Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM QUANG HUY SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN DEFENSIN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH Thái Nguyên - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ Khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này. Thái Nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2014 Tác giả luận văn Phạm Quang Huy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2014 Tác giả luận văn Phạm Quang Huy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn i Mục lục iv Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục các bảng trong luận văn vii Danh mục các hình trong luận văn viii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. CÂY NGÔ 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học 3 1.1.3. Giá trị dinh dƣỡng của ngô 6 1.1.4. Giá trị kinh tế của cây ngô 7 1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 8 1.2. MỌT NGÔ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA NÓ ĐẾN QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN NÔNG SẢN 13 1.2.1. Côn trùng hại ngô trong quá trình bảo quản nông sản 13 1.2.2. Mọt ngô 14 1.3. DEFENSIN VÀ TÍNH KHÁNG MỌT 17 1.3.1. Defensin thực vật 17 1.3.2. Ứng dụng trong chuyển gen 21 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. VẬT LIỆU 23 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.2.1. Hóa chất 24 2.2.2. Thiết bị 25 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1. Phƣơng pháp sinh lí 25 2.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 26 2.3.3. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 33 2.3.4. Phƣơng pháp xử lý trình tự gen 34 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 34 2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 34 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT 34 3.1.1. Đặc điểm hình thái, khối lƣợng của các giống ngô nghiên cứu 34 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng mọt 35 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN DEFENSIN 37 3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA 37 3.2.2. Kết quả nhân gen defensin1 39 3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 39 3.2.4. Kết quả tách dòng gen 40 3.2.5. Kết quả chọn dòng gen 41 3.2.6. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp 42 3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN DEFENSIN 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid bp base pair (cặp bazơ) cDNA complementary DNA cs cộng sự DEPC diethyl pyrocarbonate DNA deoxyribosenucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E. coli Escherichia coli IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb kilo base kDa kilo Dalton mRNA messenger ribonucleic acid OD Optical density PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris-acetate-EDTA X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1. Tỉ lệ các bộ phận hạt ngô và thành phần hóa học của chúng 6 Bảng 1.2. Sản xuất ngô trên thế giới giai đoạn 1961 - 2012 9 Bảng 1.3. Tình hình sản xuất ngô của một số nƣớc trên thế giới năm 2012 10 Bảng 1.4. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012 11 Bảng 1.5. Một số hoạt tính sinh học của defensin thực vật 19 Bảng 1.6. Một số thực vật chuyển gen defensin 21 Bảng 2.1. Danh sách 10 giống ngô làm vật liệu nghiên cứu 23 Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng 25 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 27 Bảng 2.4. Cặp mồi nhân gen defensin1 28 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nhân gen 29 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 31 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng colony PCR 33 Bảng 3.1. Hình thái và khối lƣợng hạt của 10 mẫu ngô 34 Bảng 3.2. Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian của 10 giống ngô nghiên cứu 36 Bảng 3.3. Phổ hấp thụ RNA ở bƣớc sóng 260nm và 280nm của 2 mẫu ngô nghiên cứu 38 Bảng 3.4. Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen defensin1 của 2 giống ngô TQ1, CB2 và các trình tự có mã số JF797205 và HG792392 trên NCBI 44 Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng nucleotide của gen defensin1 ở 2 giống ngô TQ1, CB2 và các trình tự có mã số JF797205 và HG792392 trên NCBI 45 Bảng 3.6. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein defensin1 ở 2 giống ngô TQ1, CB2 và các trình tự có mã số JF797205 và HG792392 trên NCBI . 46 Bảng 3.7. Hệ số tƣơng đồng amino acid suy diễn của protein defensin1 ở 2 giống ngô TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 trên NCBI 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1. Mọt ngô Sitophilus zeamais trƣởng thành và tác hại của chúng 16 Hình 1.2. Hai lớp defensin thực vật 18 Hình 2.1. Hình thái hạt của 10 mẫu ngô thí nghiệm 24 Hình 2.2. Cấu trúc vector pBT 31 Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian ở các mẫu ngô nghiên cứu 37 Hình 3.2. Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen defensin1 39 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm làm sạch gen defensin1 40 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony PCR 41 Hình 3.5. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp. 43 Hình 3.6. So sánh trình tự nucleotide của gen defensin1 ở TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 44 Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid suy diễn của giống TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 trên NCBI 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngô là cây ngũ cốc quan trọng trên thế giới với sản lƣợng hàng năm cao hơn cả lúa mì và lúa gạo. Ở Việt Nam, cây ngô đƣợc đánh giá là cây trồng có vai trò hết sức quan trọng trong cơ cấu cây trồng ở nƣớc ta. Ngô là cây màu đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác. Cây ngô không chỉ cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn. Sản xuất ngô cả nƣớc không ngừng tăng về diện tích, năng suất, sản lƣợng qua các năm. Trong những năm tới, ngô vẫn là cây ngũ cốc có vai trò quan trọng ở nƣớc ta. Có nhiều nguyên nhân khiến cho năng suất ngô hiện nay tại các tỉnh miền núi phía Bắc hiện thấp hơn nhiều so với bình quân chung của cả nƣớc mặc dù điều kiện đất đai, khí hậu tại vùng này thuận lợi cho việc trồng ngô hơn nhiều vùng sinh thái khác. Một trong số đó là sâu bệnh hại ngô, với mức thiệt hại ƣớc tính hàng năm từ 10 - 30%. Theo Lê Doãn Diên [4] ở Việt Nam, tổn thất do côn trùng gây ra cho ngũ cốc trong bảo quản là khoảng 10%. Tổn thất sau thu hoạch đối với cây ngô là khá lớn, trung bình từ 13 - 15%; đặc biệt tại các tỉnh vùng Trung du miền núi phía Bắc, việc sản xuất ngô trong vụ Xuân thƣờng gặp rất nhiều khó khăn cho việc thu hái, bảo quản, sơ chế ngô trong điều kiện mƣa kéo dài trong giai đoạn cuối vụ thu hoạch. Ngô nếu không đƣợc bảo quản hoặc bảo quản không đúng quy trình sẽ giảm chất lƣợng nghiêm trọng. Thông thƣờng giá ngô giảm 10 - 20% sau khoảng 3 - 6 tháng tồn trữ nếu bị nhiễm mọt và nấm mốc. Đây là một tổn thất rất lớn đối với đồng bào dân tộc ở vùng núi phía Bắc vì ngô là nguồn thu nhập quan trọng của các gia đình. Để giảm thiểu thiệt hại do mọt gây ra, hiện nay có một số biện pháp phòng trừ nhƣ chọn lọc cây sạch bệnh làm giống; vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng; vệ sinh nhà kho, phơi sấy hàng hóa; sử dụng các loài thiên địch có ích trong tự nhiên; sử dụng biện pháp hóa học khi mật độ dịch hại quá cao Tuy nhiên, các biện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 pháp nêu trên không mang lại hiệu quả thật sự cao mà còn tốn kém công sức, tiền của. Vì vậy, việc tạo ra các giống ngô chuyển gen có khả năng kháng sâu bệnh, đặc biệt là có khả năng kháng mọt hết sức có ý nghĩa. Có nhiều chất có vai trò quan trọng trong bảo vệ cây trồng chống lại các tác nhân gây bệnh và côn trùng. Theo những nghiên cứu đã đƣợc công bố, defensin thực vật có liên quan đến đặc tính kháng mọt của hạt. . Xuất phát từ vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “So sánh trình tự gen defensin ở một số giống ngô Việt Nam”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU So sánh trình tự nucleotide của gen defensin ở một số giống ngô địa phƣơng có khả năng kháng mọt khác nhau. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống ngô. - Khuếch đại, chọn dòng và xác định trình tự gen defensin1 của 2 giống ngô (trong đó có 1 giống kháng mọt tốt, 1 giống kháng mọt kém). - So sánh trình tự gen defensin1 của 2 giống ngô nghiên cứu với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen NCBI. - So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein defensin1 ở 2 giống ngô nghiên cứu. [...]... ngƣời dân các nƣớc Mỹ Latinh ăn ngô dƣới dạng bánh bột ngô Ở châu Phi ngƣời ta ăn ngô dƣới dạng bánh khô (nhƣ bánh mì ngô của Ai Cập) hoặc ở dạng ƣớt (nhƣ ogi của Nigeria), một số quốc gia châu Á ăn ngô dƣới dạng bánh hoặc bánh đúc nhƣ mèn mén của dân tộc vùng cao Việt Nam Ngoài ra còn có một số cách dùng phổ biến trên thế giới nhƣ ngô luộc, ngô rang, bỏng ngô [14] Ngô còn là cây làm thức ăn quan... đây, sản xuất ngô ở Việt Nam còn nhỏ lẻ và phân tán, chủ yếu là tự cung tự cấp theo nhu cầu của hộ nông dân Hầu hết diện tích ngô đều đƣợc gieo trồng các giống ngô địa phƣơng, cho nên năng suất thấp Vào năm 1975, diện tích ngô ở Việt Nam chƣa đến 300 nghìn ha, năng suất chỉ khoảng 10 tạ/ha Từ những giữa năm 1980, nhờ hợp tác với Trung tâm Cải tạo ngô và lúa mỳ quốc tế (CIMMYT), nhiều giống ngô cải tiến... ngoài, cấu trúc nội nhũ của hạt mà ngô đƣợc phân thành các loài phụ: ngô bọc, ngô đá, ngô răng ngựa, ngô đƣờng, ngô nổ, ngô bột, ngô nếp, ngô đƣờng bột, ngô bán răng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 ngựa Từ các loài phụ căn cứ vào màu sắc hạt và màu sắc lõi ngô để phân thành các thứ Đây là cách phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngoài ra ngô còn đƣợc phân loại theo sinh thái... chiều dài, chiều Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc lá và gân lá thay đổi tùy theo từng giống khác nhau Số lá là đặc điểm khá ổn định ở ngô, có quan hệ chặt với số đốt và thời gian sinh trƣởng Những giống ngô ngắn ngày thƣờng có 15 - 16 lá, giống ngô trung bình có 18 - 20 lá, giống ngô dài ngày thƣờng có trên 20 lá [9] Ngô là loại cây có hoa... trình độ nghiên cứu tạo giống ngô lai và đang ở giai đoạn đầu đi vào công nghệ cao (công nghệ gen, nuôi cấy bao phấn và noãn) [2], [14] Những vùng trồng ngô lớn ở Việt Nam là khu vực Đông Nam bộ, Tây Nguyên, trung du miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng và duyên hải miền Trung [5] Trong đó, khu vực miền núi phía Bắc trồng chủ yếu là các giống ngô địa phƣơng Năng suất của các giống ngô địa phƣơng thƣờng... động từ 8 - 12% ở mỗi giống Tuy nhiên trong hạt ngô thiếu hai loại amino acid quan trọng là lysin và tryptophan Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm Ngô cũng có nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6 ) Vitamin PP hơi thấp cộng với thiếu tryptophan một amino acid có thể tạo vitamin PP Riêng ngô vàng chứa nhiều carotene (tiền vitamin A) [9] 1.1.4 Giá trị kinh tế của cây ngô Ngô là cây lƣơng... ra ngoài đồng gây hại ở giai đoạn ngô sắp thu hoạch, để bắt đầu phá hoại tiếp tục hạt ngô ở giai đoạn sau thu hoạch Khả năng sinh trƣởng và phát triển của mọt ngô đối với ngô hạt là lớn nhất, sau đó mới đến thóc gạo và các loại ngũ cốc khác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 17 1.3 DEFENSIN VÀ TÍNH KHÁNG MỌT 1.3.1 Defensin thực vật 1.3.1.1 Giới thiệu chung Defensin là những protein... tạ/ha Thành tựu nhảy vọt này có đƣợc là do việc tạo đƣợc các giống ngô lai và mở rộng diện tích trồng ngô lai trong sản xuất, kết hợp áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác hiện đại Năm 1991, diện tích trồng ngô lai chƣa đến 1% Đến năm 2000, tỷ lệ này đã là 63% với diện tích 450 nghìn ha Năm 2006, giống lai đã chiếm khoảng 90% diện tích ngô cả nƣớc Việt Nam đã đuổi kịp các nƣớc trong khu vực về trình độ... với nhau bởi cầu nối disunfide Defensin thực vật đầu tiên đƣợc phân lập từ lúa mỳ (Triticum aestivum) [23] và lúa mạch (Hordeum vulgare) [35] Chúng đƣợc gọi với tên defensin thực vật” bởi chúng có cấu trúc mang nhiều nét tƣơng đồng với defensin ở nhiều loài sinh vật khác, trong đó có con ngƣời Cho tới nay, đã xác định đƣợc trình tự của hơn 80 loại gen defensin thực vật khác nhau Nhóm các defensin thực... (thƣờng là mọt) ở hạt đậu xanh là khi côn trùng phá huỷ những hạt ngô thì defensin đã ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của côn trùng và ức chế sự sinh trƣởng phát triển của chúng Ở đây, defensin nhƣ là một tác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 21 nhân cản trở enzym [33] 1.3.2 Ứng dụng trong chuyển gen Cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu diện rộng các đối tƣợng sâu bệnh, cũng . mọt của một số giống ngô. - Khuếch đại, chọn dòng và xác định trình tự gen defensin1 của 2 giống ngô (trong đó có 1 giống kháng mọt tốt, 1 giống kháng mọt kém). - So sánh trình tự gen defensin1 . trình tự nucleotide của gen defensin1 của 2 giống ngô TQ1, CB2 và các trình tự có mã số JF797205 và HG792392 trên NCBI 44 Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng nucleotide của gen defensin1 ở 2 giống ngô. của 2 giống ngô nghiên cứu với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen NCBI. - So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein defensin1 ở 2 giống ngô nghiên cứu. Số hóa bởi Trung