Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** NGUYỄN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, PHÂN TỬ VÀ SINH HỌC CỦA SÁN LÁ GAN LỚN FASCIOLA SPP. Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: ĐỘNG VẬT HỌC Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ Hà Nội, 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** NGUYỄN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, PHÂN TỬ VÀ SINH HỌC CỦA SÁN LÁ GAN LỚN FASCIOLA SPP. Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: ĐỘNG VẬT HỌC Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ Hƣớng dẫn khoa học: TS. Phạm Ngọc Doanh Hà Nội, 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cảm ơn Để hoàn thành được công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đối tới ban lãnh đạo Viện sốt rét – ký sinh trùng và côn trùng ương, Khoa sinh học phân tử thuộc viện Sốt rét, phòng Ký sinh trùng, phòng Sau đại học cùng với ban lãnh đạo viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Ngọc Doanh, người thầy luôn theo sát, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này! Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em thuộc khoa Sinh học phân tử - Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng trung ương và phòng Ký sinh trùng viện Sinh thái và tài nguyên Sinh vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài cũng như đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn của tôi. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy/cô trong Hội đồng chấm luận văn đã có những ý kiến đóng góp quý báu để luận văn của tôi được hoàn thiện. Tôi xin chân thành cảm ơn, người thân, bạn bè đồng nghiệp đã ủng hộ tôi và giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến 2 bên Cha, Mẹ đã vất vả sinh thành, nuôi dưỡng cũng như tạo điều kiện để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chồng và con tôi! Những người luôn sát cánh bên tôi và luôn là chỗ dựa tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt nhất luận văn này. Hà Nội, tháng 12 Năm 2014 Nguyễn Thị Thu Huyền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn trung thực và chưa từng công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác.Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực và khoa học của các kết quả trong nghiên cứu này. Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Tác giả Nguyễn Thị Thu Huyền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Mục Lục Lời cảm ơn LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Khái quát chung về đặc điểm hình thái và vòng đời phát triển của sán lá gan lớn Fasciola spp. 4 1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn 4 1.2. Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn 5 1.2. Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới 6 1.2.1. Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn 6 1.2.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người 7 1.2.3. Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 9 1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn tại Việt Nam. 11 1.3.1. Mầm bệnh 11 1.3.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò. 12 1.3.3. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam 12 1.3.4. Tình hình nghiên cứu về vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 13 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG,ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNGVÀPHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu: Sán lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam. 15 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 15 2.2.2. Thời gian nghiên cứu 15 2.3. Nội dung nghiên cứu 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.4. Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1. Phương pháp thu sán lá gan lớn trưởng thành từ bò: 15 2.4.2. Phương pháp thu trứng sán từ bò 16 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn 16 2.4.4. Phương pháp nghiên cứu phân tử 16 2.4.5. Phương pháp nuôi trứng sán lá gan lớn 17 2.4.6. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của miracidium: 17 2.4.7. Phương pháp gây nhiễm miracidium cho ốc 17 2.4.8. Phương pháp nghiên cứu sự hóa nang và sức sống của metacercaria 18 2.4.9. Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và SPPS. 18 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1. Đặc điểm phân loại của sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam 19 3.1. 1. Đặc điểm hình thái sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam 19 3.1.2. Đặc điểm phân tử và quan hệ tiến hóa phân tử của sán lá gan lớn dựa trên trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2 21 3.1.3. Thảo luận 26 3.2. Đặc điểm sinh học của sán lá gan F. gigantica 30 3.2.1. Sự phát triển của trứng sán lá gan F. gigantica 30 3.2.2. Đặc điểm sinh học của miracidium 34 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành 4 Hình 1.2. Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn. 6 Hình 3.1. Hình thái chung của sán lá gan có ruột và tinh hoàn phân nhánh 19 Hình 3.2. Các dạng hình thái của sán lá gan lớn thu từ bò 20 Hình 3.3. Trình tự của TN3-Tây Ninh thể hiện một số vị trí có 2 đỉnh 24 Hình 3.4. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài Fasciola spp. 25 Hình 3.5. Trứng sán lá gan trong nước cất (a) và dung dịch muối 0,85% (b) 31 Hình 3.6. Sự phát triển của trứng sán lá gan ở nhiệt độ 25-34 0 C 32 Hình 3.7. Miracidium của sán lá gan F. gigantica 32 Hình 3.8. Ba loài ốc Lymnaea ở Việt Nam 39 Hình 3.9. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng sán lá gan 44 Hình 3.10. Metacercaria sống (a) và chết ở nước muối 1,5% sau 15 phút (b) 48 Hình 3.11. Ảnh hưởng của các nồng độ muối 3 và 5% lên rau dấp cá, rau diếp và rau ngổ sau thời gian ngâm 15 phút 49 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nước muối 2% đến các loại rau sau khi ngâm 15 phút 50 Hình 3.13. Một muỗng canh muối 20 gram pha trong 1 lít nước để rửa rau sống 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Vật chủ trung gian của F. hepatica ở các nước và vùng địa lý 10 Bảng 3.1. Kích thước sán lá gan lớn thu từ các địa điểm nghiện cứu 20 Bảng 3.2. So sánh kích thước của các nhóm sán lá gan có hình dạngcơ thể khác nhau 21 Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái và phân tử của các mẫu nghiên cứu 22 Bảng 3.4. So sánh trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 2 loài sán lá gan 23 Bảng 3.5. Sự phát triển của trứng sán lá gan ở các điều kiện khác nhau 31 Bảng 3.6. Sự phát triển của trứng sán ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 33 Bảng 3.7. Thời điểm trứng sán nở trong ngày 35 Bảng 3.8. Khả năng sống của miracidium ở điều kiện 26-28 0 C 36 Bảng 3.9. Độ sâu ưa thích của miracidium 38 Bảng 3.10. Kết quả gây nhiễm miracidium sán lá gan cho các loài ốc 40 Bảng 3.11. Thời gian cercaria thoát khỏi ốc và hóa nang 45 Bảng 3.12. Sức sống của nang sán trong các nồng độ muối khác nhau 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHỮ VIẾT TẮT ADN : Axit deoxyribonucleic BL : Body length (chiều dài cơ thể) PBS : Phosphate-buffered Saline BW : Body width (chiều rộng cơ thể) CO1 : Cytochrome c oxidase subunit 1 CS : Cộng sự CT : Côn trùng CW : Cone width (chiều rộng đầu sán) ITS : Internal Transcribed Spacer (đoạn giao gen) KST : Ký sinh trùng NaCl : Natri clorua NAD1 : Nicotinamide dehydrogenase subunit 1 PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polymerase) SR : Sốt rét WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) 1 MỞ ĐẦU 1. Sự cần thiết của đề tài Bệnh sán lá gan lớn gây nên bởi các loài sán lá Fasciola spp., phổ biến là 2 loài Fasciola hepatica Linnaeus, 1758và Fasciola giganticaCobbold, 1855, có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe gia súc và gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi.Hơn thế nữa, sán lá gan còn gây bệnh cho người.Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) bệnh sán lá gan lớn là một trong những vấn đề y tế quan trọng và luôn được quan tâm nghiên cứu. Người và động vật nhiễm bệnh sán lá gan lớn do ăn phải rau, cỏ hoặc uống nước lã có chứa ấu trùng cảm nhiễm metacercaria. Sán trưởng thành ký sinh ở gan vật chủ, gây tổn thương chủ yếu ở gan, nhưng cũng có thể gây tổn thương ngoài gan khi ký sinh lạc chỗ (Dalton 1999). Trong vòng đời phát triển của sán lá gan lớn, trứng được thải ở gan vật chủ, theo ống dẫn mật xuống ruột và ra môi trường cùng với phân. Gặp điều kiện thuận lợi, trứng phát triển và nở ra thành ấu trùng miracidium.Miracidium bơi trong nước, tìm vật chủ trung gian thích hợp để xâm nhập và phát triển thành các giai đoạn ấu trùng sporocyst, redia và cercaria.Cercaria trưởng thành thoát khỏi ốc, rụng đuôi hoá nang bám vào thực vật thuỷ sinh hoặc trôi nổi trong nước. Khi vật chủ chính ăn phải thực vật thuỷ sinh hoặc uống nước có chứa metacercaria của sán lá gan lớn thì chúng phát triển thành con trưởng thành ký sinh ở gan. Vật chủ trung gian thích hợp của sán lá gan lớn là ốc nước ngọt, thường là ốc thuộc họ Lymnaeidae.Tuy nhiên, ốc vật chủ trung gian của các loài sán lá gan lớn, thậm chí của cùng một loài ở các vùng địa lý khác nhau có thể là những loài ốc khác nhau (Dalton 1999).Vì vậy, việc xác định chính xác vật chủ trung gian của sán lá gan lớn rất quan trọng trong việc phòng chống bệnh sán lá gan lớn cho gia súc và người. [...]... Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân tử và sinh học của sán lá gan lớn Fasciola spp ở Việt Nam 2 Mục tiêu của đề tài: Làm sáng tỏ đặc điểm phân loại và sinh học của sán lá gan lớn Fasciola spp ở Việt Nam 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: - Cung cấp dẫn liệu chính xác về phân loại và đặc điểm sinh học của sán lá gan lớn ở Việt Nam - Tạo cơ sở khoa học cho công tác phòng chống sán lá gan lớn. .. rDNA-ITS2 của sán lá gan lớn 2.3.3 Sự phát triển của trứng sán lá gan lớn và đặc điểm sinh học của miracidium 2.3.4 Tính mẫn cảm của ốc Lymnaeidae với ấu trùng sán lá gan lớn qua gây nhiễm thực nghiệm 2.3.5 Sức sống của metacercaria sán lá gan lớn các nồng độ muối 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thusán lá gan lớn trưởng thành từ bò: - Mua gan, túi mật của bò từ các lò mổ tại địa điểm nghiên cứu. .. tiến hóa và phòng chống bệnh sán lá gan ở người và động vật, và cần được làm sang tỏ 14 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu: Sán lá gan lớnFasciola spp ở Việt Nam 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu - Nghiên cứu tại thực địa: Thu mẫu sán lá gan lớn ở bò tại lò mổ của 3 tỉnh thành đại diện cho 3 miền: Bắc, Trung, Nam là Hà... Khắc Lực và cs (2010) nghiên cứu tại Quảng Nam, đã xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên 245 trâu bò cho thấy tỷ lệ nhiễm chung là 40,8% Có thể nói, tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò tại một số địa điểm ở nước ta vẫn còn cao 1.3.3 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam Những ca bệnh sán lá gan lớn ở người ở Việt Nam đã được chẩn đoán từ lâu Gần đây, số bệnh nhân sán lá gan ngày... trường Vì vậy, nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của sán lá gan sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phòng bệnh thích hợp 1.2 Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới 1.2.1 Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn Các nghiên cứu đã cung cấp những bằng chứng cho thấy tính hiệu lực của 2 loài F hepatica và F gigantica, chúng khác nhau về hình thái, vật chủ 6 chính và vật chủ.. .Ở Việt Nam, số ca bệnh mắc sán lá gan lớn ở người trong những năm gần đây tăng đáng kể, đặc biệt là ở miền Trung và miền Nam (Trần Vinh Hiển và CS 2006; Triệu Nguyên Trung và CS 2012).Vì vậy, sán lá gan lớn và bệnh sán lá gan lớn ở nước ta được đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Tuy nhiên, nhiều vấn đề về định loại hình thái, phân tử và vật chủ trung gian chưa thống nhất... tiếp ở 30 phút Metacercaria được xác định là chết khi không còn vận động và các tế bào bị co lại, thay đổi cấu trúc 2.4.9 Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và chỉ số đo hình thái được tính theo ( min – max) mean 18 STDEV CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm phân loại của sán lá gan Fasciola spp ở Việt Nam 3.1.1 Đặc điểm hình thái sán lá ganFasciola spp ở Việt Nam Sán lá gan. .. Hà Nội, Nghệ An và Tây Ninh - Phân tích phòng thí nghiệm: + Khoa Sinh học Phân tử - Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn Trùng Trung ương + Phòng Ký sinh trùng – Viện Sinh thái và tài nguyên Sinh vật 2.2.2.Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/ 2013 – 12/2014 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Đặc điểm hình thái sán lá gan lớn thu từ bò tại lò mổ ở Hà Nội, Nghệ An và Tây Ninh 2.3.2 Đặc điểm phân tử trình tự ITS1-5.8S... cập 1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn tại Việt Nam 1.3.1 Mầm bệnh Một số tác giả cho rằng cả 2 loài sán lá gan lớn ều lưu hành ở Việt Nam (Phan Địch Lân 1985; Hồ Thị Thuận và Nguyễn Ngọc Phương1987; Lê Hữu Khương và cs 2001).Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây phân tích phân tử cho thấy rằng chỉ có loài F gigantica và một số cá thể lai giữa loài F hepatica và F gigantica(Lê Thanh Hòa và cs 2002;... lệ chiều dài/rộng của sán dao động lớn (từ 2,2 - 6,0) So với số liệu của Periago et al (2006) thì đa số sán giống F gigantica (BL/BW >3,4), một số sán có đặc điểm của loài F hepatica (BL/BW . phân loại của sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam 19 3.1. 1. Đặc điểm hình thái sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam 19 3.1.2. Đặc điểm phân tử và quan hệ tiến hóa phân tử của sán lá gan lớn dựa. chung về đặc điểm hình thái và vòng đời phát triển của sán lá gan lớn Fasciola spp. 1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn Vị trí phân loại của sán lá gan lớn như. về đặc điểm hình thái và vòng đời phát triển của sán lá gan lớn Fasciola spp. 4 1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn 4 1.2. Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn