỏc hoỏ cht phi cú hn s dng v bo qun ỳng theo yờu cu. d) Cỏc loi mụi trng: - Mụi trng nuụi cy RPMI 1640 (gibco hoc sigma) - Mụi trng RP - Mụi trng y cú 10% huyt thanh (RPHS) - Mụi trng y (RPHS) - Hematocrit - Hepốs Tựy theo nhu cu m mua sm cỏc dng c, vt t, húa cht v mụi trng ỏp ng. 2. Nguyờn tc vụ trựng trong thu thp mu v nuụi cy 2.1. Nguyờn tc vụ trựng trong thu thp mu mỏu thc a - Ni tin hnh ly mỏu phi thoỏng v sch. - Tt c cỏc dng c dựng cho thc nghim phi vụ trựng. Sỏt trựng bng cn ethanol 70 o trc khi m cỏc l mụi trng v hoỏ cht. - Kim tra tt c cỏc dng c trc khi tin hnh th nghim, trỏnh dựng nhng dng c hng hoc khụng tt. Y HỌC THỰC HÀNH (856) - SỐ 1/2013 27 - Thao tác kỹ thuật phải đảm bảo vô trùng, tránh tạp nhiễm. - Rửa sạch tay bệnh nhân trước khi lấy máu bằng xà phòng và sát trùng bằng cồn ethanol 70 o . - Không dùng chung kim chích máu. - Để đề phòng các bệnh lây nhiễm qua đường máu (HIV, HBV…) phải dùng găng tay khi tiếp xúc với máu của bệnh nhân. Tránh máu dính vào da hoặc qua các niêm mạc mắt, mũi. Rửa tay trước và sau khi làm việc với xà phòng sau đó dùng ethanol 70 o để sát trùng. - Khi ly tâm các mẫu máu không dùng quá tốc độ cho phép tránh gây vỡ. - Khi vận chuyển các mẫu máu phải vặn chặt nắp cẩn thận và đựng trong túi nilon kín. - Tất cả các dụng cụ làm xong phải được rửa lại bằng xà phòng và sát trùng với ethanol 70 o - Những rác thải (kim, bơm tiêm, bông, các phiến nhựa đã dùng…) phải được để vào nơi qui định về chất thải y tế. 2.2. Nguyên tc vô trùng trong nuôi cy ti phòng thí nghim - Các dung dịch dùng trong nuôi cấy phải được lọc vô trùng qua màng lọc millipore 0,22µm và bảo quản ở 4 o C hoặc -20 o C tuỳ theo từng loại. - Tất cả dụng cụ thuỷ tinh phải được ngâm trong dung dịch sulfocromic đậm đặc ít nhất 3 giờ. Rửa sạch dưới vòi nước và ngâm trong nước cất (3 lần). Để khô và sấy vô trùng ở nhiệt độ 180 o C trong 30 phút. Đối với những nắp nhựa hoặc cao su hấp ướt ở 120-150 o C. Những dụng cụ bằng nhựa khác chỉ dùng 1 lần. Những dụng cụ đã được sấy, hấp phải để vào một tủ sạch riêng biệt. - Khi rửa các dụng cụ bằng thuỷ tinh phải đeo găng tay dày. Đeo kính và găng tay khi tiếp xúc với dung dịch sulfocromic đậm đặc. - Khi làm việc trong phòng vô trùng phải có áo choàng. Rửa tay, đeo găng và sát trùng bàn bằng cồn ethanol 70 o trước và sau khi làm việc. - Các pipett dùng trong nuôi cấy KST phải dùng quả bóp cao su hoặc pipett trợ giúp (pipett aid), không dùng miệng để hút. - Tất cả các dụng cụ bẩn đều được bỏ vào thùng đựng rác và chuyển ra khỏi phòng vô trùng sau khi đã làm xong. - Cuối ngày phải vệ sinh lại phòng và bật đèn cực tím qua đêm. 3. Các bước thực hiện 3.1. Bc 1: Chun b hng cu lành - Lấy 10ml máu tĩnh mạch nhóm O (hoặc A) cho vào tube, ly tâm có chứa chất chống đông: 0,25-0,3ml ACD cho 1 ml máu hoặc heparin (20 đơn vị / ml). - Trộn đều máu và ACD. - Ly tâm 2000 vòng/ 5 phút. Hút bỏ phần nổi. - Thêm môi trường RP (môi trường không có huyết thanh) vào cặn hồng cầu theo tỷ lệ 5:1 - Ly tâm 2000 vòng/ 5 phút. Hút bỏ phần nổi. Rửa 2 lần với môi trường RP. Lần thứ 3 rửa với môi trường đầy đủ có 10% huyết thanh (RPHS). - Trộn cặn hồng cầu với môi trường đầy đủ (RPHS) để có dịch treo 40% (4 ml cặn + 6 ml RPHS). - Chia vào các lọ nhỏ (2-3ml). - Ghi ngày lấy máu. - Bảo quản ở 4 o C trong vòng 30 ngày. - Kiểm tra vô trùng: Lấy 1 ít hồng cầu vừa rửa cho vào lọ có chứa 1ml môi trường RPMI, đặt vào tủ ấm 37 o C trong 24h. Nếu tủa trắng đục là nhiễm trùng, phải bỏ đi. 3.2. Bc 2: Chun b huyt thanh - Lấy 250ml máu nhóm O (hoặc AB với các chủng mới phân lập), không chống đông cho vào chai hoặc lọ thủy tinh vô trùng. - Để lọ nằm nghiêng (thể tích càng rộng, sự tách huyết thanh càng lớn). - Để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ, sau đó để tủ lạnh 4 o C qua đêm. - Dùng pipett nhẹ nhàng hút phần huyết thanh nổi ở trên chia vào các lọ nhỏ để tiện sử dụng (1,1ml/10 ml môi trường). Phần huyết thanh có lẫn hồng cầu chuyển vào tube ly tâm. Ly tâm 2.000 vòng trong 5 phút. Hút phần huyết thanh nổi ở trên chia vào các lọ nhỏ. - Ghi tên nhóm máu, số lượng và ngày tách trên lọ. - Kiểm tra vô trùng giống như với hồng cầu. - Tiệt trùng huyết thanh ở 56 o C trong 30 phút (đặt trong nồi cách thủy, chú ý không để nước ngập tới nắp của lọ). - Để nguội và bảo quản ở -20 o C trong vòng 30 ngày. 3.3. Bc 3: Chun b môi trng nuôi cy dài ngày - Môi trường RP để rửa hồng cầu Môi trường RPMI 10 ml NaHCO 3 5% 0,42 ml - Môi trường đầy đủ RPHS Môi trường RPMI 10 ml NaHCO 3 5% 0,42 ml Huyết thanh O (AB) 10% 1,2 ml Bảo quản ở 4 o C trong vòng 1 tuần. 3.4. Bc 4: Chun b hng cu nhim P. falciparum a) Thu thập trực tiếp từ bệnh nhân: - Sau khi khẳng định bệnh nhân nhiễm P.falciparum đơn thuần. Đếm mật độ ký sinh trùng, nếu trên 0,1% nuôi cấy sẽ thành công hơn. Lấy 1-2 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân chuyển vào lọ vô trùng đã có sẵn dung dịch chống đông. Lắc đều, ly tâm 2000 vòng trong 5 phút. - Hút bỏ phần nổi. Rửa 3 lần với môi trường đầy đủ RPHS. - Treo hồng cầu vào môi trường đầy đủ với hematocrit là 4%. - Chuyển hỗn dịch này vào đĩa nuôi hoặc lọ nuôi tùy theo kích thước của đĩa hoặc lọ nuôi: + Đĩa nuôi có đường kính 35mm cho vào 1,5ml hỗn dịch máu và môi trường. + Đĩa 60mm cho vào 4 ml hỗn dịch máu và môi trường. + Lọ có diện tích 25 cm2 cho 4 ml. + Phiến nhựa 24 giếng cho 0,5 ml. Y HỌC THỰC HÀNH (856) - SỐ 1/2013 28 - Xoay nhẹ đĩa nuôi cho máu phủ đều đáy. - Cho đĩa vào bình nuôi (Desicator), đốt nến đợi khi nến gần tắt khóa vòi của bình nuôi (5% O 2 , 5% CO 2 và 90% N 2 ). - Đặt bình nuôi vào tủ ấm 37 o C ± 0,5 o C. Chú ý: - Trường hợp thu thập máu ở xa phòng thí nghiệm, vận chuyển máu bằng cách: Lấy 5ml máu bệnh nhân cho vào lọ vô trùng có sẵn 5ml RPMI 1640 và 10µl heparin (lọ 5000 đơn vị / ml). Hỗn dịch này để ở nhiệt độ phòng trong vòng 8 giờ. Hoặc giữ trong nước đá 36 giờ nhưng chú ý không đặt tiếp xúc trực tiếp với đá. Sau đó tiến hành theo các bước như thu thập trực tiếp từ bệnh nhân. - Giữ máu trong đông lạnh (nitơ lỏng) bằng cách ly tâm mẫu máu 2000 vòng trong 5 phút. Hút bỏ phần nổi. Thêm đồng thể tích dung dịch đông lạnh vào cặn hồng cầu và chuyển vào tube đông lạnh. Ghi tên bệnh nhân hoặc số hiệu, ngày lấy máu rồi cho ngay vào bình nitơ lỏng. Khi có điều kiện sẽ lấy ra để nuôi cấy. b) Nuôi cấy các mẫu từ trong nitơ lỏng (phá đông) - Lấy các mẫu từ trong nitơ lỏng ra và làm tan đông bằng cách đặt tube máu vào nồi cách thuỷ 37 0 C trong 1-2 phút. - Chuyển máu đã được làm tan sang tube ly tâm. - Cho đồng thể tích dung dịch sorbitol 27% (nhỏ từng giọt và trộn nhẹ nhàng). - Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút. - Hút bỏ phần nổi. - Thêm sorbitol 5% vào cặn hồng cầu theo tỉ lệ (2:1). Trộn nhẹ nhàng sau khi nhỏ từng giọt. Rửa 2 lần với sorbitol 5%. - Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút. - Hút bỏ phần nổi. - Thêm RPHS vào cặn hồng cầu theo tỷ lệ 2:1 và rửa 3 lần. - Ly tâm 2000 vòng trong 5 phút. Hút bỏ phần nổi. - Treo hồng cầu vào môi trường đầy đủ (RPHS) với 20% huyết thanh để có dịch treo 4%. - Chia vào các đĩa hoặc lọ nuôi theo kích thước. 3.5. Bc 5: Thay môi trng (24giờ/ lần) Pha môi trường đầy đủ (RPHS) và đặt vào tủ ấm ít nhất 30 phút trước khi thay môi trường hàng ngày. Chú ý nếu pH của môi trường quá kiềm (chuyển thành màu hồng cánh sen phải bỏ đi và pha môi trường mới). Lấy bình nuôi ra khỏi tủ ấm, mở khóa bình, lấy các đĩa nuôi đặt lên mặt bàn của box vô trùng. 3.6. Bc 6: Làm tiêu bn lam, theo dõi KST hàng ngày - Nhẹ nhàng nghiêng đĩa nuôi tránh xáo trộn. Dùng pipett pasteur vô trùng, nhẹ nhàng hút bỏ phần môi trường ở phía trên (tránh hút hồng cầu ở phía dưới). - Dùng pipett vô trùng lấy khoảng 2-5 µl làm tiêu bản lam giọt đàn. Sau đó cho môi trường mới vào đĩa nuôi, lắc nhẹ để trộn đều máu và môi trường. Cho đĩa vào bình nuôi, đốt nến, khóa vòi và đặt vào tủ ấm 37 o C. - Khi lam khô, cố định bằng methanol tuyệt đối và nhuộm giemsa với dung dịch đệm pH 7,2. - Để lam khô tự nhiên hoặc dùng máy sấy tóc. 3.7. Bc 7: Soi lam và tính mt đ nhim KST (%) - Soi lam dưới vật kính dầu 100, thị kính 10. - Đếm hồng cầu nhiễm KST thể vô tính theo 2.000 - 3.000 hồng cầu (khoảng 10 vi trường). - Tính phần trăm hồng cầu nhiễm theo công thức sau: Số hồng cầu nhiễm KST đếm được / Tống số hồng cầu đếm được (cả nhiễm và không nhiễm) x 100. - Ghi kết quả vào sổ theo dõi hàng ngày. 4. Phụ lục 1. Pha hóa chất và môi trường cho nuôi cấy KST dài ngày 4.1. Môi trng RPMI 1640 (Gibco hoc Sigma) Bột RPMI 1640 10,4g Hepès 5,94g Glucoza 2,00g Gentamicine 0,04g Nước cất 2 lần vừa đủ 960 ml - Chỉnh pH đến 6,8 bằng dung dịch NaOH 1N sao cho khi thêm 0,42ml NaHCO 3 /10 ml môi trường sẽ có pH 7,2 - 7,5. - Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ. Ghi ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở -20 o C trong vòng 1 tháng. - Kiểm tra vô trùng: Lấy 1ml môi trường RPMI, đặt vào tủ ấm 37 o C trong 24h. Nếu tủa trắng đục là nhiễm trùng, phải bỏ đi. 4.2. Pha NaHCO 3 5% NaHCO 3 5g Nước cất 2 lần vừa đủ 100 ml Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ. Ghi cẩn thận ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở 4 o C trong vòng 1 tháng. 4.3. Dung dch chng đông ACD Axit citric 0,24g Natricitrat 0,665g Glucoza 1,48g Nước cất 2 lần vừa đủ 50 ml Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và cho vào lọ vô trùng. Ghi ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở 4 o C trong vòng 1 tháng. Dùng 0,2-0,3ml/ml máu. 4.4. Dung dch đông lnh Sorbitol 1,512g NaCL 0,9% 36 ml Glyxerol 14 ml Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ nhỏ vô trùng. Ghi ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở -20 0 C. 4.5. Dung dch phá đông Sorbitol 27% 27g Nước cất 2 lần vừa đủ 100 ml Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ nhỏ vô trùng. Ghi ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở -20 0 C. Sorbitol 5% 5g Nước cất 2 lần vừa đủ 100 ml Lọc vô trùng qua màng lọc millipore có kích thước 0,22µm và chia vào các lọ nhỏ vô trùng. Ghi ngày pha, thử vô trùng và bảo quản ở -20 0 C. . Hypopituitarism following traumatic brain injury and aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a preliminary report, Journal of Neurosurgery 93:743752. Kỹ THUậT NUÔI CấY Và BảO QUảN P. FALCIPARUM. bông, các phiến nhựa đã dùng…) phải được để vào nơi qui định về chất thải y tế. 2.2. Nguyên tc vô trùng trong nuôi cy ti phòng thí nghim - Các dung dịch dùng trong nuôi cấy phải được. việc trong phòng vô trùng phải có áo choàng. Rửa tay, đeo găng và sát trùng bàn bằng cồn ethanol 70 o trước và sau khi làm việc. - Các pipett dùng trong nuôi cấy KST phải dùng quả b p cao su