B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I - - NGUY N TH QUỲNH TRANG NGHIÊN C U M T S ð C ðI M B NH LÝ C A L N M C CIRCOVIRUS (PCV2) VÀ NG D NG K THU T PCR ð CH N ðOÁN B NH LU N VĂN TH C SĨ HÀ N I – 2013 B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I - - NGUY N TH QUỲNH TRANG NGHIÊN C U M T S ð C ðI M B NH LÝ C A L N M C CIRCOVIRUS (PCV2) VÀ NG D NG K THU T PCR ð CH N ðOÁN B NH CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà NGÀNH : 60.64.01.01 NGƯ I HƯ NG D N KHOA H C : PGS.TS NGUY N TH LAN PGS.TS NGUY N BÁ HIÊN HÀ N I – 2013 L I C M ƠN ð hoàn thành chương trình cao h c vi t lu n văn này, tơi nh n đư c s hư ng d n, giúp đ góp ý nhi t tình c a quý th y cô khoa Thú y, trư ng ð i h c Nông Nghi p Hà N i Trư c h t, xin chân thành c m ơn đ n q th y trư ng ð i h c Nông Nghi p Hà N i, ñ c bi t nh ng th y cô t n tình d y b o cho tơi su t th i gian h c t p t i trư ng Tôi xin g i l i bi t ơn sâu s c ñ n PGS.TS Nguy n Th Lan TS Nguy n Bá Hiên ñã dành r t nhi u th i gian tâm huy t hư ng d n nghiên c u giúp tơi hồn thành lu n văn t t nghi p ð ng th i, xin g i l i c m ơn t i th y cô b mơn B nh lý, anh ch cơng tác t i Phịng thí nghi m trung tâm trư ng ðH Nơng nghi p Hà N i, gia đình b n bè giúp tơi th c hi n đ tài Tơi xin c m ơn ch trang tr i, h chăn nuôi t nh B c Giang, Thái Bình, Hưng Yên, H i Dương, Hà N i ñã t o ñi u ki n giúp đ tơi q trình thu th p m u b nh ph m ñ a phương Cu i cùng, tơi xin kính chúc tồn th Th y, Cơ khoa Thú y gia đình m nh kh e công tác t t Hà N i, ngày 30 tháng 07 năm 2013 H c viên Nguy n Th Quỳnh Trang Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p i M CL C L I C M ƠN i M C L C .ii DANH M C B NG iv DANH M C HÌNH v Ph n I: M ð U Ph n II: T NG QUAN TÀI LI U 2.1 NH NG NGHIÊN C U V PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2.1.1 M t s nghiên c u th gi i 2.1.2 M t s nghiên c u t i Vi t Nam 2.2 HI U BI T V CĂN B NH 2.2.1 Phân lo i 2.2.2 C u trúc virus 2.2.3 S c ñ kháng 11 2.3 HI U BI T V B NH DO PORCINE CIRCOVIRUS GÂY RA 11 2.3.1 Loài m c b nh 12 2.3.2 L a tu i m c b nh 13 2.3.3 Ch t ch a m m b nh 13 2.3.4 ðư ng xâm nh p 14 2.3.5 Cơ ch sinh b nh 14 2.3.6 Tri u ch ng lâm sàng 15 2.3.7 B nh tích 16 2.3.8 Ch n đốn 18 2.3.9 Phịng ki m sốt b nh 20 Ph n III: ð I TƯ NG – N I DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 23 3.1 ð I TƯ NG NGHIÊN C U 23 3.2 N I DUNG NGHIÊN C U 23 3.3 NGUYÊN LI U 23 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p ii 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 24 3.4.1 Phương pháp quan sát 24 3.4.2 Phương pháp m khám 25 3.4.3 Phương pháp l y m u b o qu n m u làm tiêu b n 25 3.4.4 Phương pháp làm nhu m tiêu b n vi th 25 3.4.5 Phương pháp PCR 28 3.4.5.1 Phương pháp tách chi t DNA 30 3.4.5.2 Phương pháp ti n hành ph n ng PCR 31 3.6 X lý s li u 33 Ph n IV: K T QU VÀ TH O LU N 34 4.1 K T QU XÁC ð NH M T S TRI U CH NG LÂM SÀNG CH Y U C A L N NGHI M C PCV2 34 4.2 B NH TÍCH ð I TH CH Y U C A L N NGHI M C PCV2 38 4.3 T N THƯƠNG VI TH CH Y U C A L N NGHI M C PCV2 42 4.4 K T QU PCR M T S CƠ QUAN C A L N NGHI M C PCV2 49 Ph n V: K T LU N VÀ ð NGH 51 5.1 K T LU N 51 5.2 ð NGH 51 Ph n VI: TÀI LI U THAM KH O 53 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p iii DANH M C B NG B ng 2.1 Các vacxin phòng b nh 22 B ng 3.1 C p m i ñ c hi u v i ño n gen ORF1 c a PCV2 24 B ng 3.2 Thành ph n th tích cho ph n ng PCR 31 B ng 3.3 Chu trình nhi t ph n ng PCR v i gen ORF1 c a PCV2 32 B ng 4.1 Ngu n g c l n sau cai s a nghiên c u 34 B ng 4.2 Tri u ch ng lâm sàng c a l n sau cai s a nghi m c PCV2 35 B ng 4.3 Bi n ñ i b nh tích đ i th c a l n sau cai s a nghi m c PCV2 39 B ng 4.4 Bi n ñ i b nh tích vi th m t s quan l n sau cai s a nghi m c PCV2 43 B ng 4.5 K t qu ph n ng PCR 49 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p iv DANH M C HÌNH Hình 2.1 C u trúc virus PCV2 Hình 2.2 Mơ hình bư c c a ph n ng PCR 30 Hình 4.1 L n cịi c c, lông xù 37 Hình 4.2 L n tiêu ch y, phân màu nâu 37 Hình 4.3 Sưng h ch b n nông 37 Hình 4.4 L n ch m l n 37 Hình 4.5 L n b viêm da 37 Hình 4.6 L n bi u hi n th khó 37 Hình 4.7 Gan sưng, t máu 41 Hình 4.8 Ph i xu t huy t 41 Hình 4.9 H ch màng treo ru t sưng 41 Hình 4.10 Ru t xu t huy t 41 Hình 4.11 Th n sưng, xu t huy t 41 Hình 4.12 H ch lympho sưng, xu t huy t 41 Hình 4.13 Gan sung huy t thâm nhi m t bào viêm ( H.E 10X ) 46 Hình 4.14 Thâm nhi m t bào viêm gan l n m c PCV2 ( H.E 40X ) 46 Hình 4.15 Lách xu t huy t, thâm nhi m t bào viêm ( H.E 10X ) 46 Hình 4.16 Tim sung huy t, thâm nhi m t bào viêm ( H.E 10X ) 46 Hình 4.17 Ph i l n m c PCV2 sung huy t nghiêm tr ng ( H.E 10X ) 46 Hình 4.18 Viêm ph i k ( H.E 40X ) 46 Hình 4.19 H ch lympho sung huy t 47 Hình 4.20 Thâm nhi m t bào b ch c u toan t bào kh ng l h ch ( H.E 40X ) 47 Hình 4.21 T bào kh ng l lách 47 Hình 4.22 Th n xu t huy t 47 Hình 4.23 T bào kh ng l nhi u nhân h ch lympho ( H.E 40X ) 47 Hình 4.24 Ru t thâm nhi m t bào viêm 47 Hình 4.25 K t qu n di s n ph m ph n ng PCR 49 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p v Ph n I M ð U Ngành chăn nuôi ngày phát tri n gi m t vai trò quan tr ng n n kinh t ð c bi t ngành chăn ni l n có nhi u thay ñ i ñáng k , ñáp ng nhu c u th c ph m c a ngư i dân Chăn ni l n tr thành ngu n thu nh p quan tr ng m t nh ng ngành ngh góp ph n d ch chuy n c u n n kinh t nông nghi p Cùng v i s phát tri n c a ngành chăn ni, kéo theo s gia tăng v tình hình d ch b nh, ñó có b nh circovirus gây Circovirus có type porcine circovirus type (PCV1) porcine circovirus type (PCV2) PCV1 khơng có tính gây b nh, PCV2 ñư c xem tác nhân gây h i ch ng còi c c sau cai s a l n (PMWS - post weaning multisystemic wasting syndrome) ðã có r t nhi u nghiên c u v virus này, có nghiên c u tìm hi u ki u gen c a PCV2 nư c th gi i Các nghiên c u c a Nguy n Th Thu H ng cs (2006); T.Opriessnig cs (2008) xác đ nh trình t nucleotide c a PCV1 PCV2 tương ñ ng nh 80% tương ñ ng v aminoacid nh 70% ñ ng th i xác ñ nh ñư c PCV2 có r t nhi u subtype khác PCV-2a, PCV-2b, PCV2c, PCV-2d PCV-2e Circovirus không ph i m t virus m i ðây m t virus r t ph bi n chăn nuôi l n t trư c t i nay, th m chí có nh ng ñàn l n bi u l dương tính v i Circovirus ch ng bao gi th y bi u hi n c a b nh T l nhi m PCV2 r t cao, có th chi m 90 - 100%, t l l n m c b nh PMWS n hình l i r t th p, ch kho ng - 15% Tuy nhiên PMWS khơng ch Circovirus gây ra, dù ñư c xem m t y u t c n thi t PCV2 không ch liên quan t i PMWS, g n ñây ngư i ta s d ng thu t ng “b nh ñ ng hành v i porcine circovirus” (Porcine Circovirus Associated Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p Disease - PCVAD) ñ ch t t c b nh liên quan t i PCV2 x y l n bao g m: PMWS, ph c h p b nh hô h p l n (PRDC), viêm ph i ho i t ti n tri n l n (PNP), b nh tiêu ch y, h i ch ng viêm da viêm th n (PDNS - Porcine Dermatitis and Nephoropathy Syndrome) Cho ñ n nay, PCV2 có m t t i h u h t kh p qu c gia th gi i, có Vi t Nam T l nhi m PCV2 Vi t Nam tương ñ i cao tăng qua năm Nguy n Ti n Hà (2008) ki m tra 1073 m u huy t l n ñ c gi ng l n nái t nh thành phía Nam năm 2000-2006; t l huy t dương tính chi m 38,9% năm 2000 96,47% năm 2006 T i mi n B c nghiên c u v Circovirus v n h n ch B nh Cirovirus gây g n ñây m i ñư c quan tâm nên vi c nghiên c u tìm hi u b nh có ý nghĩa quan tr ng, góp ph n b sung lý lu n v b nh vào trình ch n đốn, phịng tr b nh đ t hi u qu , gi m thi t h i b nh gây Xu t phát t yêu c u th c ti n trên, ñư c s ñ ng ý c a Khoa Thú Y, trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i B môn B nh lý, th c hi n ñ tài: “Nghiên c u m t s ñ c ñi m b nh lý c a l n m c Circovirus (PCV2) ng d ng k thu t PCR đ ch n đốn b nh” M c đích nghiên c u c a đ tài - Làm rõ ñ c ñi m tri u ch ng lâm sàng, b nh lý ñ i th , vi th c a m t s quan l n m c PCV2 - ng d ng k thu t PCR đ ch n đốn b nh Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p Ph n II T NG QUAN TÀI LI U 2.1 NH NG NGHIÊN C U V PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2.1.1 M t s nghiên c u th gi i T tháng - 2003 ñ n tháng - 2005 Zong cs ñã ti n hành thu th p ng u nhiên 1250 m u huy t m u mô l n nghi nhi m PCV2 bao g m: lách, gan, h ch lympho t qu n huy n Hàng Châu, t nh Chi t Giang S d ng phương pháp ELISA ñã phát hi n th y 40% m u huy t dương tính v i PCV2 ð ng th i, b ng phương pháp PCR m u mô cho th y t i Hàng Châu lưu hành ngồi ch ng PCV2 Trung Qu c lưu hành r ng rãi ch ng PCV2 khác th gi i như: Hà Lan, Canada, M , ð c Vương Qu c Anh Năm 2010, Long cs ñã s d ng phương pháp PCR-RELP ñã xác ñ nh ñư c 19 ch ng PCV2 ñang lưu hành t i Trung Qu c chia làm ki u gen ki u PCV-2d ki u gen m i ki u gen PCV-2a, PCV-2b hai ki u gen ph bi n t i Trung Qu c Năm 2010, Jun cs ñã gây nhi m 48 chu t ch ng Côn Minh cho th y virus nhân lên chu t, chu t ch t sau 7, 14, 28 42 ngày gây nhi m tương ng B ng phương pháp PCR tìm th y kháng th huy t chu t gây nhi m, virus PCV2 mô lympho chu t T n thương vi th PCV2 t p trung gây suy gi m ch c h ch lympho, th nh tho ng th y ho i t t bào lympho, v não hành t y nh ng chu t ñư c gây nhi m Năm 1998 nh ng trư ng h p ñ u tiên c a PMWS đư c mơ t Thái Lan có nghiên c u ch ñã phát hi n PMWS l n t năm 1993 D a vào phương pháp PCR kh o sát sơ b t l nhi m PCV2 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p Thái Lan 4.3 T N THƯƠNG VI TH CH Y U C A L N NGHI M C PCV2 Nghiên c u ñ c ñi m b nh lý vi th góp m t ph n quan tr ng nghiên c u b nh lý h c vi th c a b nh PCV2 gây ra, t hi u rõ thêm v ch tác đ ng, đích tác ñ ng, nh ng nh hư ng m c ñ t bào tác nhân gây b nh gây Chúng ti n hành m khám nh ng l n nghi m c b nh ñi n hình cho b nh PCV2 m i l n nghi m c PCV2 đư c m , chúng tơi ti n hành l y quan: ph i, gan, th n, lách, ru t, tim h ch ngâm formol 10% ti n hành làm tiêu b n ñ xác ñ nh nh ng bi n ñ i vi th nh m kh ng ñ nh ch c ch n s phá h y t ch c c a PCV2 l n nghiên c u T nh ng m u b nh ph m thu đư c, chúng tơi ti n hành đúc block M i block ti n hành c t, nhu m tiêu b n sau ch n tiêu b n t t nh t c a m i quan đ soi kính hi n vi đ c k t qu b nh tích vi th K t qu nghiên c u c a d a nh ng tiêu b n dương tính n hình đư c trình bày b ng 4.4 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 42 B ng 4.4 Bi n đ i b nh tích vi th m t s quan l n sau cai s a nghi m c PCV2 T n thương vi th STT Cơ quan Sung huy t ( n = 10 ) Xu t huy t ( n = 10 ) Ho i t t bào ( n = 10 ) Thối hóa t bào ( n = 10 ) n (+) % n (+) % n (+) % n (+) % Thâm nhi m t bào viêm ( n = 10 ) n (+) % Gan 10 100 30 30 10 100 10 100 Ph i 90 10 100 20 60 90 Th n 90 80 10 70 90 Lách 90 80 10 40 20 H ch 80 80 0 90 40 Ru t 70 90 0 20 60 Tim 30 50 0 10 30 Trong đó: n - s block nghiên c u n (+) - s block dương tính Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 43 Qua b ng 4.4 cho th y t l quan b sung huy t, xu t huy t, thâm nhi m t bào viêm, thối hóa t bào chi m t l cao Các b nh tích khác chi m t l th p hơn, c th sau: * Ph i Ph i quan có bi n đ i rõ ràng, thư ng g p nh t xu t huy t, sung huy t thâm nhi m t bào viêm T l block ph i xu t huy t 100% v i s t p trung h ng c u thành t ng ñám che khu t t bào ph i, h ng c u tràn ng p lịng ph nang (hình 4.17) Trong lịng ph qu n, ph nang có ch a d ch phù Ngun nhân đư c gi i thích thành m ch ph i b t n thương ho c b phá v nên thành ph n c a máu ch y ngồi lịng m ch qu n Bên c nh s sung huy t v i mao qu n vách ph nang, ph qu n giãn r ng, ch a ñ y h ng c u lòng m ch t o thành m t màu ñ dày ñ c Các tiêu b n vi th cịn th y m t đ c trưng n a s thâm nhi m t bào viêm m c ñ khác v i s có m t c a t bào ñơn nhân l n, b ch c u ña nhân trung tính, lâm ba c u… Vách ph nang dày lên, ñi u phù h p v i b nh tích đ i th thu đư c viêm ph i k , xu t huy t (hình 4.18) gi i thích cho hi n tư ng khó th g p l n sau cai s a m c PCV2: vách ph nang dày lên làm di n tích trao đ i khí gi m v i d ch phù lòng ph qu n, ph nang làm cho hô h p c a v t g p khó khăn * Gan Gan có v trí xung y u có ch c r t ph c t p nên r t d b t n thương, di n bi n trình b nh lý c a gan ph thu c vào th i gian c a tác nhân gây b nh vào th S t n thương c a gan t p trung vào t bào gan sung huy t, thối hóa t bào thâm nhi m t bào viêm Các tiêu b n gan nghiên c u c a th y: 100% tiêu b n sung huy t thâm nhi m t bào viêm, thối hóa t bào xu t hi n viêm u Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 44 h t hay t bào kh ng l nghiên c u c a Chae (2004), ñư c minh h a hình 4.13 4.14 T i t ch c liên k t v khơng bi n đ i nhi u, h ng c u xu t hi n nhi u gan b xu t huy t n ng T i ti u thùy gan, t bào gan b thối hóa, ho i t , màng t bào khơng cịn, ngun sinh ch t nhân lan tràn; c u trúc nan hoa xe ñ p b phá h y, ch cịn s có th quan sát ñư c Vùng trung tâm ti u thùy gan sung huy t, thâm nhi m t bào viêm Tĩnh m ch trung tâm ti u thùy gan sung huy t, thâm nhi m t bào viêm Tĩnh m ch trung tâm ti u thùy ch a ñ y h ng c u M t s tiêu b n gan quan sát ñư c hi n tư ng xu t huy t r t n ng, h ng c u xu t hi n v i s lư ng r t l n, chèn ép t bào gan, phá h y c u trúc bình thư ng c a ti u thùy gan, bè Remark hay c u trúc nan hoa c tĩnh m ch trung tâm ti u thùy đ u b phá v hồn tồn T bào Kufffer xu t hi n nhi u Quãng c a b t bào xơ phát tri n, khó quan sát đư c c u trúc đ ng m ch, tĩnh m ch ng m t M t s tiêu b n quan sát ñư c hi n tư ng thành ng dày lên, lòng ch a d ch nhày * Lách có hi n tư ng sung huy t thâm nhi m t bào viêm ð c bi t có s xu t hi n c a t bào kh ng l (hình 4.21), m t d u hi u ñ c trưng c a b nh PCV2 gây nghiên c u c a Chae (2004) T bào kh ng l đư c hình thành s h p nh t bào tương c a t bào ñ i th c bào Trong m t t bào có ch a nhi u nhân, hình thái t bào khơng có quy t c, có th hình trịn ho c b u d c Thư ng có lo i t bào kh ng l : t bào langhans v i s s p x p nhân quanh ngo i vi bào tương t bào kh ng l d v t có nhân s p x p l n x n T n thương xu t hi n t bào kh ng l ch ng t t n thương t n thương mãn tính * Th n sung huy t, m ch qu n ch a ñ y h ng c u (hình 4.23) Thâm nhi m t bào viêm T bào th n b thối hóa Th n xu t huy t, h ng c u n m k th n Khi xâm nh p gây b nh tích th l n, m t s t bào đích c a virus PCV2 t bào bi u mô ng th n ðây có th Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 45 nguyên nhân n cho toàn b c u trúc ng th n viêm thối hóa Viêm thối hóa m t d ng t n thương n cho c u trúc t bào b bi n ñ i c v lư ng ch t, kèm theo ch c t bào khơng bình thư ng r i lo n chuy n hóa ch t t bào gây * Ru t: xu t huy t, sung huy t cao; lơng nhung ru t đ t nát, t bào bi u mô ru t thối hóa Thâm nhi m t bào viêm: b ch c u đa nhân trung tính đư c minh h a hình 4.24 * H ch lympho có b nh tích vi th đáng ý nh t v i s suy gi m t bào lympho, ñ c bi t nang lympho H ch lympho xu t huy t, đ t nát, khơng cịn rõ c u trúc nang lympho khơng tìm th y trung tâm sinh trư ng mi n v , vách ngăn dày lên (hình 4.19) Các t bào lympho b thối hóa thâm nhi m t bào viêm t bào th c bào ñư c minh h a hình 4.20, đ c bi t t bào ch t thư ng ch a nhi u h t nh , th vùi T i h u h t tiêu b n ñ u quan sát th y hi n tư ng d ch nhày t bào mơ h ch thối hóa lan tràn mi n v h ch lympho Ngồi ra, có s xu t hi n c a t bào kh ng l nhi u nhân hay g i th h p bào đư c minh h a hình 4.20 4.23 Các t bào có ch hình thành tương t t bào kh ng l ph i Xu t hi n t bào kh ng l nguyên nhân d n t i vi c t bào mi n d ch như: ða nhân trung tính, đơn nhân l n, lympho bào, tương bào đư c tìm th y v i só lư ng r t Gi i thích phù h p v i hi n tư ng gi m c a t bào lympho nang lympho * Cơ tim giãn r ng (thối hóa tim), bi u hi n có th gi i thích r i lo n hô h p, trình viêm ph i làm cho l n m c PCV2 khó th , suy hơ h p ð ñáp ng nhu c u oxy cho hô h p, v n chuy n t i mơ bào tim ph i tăng cư ng co bóp, ho t ñ ng bù Lâu d n d n t i viêm tim, nên có hi n tư ng thâm nhi m t bào viêm, tim giãn r ng (hình 4.16) Trư ng ð i H c Nơng Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nơng nghi p 46 HÌNH NH B NH TÍCH VI TH C A L N NGHI M C PCV2 Hình 4.13 Gan sung huy t thâm nhi m t bào viêm ( H.E 10X ) Hình 4.15 Lách xu t huy t, thâm nhi m t bào viêm ( H.E 10X ) Hình 4.17 Ph i l n m c PCV2 sung huy t nghiêm tr ng ( H.E 10X ) Hình 4.14 Thâm nhi m t bào viêm gan l n m c PCV2 ( H.E 40X ) Hình 4.16 Tim sung huy t, thâm nhi m t bào viêm ( H.E 10X ) Hình 4.18 Viêm ph i k ( H.E 40X ) Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nơng nghi p 47 Hình 4.19 H ch lympho sung huy t ( H.E 10X ) Hình 4.21 T bào kh ng l lách Hình 4.20 Thâm nhi m t bào b ch c u toan t bào kh ng l h ch ( H.E 40X ) Hình 4.22 Th n xu t huy t ( H.E 40X ) ( H.E 10X ) Hình 4.23 T bào kh ng l nhi u nhân h ch lympho ( H.E 40X ) Hình 4.24 Ru t thâm nhi m t bào viêm Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 48 4.4 K T QU PCR M T S CƠ QUAN C A L N NGHI M C PCV2 ð ch n đốn xác l n nghiên c u có nhi m PCV2 hay khơng sau nghiên c u bi n ñ i ñ i th vi th , ti n hành ph n ng PCR đ ch n đốn xác T nh ng m u b nh ph m tương ng v i nhóm l n nghiên c u, chúng tơi ti n hành tách chi t DNA t ng s b ng b kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) S n ph m DNA t ng s c a ch ng PCV2 nghiên c u thu ñư c sau tách chi t s ñư c khu ch ñ i b ng ph n ng PCR v i b kít giành cho ph n ng PCR (Invitrogen) c p m i ñ c hi u v i PCV2 (VF2 VR2) cho phép xác ñ nh ño n gen ORF1 c a PCV2 có kích thư c d ki n 380bp S n ph m sau khu ch ñ i máy PCR (Icycler Thermal Cycler) ñư c ñi n di th ch agarose 1,5% ch p nh máy phát tia UV K t qu ph n ng PCR đư c trình bày b ng 4.5 hình 4.25 B ng 4.5 K t qu ph n ng PCR STT Nhóm l n Nhóm HN Nhóm TB Nhóm BG Nhóm HD Nhóm HY M u b nh ph m H ch b n H ch ph i H ch màng treo ru t H ch amidan Máu K t qu ph n ng PCR + + + + + Hình 4.25 K t qu n di s n ph m ph n ng PCR (Thang chu n Marker:100bp; gi ng t 1-5 m u b nh ph m c a l n nghiên c u; gi ng ñ i ch ng âm (DW); gi ng ñ i ch ng dương) Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nơng nghi p 49 K t qu n di cho th y t t c m u ñư c ch n làm thí nghi m ñ u cho k t qu dương tính v i PCV2 S n ph m ñi n di cho v ch DNA tương ng v i 380bp ñúng theo thi t k m i Như v y, b ng phương pháp PCR ch n đốn xác PCV2 t t c l n có bi n đ i đ i th vi th nghiên c u ñ u nhi m PCV2 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 50 Ph n V K T LU N VÀ ð NGH 5.1 K T LU N Sau ti n hành làm ñ tài “Nghiên c u m t s ñ c ñi m b nh lý c a l n m c Circovirus (PCV2) ng d ng k thu t PCR đ ch n đốn b nh” chúng tơi rút m t s k t lu n sau: - Tri u ch ng lâm sàng n hình c a b nh PMWS cịi c c, ch m l n; a ch y; khó th h ch b n nông sưng - B nh tích đ i th ch y u bi u hi n đư ng hơ h p, tiêu hóa h lympho: h ch lâm ba sưng to, xu t huy t; ph i xu t huy t, xen k gi a vùng lành vùng t n thương; ru t ch a ñ y hơi, thành ru t m ng, niêm m c ru t xu t huy t - B nh tích vi th : quan gan, ph i, lách, th n ru t ñi u b t n thương, ch y u xu t huy t, xung huy t, thâm nhi m t bào viêm, thối hóa t bào - Phương pháp PCR cho phép ch n đốn nhanh xác b nh PCV2 5.2 ð NGH PCV2 liên quan ñ n nhi u h i ch ng khác nhau, gây b nh cho l n nhi u l a tu i khác nhiên u ki n khơng cho phép ch nghiên c u v b nh PCV2 gây l n sau cai s a t 2- tháng tu i PCV2 cịn gây nhi m mơ, quan khác ngồi gan, ph i, h ch, lách ð nghiên c u hồn thi n tơi đ ngh : - Nghiên c u h i ch ng khác PCV2 gây m r ng ph m vi nghiên c u l a tu i khác, nhi u ñ a phương Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 51 - Ti p t c nghiên c u bi n ñ i b nh tích vi th quan khác ng d ng phương pháp PCR r ng - Ti n hành gi i trình t gen c a virus ñ phát hi n bi n ch ng nh m ch t o vacxin có hi u qu phòng b nh cao Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 52 Ph n VI TÀI LI U THAM KH O TÀI LI U TRONG NƯ C Tr n Th Dân, Nguy n T t Toàn, Nguy n Th Thu Năm, & Võ Th Trà An (2010) Bi n ñ i ch tiêu huy t h c b nh tích l n ni th t đư c tiêm ch ng vacxin Th ORF2 phòng ng a h i ch ng g y còm viêm da th n Circovirut type T p Chí Khoa H c K Thu t Thú Y , t p XVII, s 3, trang 14-20 Lê Ti n Dũng (2006) Phát hi n vi rút PCV2 b ng phương pháp PCR phân l p ñ nh danh m t s vi khu n gây b nh hô h p l n nghi m c h i ch ng còi c c sau cai s a Lu n văn Th c s ð i h c Nơng lâm Thành ph H Chí Minh Nguy n Ti n Hà (2008) Ghi nh n tình hình nhi m, phân l p giám đ nh porcine circovirus typ (PCV2) l n m t s t nh thành phía Nam Lu n văn Th c s ð i h c Nông lâm Thành ph H Chí Minh Nguy n Th Thu H ng, Lê Th Thu Phương, ð ng Hùng, Nguy n Ng c H i, Chris J Morrissy(2010) Kh o sát ñáp ng kháng th sau tiêm phòng vacxin d ch t l n l n nhi m Circovirus l n typ (PCV2) T p Chí Khoa H c K Thu t Thú Y , t p XVII, s 6, trang 11-16 Nguy n Th Thu H ng, Lê Th Thu Phương, ð ng Hùng, Nguy n Ti n Hà, Nguy n Ng c H i, Chris J Morrissy, Darren Schafer(2008) Phân tích di truy n Circovirus l n typ (PCV2) l n t i khu v c Nam b T p chí khoa h c k thu t thú y, t p XV, s 3, trang 5-12 Nguy n Th Thu H ng, Phan Hoàn Dũng, ð ng Hùng, Nguy n Ti n Hà Chris morrissy (2006) Bư c đ u kh o sát tình hình nhi m PCV2 đàn l n ni m t s t nh thành phía Nam T p chí Khoa h c k thu t thú y, t p XIII, s 3, trang 67-69 Huỳnh Th M L , Nguy n Văn Giáp, ð ng H u Anh, Tr n Th Hương Giang, Mai Th Ngân, Vũ Th Ng c, Lê Văn Trư ng, Ngô Minh Hà Bong Kyun Park (2012) (PCV2) ng d ng k thu t nested-PCR phát hi n ñ nh typ Porcine circovirus typ đàn l n ni t i m t s t nh mi n B c T p chí Khoa h c k thu t thú y, t p XIX, s 5, trang 18-25 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 53 TÀI LI U NƯ C NGOÀI C Chae (2005) A review of porcine circovirus – associated syndromes and diseases The Veterianary Journal 169, 326-336 C Chae (2003) Postweaning multisystemic wasting syndrome: a review of aetiology, diagnosis and pathology Carl A.Gagnon et al (2007) The emergence of porcine circovirus 2b genotype (PCV-2b) in swine in Canada Can Vet J 48 D.M.Madso, A.R.Patterson, S.Ramamoorthy, & T.Opriessnig (2009) Reproductive Failure Experimentally Induced in Sows via Artificial Insemination with Semen Spiked with Porcine Circovirus Type Vet Pathol 46, 707-716 Ellis, J A et al, (1998) Isolation of porcine circovirus-like viruses from pogs with a wasting disease in the USA and Europe J.Vet.Diagn.Invest 10, 3-10 Gordon M.Allan et al, (2007) Temporal distribution of porcine circovirus genogroups recovered from postweaning multisystemic wasting syndrome–affected and –nonaffected farms in Ireland and Northern Ireland J Vet Diagn Invest 19, 668-673 Gordon Allan & Francis McNeill (2006) Diagnosis, Disease, and Control:What doweknow? Proc 19th Congress Inter Pig Vet Soc 1-9 GW Stevenson et al, (2001) Tissue distribution and genetic typing of porcine circoviruses in pigs with naturally occurring congenital tremors J Vet Diagn Invest 13, 57-62 Jeffrey Zimmerman, Locke Karriker, Alejandro Ramirez, (2012) Diseases of Swine, 409- 413 John C.S.Harding, Edward (Ted) G.Clark, John H.Strokappe, Phil I.Willson, & John A.Ellis (1998) Postweaning multisystemic wasting syndrome: Epidemiology and clinical presentation John A.Ellis (2003) Porcine circovirus: An old virus in a new guise causes an emerging disease through a novel pathogenesis Large Animal Veterinary Rounds John A.Ellis et al (2001) Lack of antibodies to porcine circovirus type virus in beef and dairy cattle and horses in western Canada Can Vet J 42, 461-464 John Ellis et al, (1998) Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome Can Vet J Volume 44-51 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 54 Jun Li et al (2010) A mouse model to study infection against porcine circovirus type 2: viral distribution and lesions in mouse Virology Journal 7, 158 J.Segalés, M.Calsamiglia, & M.Domingo (2003) How we diagnose Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome International Symposium on Emerging and Reemerging Pig Diseases Kawashima, K & et al, (2007) Epidemiological investigation of the prevalence and features of postweaning multisystemic wasting syndrome in Japan J Vet Diagn Invest 19, 60-68 Kawashima, K & et al, (2007) Epidemiological investigation of the prevalence and features of postweaning multisystemic wasting syndrome in Japan J Vet Diagn Invest 19, 60-68 Keith H.West et al, (1999) Myocarditis & abortion associated with intrauterine infection of sows with porcine circovirus J Vet Diagn Invest 11, 530-532 MeehanB.M et al, (1998) Characterization of novel cicrovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs J Gen Virol 79, 2171-2179 Meehan B.M, Creenlan J.L, McNulty M.S., & Todd D, (1997) Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circovirus Journal virology 78, 221227 Pallares, F et al, (2002) Porcine cicrovirus type (PCV-2) coinfections in US field cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) J Vet Diagn Invest 14, 515-519 Per Wallgren et al, (2008) The index herd with PMWS in Sweden: Presence of serum amyloid A, circovirus viral load and antibody levels in healthy and PMWSaffected pigs Acta Veterinaria Scandinavica 13-51 Rocell C et al, (1999) Pathological immunohistochemical and in situ hybridization and immunohistochemical detection of new porcine circovirus in formalin fixed tissue from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome J.Virol Patho 120, 59-78 Segales et al (2008) PCV2 genotype definition and nomenclature, veterinary record 162, 867-868 Shibahara et al (2000) Porcine cicrovirus induces B lymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome J Vet Med Sci 62, 1125-1131 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 55 SeungYoon Lee & PilSoo Jeong (2011) The evaluation of the efficacy of PCV2 vaccine HanByol Farm Tech, Seoul, Korea 70-143 Steven D.Sorden (2000) Update on porcine circovirus and postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) Swine health Prod 8, 133-136 Tanja Opriessnig, Xiang-Jin Meng, Patrick G Halbur (2007): Porcine circovirus type 2–associated disease: Update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies J Vet Diagn Invest Timmusk A & et al (2006) Porcine circovirus type replicase binds the capsid protein and an intermediate filament-like protein Journal of General Virology 87, 3215-3223 Taner Karao, (2011) Porcine circovirus type infection in Turkey Vet Fak Derg 58 , 93-97 Woeste K & Grosse Beilage E, (2007) Transmission of agents of the porcine respiratory disease complex (PRDC) between swine herds: a review Part 2-Pathogen transmission via semen, air and living/nonliving vectors Dutsch Tierarztl Wochenschr 366-373 Welch J, Bienek C, Gomperts E, & Simmonds P, (2006) Resistance of porcine circovirus and chicken anemia virus to virus inactivation procedures used for blood products Transfusion 46, 1951-1958 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 56 ... 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 24 3.4.1 Phương pháp quan sát 24 3.4.2 Phương pháp m khám 25 3.4.3 Phương pháp l y m u b o qu n m u làm tiêu b n 25 3.4.4 Phương pháp làm... 3.4.5 Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction): Các nghiên c u ch r ng phương pháp PCR phương pháp nh y nh t ñ phát hi n PCV2 Tuy nhiên, giá thành c a phương pháp cao K thu... t Thái Lan có nghiên c u ch ñã phát hi n PMWS l n t năm 1993 D a vào phương pháp PCR kh o sát sơ b t l nhi m PCV2 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p Thái