ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ SVTH : LÊ THỊ THANH NGỌC MSSV : 60501840 GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2011 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG ii SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin trân trọng gửi lời biết ơn chân thành nhất đến Cha Mẹ, và Anh Chị cùng những ngƣời thân đã luôn ủng hộ và động viên em. Em xin chân thành cảm ơn Cô Nguyễn Thúy Hƣơng, ngƣời đã tận tình dìu dắt, hết lòng truyền đạt kinh nghiệm đồng thời tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt bài luận văn này. Cùng các thầy cô giáo trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Bách Khoa Tp.HCM, những ngƣời đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cơ bản. Em xin cảm ơn:  Ban Giám Hiệu trƣờng ĐH Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Hóa Học, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài.  Tập thể lớp HC05BSH luôn chia sẻ động viên tôi trong suốt quá trình học và thực hiện đề tài. Trong quá trình thực hiện đề tài do còn thiếu nhiều kinh nghiệm thực tế nên không tránh khỏi những sai sót. Em mong các Thầy Cô chỉ bảo thêm, giúp em hoàn thiện bản thân và đạt kết quả tốt hơn trong tƣơng lai. Cuối cùng, xin kính chúc Cha Mẹ, quý Thầy Cô dồi dào sức khỏe và gặt hái thật nhiều thành công trong công việc và cuộc sống! Sinh viên thực hiện Lê Thị Thanh Ngọc Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG iii SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC TÓM TẮT Trƣớc tiên đƣa ra các nguyên lý, mục đích hƣớng đến và quy trình của việc định danh vi sinh vật trên lý thuyết. Dựa vào đó so sánh và phân tích ƣu điểm, nhƣợc điểm giữa các phƣơng pháp định danh vi sinh vật. Sau dó nghiên cứu tình huống giải trình tự gen 16s rDNA định danh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong các mẫu probiotic L- bio, Biolac, Probio, Antibio, Sau khi chọn sản phẩm là 4 mẫu probiotic trên, chuẩn bị hóa chất và các thiết bị cần thiết, tiến hành bằng cách thực hiện phƣơng pháp PCR khuếch đại đoạn 550 bp của 16S, kiểm tra sản phẩm khuếch đại bằng phƣơng pháp điện di, thu nhận kết quả, đƣa ra các nhận xét khách quan dựa trên thực tế. Đƣa ra kết luận và các nhận xét cuối về các phƣơng pháp định danh vi sinh vật theo lý thuyết và dựa trên thực tế. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG iv SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC MỤC LỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ………………………………………….………………… vi DANH MỤC HÌNH …………… …………… ……………….……………… vii DANH MỤC BẢNG ………………….……… ……………….……………… ix CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG 1 1.1 Giới thiệu về vi sinh vật 1 1.1.1 Lịch sử phát hiện của vi sinh vật 1 1.1.2 Phân loại các loại vi sinh vật 1 1.1.3 Ứng dụng của vi sinh vật 1 1.2 Giới thiệu chung về định danh vi sinh vật 2 1.2.1 Nguyên lý cơ bản 2 1.2.2 Mục đích của việc định danh 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP 4 2.1 Định danh bằng phƣơng pháp truyền thống 4 2.2 Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen 5 2.2.1 Phân tích acid nucleic 5 2.2.2 Phân tích ADN plasmid 5 2.2.3 Phân tích ADN nhiễm sắc thể 10 2.3 Phƣơng pháp lai ADN 14 2.3.1 Các phƣơng pháp đánh dấu 15 2.3.2 Quá trình lai: 19 2.3.3 Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN. 24 2.4 Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN 28 2.4.1 Kỹ thuật nhân gene PCR (Polymerase Chain Reaction) 28 2.4.2 Giải trình tự ADN 36 CHƢƠNG 3: NGHIÊN CỨU TÌNH HUỐNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S rDNA ĐỊNH DANH VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS TRONG CÁC MẪU PROBIOTIC DÙNG CHO NGƢỜI 51 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG v SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC 3.1 Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus: 51 3.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus: 51 3.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong Probiotic: 54 3.2 Chọn sản phẩm 56 3.3 Hóa chất 57 3.4 Dụng cụ và thiết bị 59 3.5 Phƣơng pháp tiến hành 62 3.5.1 Phƣơng pháp chạy PCR 64 3.5.2 Phƣơng pháp giải trình tự gen 16S rDNA 67 3.6 Kết quả và nhận xét 72 3.6.1 Kết quả phân lập 72 3.6.2 Kết quả chạy PCR và giải trình tự 76 CHƢƠNG 4: TỔNG KẾT 91 4.1 Định danh bằng phƣơng pháp truyền thống 91 4.2 Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen 91 4.2.1 Phân tích acid nucleic, Phân tích ADN plasmid, Tách plasmid 91 4.2.2 Phân tích ADN nhiễm sắc thể 92 4.2.3 Các phƣơng pháp đánh dấu: 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG vi SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC CÁC TỪ VIẾT TẮT A : Adenin AND : Acid desoxyribonucleic ARN : Acid ribonucleic Bp : Base pair TBE : Tris – borate EDTA TE : Tris – EDTA tRNA : Transfer ribonucleic acid PCR : Polymerase Chain Reaction RPM : Revolutions per minute MDS : Multy drug resistant MRS : Man Rogosa Sharpe MMDB : Molecular Modeling database dATP : deoxyadenosin – triphosphate dCTP : deoxycytidin – triphosphate ddNTP : dideoxynucleoside – triphosphate dGTP : dideoxyguanosin – triphosphate dNTP : deoxynicleoside – triphosphate dTTP : deoxythymidin – triphosphate MBS : Membrane binding solution MWS : Mambrane wash solution Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG vii SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Plasmid vòng 6 Hình 2.2: Streptomyces và Borrelia 6 Hình 2.3: Di chuyển của plasmid mạch thẳng (L) và siêu xoắn (OC) khi điện di 8 Hình 2.4: Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể 11 Hình 2.5: Kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori 20 Hình 2.6: Minh hoạ kỹ thuật lai trong môi trƣờng dịch thể 21 Hình 2.7: Mô tả phƣơng pháp chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật Southern Blot 23 Hình 2.8: Minh hoạ bƣớc chuyển ADN lên màng 24 Hình 2.9: Vị trí đặt lƣợc sau khi đổ gel 43 Hình 2.10: Tra mẫu trên thiết bị chạy gel 48 Hình 2.11: Thiết bị giải trình tự ADN tự động, (3100-Avant Genetic Analyzer) 50 Hình 3.1: Cấu trúc vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 52 Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus trên môi trƣờng MRS 52 Hình 3.3: Tủ cấy, dụng cụ nuôi cấy và kính hiển vi 59 Hình 3.4: Máy ly tâm và bếp điện từ 60 Hình 3.5: Máy chạy PCR 60 Hình 3.6: Bộ điện di Agarose 61 Hình 3.7: Máy chụp hình gel CHEMI Doc-Biorad 61 Hình 3.8: Máy ABI 3130 XL của Applied Biosystem 62 Hình 3.9: Các bƣớc tinh sạch DNA 69 Hình 3.10: Hình khuẩn lạc chủng A1 trên MT MRS ở nồng độ 10 -5 , 10 -6 . 72 Hình 3.11: Hình khuẩn lạc chủng A2 trên MT MRS ở nồng độ 10 -5 , 10 -6 73 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG viii SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC Hình 3.12: Hình dạng chủng A2 dƣới kính hiển vi 73 Hình 3.13: Hình hai loại khuẩn lạc trên MT MRS ở nồng độ 10 -6 . 74 Hình 3.14: Hình ảnh khuẩn lạc chủng A3 và A4 trên MT MRS 74 Hình 3.15: Hình dạng chủng A3 dƣới kính hiển vi 75 Hình 3.16: Hình dạng chủng A4 dƣới kính hiển vi 75 Hình 3.17: Hình khuẩn lạc chủng A5 trên MT MRS ở nồng độ 10 -2 , 10 -3 . 76 Hình 3.18: Hình dạng chủng A2 dƣới kính hiển vi 76 Hình 3.19: Kết quả điện di phát hiện sản phẩm khuếch đại 77 Hình 3.20: Kết quả điện di phát hiện sản phẩm khuếch đại sau khi tinh sạch 77 Hình 3.21: Tín hiệu huỳnh quang chủng A1 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 79 Hình 3.22: Mạng Nucleotide chủng A1 79 Hình 3.23: Tín hiệu huỳnh quang chủng A2 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 81 Hình 3.24: Mạng Nucleotide chủng A2 81 Hình 3.25: Tín hiệu huỳnh quang chủng A3 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 83 Hình 3.26: Mạng Nucleotide chủng A3 83 Hình 3.27: Tín hiệu huỳnh quang chủng A4 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 85 Hình 3.28: Mạng Nucleotide chủng A4 85 Hình 3.29: Tín hiệu huỳnh quang chủng A5 đƣợc máy ABI 3130XL ghi nhận 87 Hình 3.30: Mạng Nucleotide chủng A5 87 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG ix SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Nồng độ agarose và kích thƣớc mẫu ADN tƣơng ứng 9 Bảng 2.2: Một số enzyme cắt hạn chế đƣợc dùng cho kỹ thuật PFGE. 13 Bảng 2.3: Một số cơ chất dùng cho đánh dấu trực tiếp 16 Bảng 2.4: Liệt kê một số hệ thống đánh dấu gián tiếp. 17 Bảng 2.5: Một số ví dụ về ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định vi sinh vật. 30 Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR 34 Bảng 3.1: Các phản ứng sinh hóa định danh Lactobacillus 54 Bảng 3.2: Cách pha PCR mix 65 Bảng 3.3: Kết quả cấy phân lập chế phẩm Anti bio trên môi trƣờng MRS. 72 Bảng 3.4: Kết quả cấy phân lập chế phẩm Probio trên môi trƣờng MRS. 73 Bảng 3.5: Kết quả cấy phân lập chế phẩm Biolac trên môi trƣờng MRS. 74 Bảng 3.6: Kết quả cấy phân lập chế phẩm L-bio trên môi trƣờng MRS. 76 Bảng 3.7: Nồng độ sản phẩm PCR sau khi tinh sạch 78 Bảng 3.8: Kết quả tra trình tự mẫu A1 từ trang web NCBI BLAST 80 Bảng 3.9: Kết quả tra trình tự mẫu A2 từ trang web NCBI BLAST 82 Bảng 3.10: Kết quả tra trình tự mẫu A3 từ trang web NCBI BLAST 84 Bảng 3.11: Kết quả tra trình tự mẫu A4 từ trang web NCBI BLAST 86 Bảng 3.12: Kết quả tra trình tự mẫu A5 từ trang web NCBI BLAST 88 Bảng 3.13: Kết quả định danh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong Probiotic 88 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG 1 SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG 1.1 Giới thiệu về vi sinh vật 1.1.1 Lịch sử phát hiện của vi sinh vật Vi sinh vật không phải là một nhóm phân loại trong sinh giới mà là bao gồm tất cả các sinh vật có kích thƣớc hiển vi, không thấy rõ đƣợc bằng mắt thƣờng, do đó phải sử dụng kính hiển vi thƣờng hoặc kính hiển vi điện tử. Ngoài ra muốn nghiên cứu vi sinh vật ngƣời ta phải sử dụng tới phƣơng pháp nuôi cấy vô khuẩn. Mô tả hình thái nhiều loại vi sinh vật là một ngƣời Hà Lan vốn là ngƣời học nghề trong một hiệu buôn vải, đó là Antonie van Leeuwenhoek (1632 – 1723). Ông đã tự chế tạo ra trên 400 kính hiển vi cầm tay, có gƣơng hội tụ ánh sáng, có ốc điều chỉnh Leerwenhoek đã lần lƣợt quan sát mọi thứ có xung quanh mình. Năm 1674, ông nhìn thấy các vi khuẩn và động vật nguyên sinh, ông gọi là các “động vật vô cùng nhỏ bé”. 1.1.2 Phân loại các loại vi sinh vật Phần lớn vi sinh vật thuộc về ba nhóm Cổ khuẩn, Vi khuẩn và Nguyên sinh. Trong giới Nấm, thì nấm men (yeast), nấm sợi (filamentous Fungi) và dạng sợi (mycelia) của mọi nấm lớn đều đƣợc coi là vi sinh vật. Nhƣ vậy là vi sinh vật không có mặt trong hai giới Động vật và Thực vật. Ngƣời ta ƣớc tính trong số 1.5 triệu loài sinh vật có khoảng 200.000 vi sinh vật (100.000 loài động vật nguyên sinh và tảo, 90.000 loài nấm, 2.500 loài vi khuẩn lam và 1.500 loài vi khuẩn). Tuy nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới đƣợc phát hiện, trong đó có không ít loài vi sinh vật. Virus là một dạng đặc biệt chƣa có cấu trúc cơ thể cho nên chƣa đƣợc kể đến trong số 200.000 loài vi sinh vật nói trên. Số virus đã đƣợc đặt tên là khoảng 4000 loài. 1.1.3 Ứng dụng của vi sinh vật Vi sinh vật sống trong đất và trong nƣớc tham gia tích cực vào quá trình phân giải các xác hữu cơ trong tự nhiên, phân giải các chất thải công nghiệp và sinh hoạt. [...]... về định danh vi sinh vật 1.2.1 Nguyên lý cơ bản Vi c định danh vi sinh vật sử dụng công nghệ phân tử để đánh giá cụ thể vùng trong hệ gen và xác định vi sinh vật thuộc giống, loài duy nhất nào Công nghệ này tƣơng tự với các kỹ thuật đƣợc áp dụng rất thành công trong vi c nhận dạng con ngƣời Vì vậy, vi c nhận dạng – định danh vi sinh vật đƣợc đƣợc nhắc đến nhƣ kỹ thuật xác định dấu vân tay vi sinh vật. .. dạng vi sinh vật Nếu nhƣ các phƣơng pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tƣợng vi sinh vật thì phƣơng pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tƣợng vi sinh vật Nói chung các phƣơng pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu là: + Phân tích acid nucleic + Phân tích protein + Phân tích lipopolysaccharid + Hóa phân loại học 2.2.1 Phân tích acid nucleic Kỹ thuật phân tích... vi c định danh Vi c định danh vi sinh vật nhằm xác định nhanh chủng loài của nó, đánh giá mức độ nguy hiểm, khả năng lây truyền của vi sinh vật, nắm đƣợc các hình thái phát triển của vi sinh vật nhằm đƣa ra giải pháp hợp lý Ví dụ khi chúng ta xác định vi khuẩn gây bệnh lao, chúng ta có thể nhanh chóng cách ly ngƣời bệnh, thực hiện các quy trình vệ sinh, tiêm chủng giúp ngăn ngừa sự phát triển của vi. .. khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác Nhƣ vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã đƣợc phân loại dựa vào kiểu bacteriocin 2.2 Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh. .. dịch Định danh vi sinh vật ngày nay đƣợc đánh giá là một ngành kỹ thuật then chốt hỗ trợ cho các ngành sản xuất nhƣ: nông nghiệp, lâm nghiệp, y tế, dƣợc phẩm…v…v GVHD: PGS TS NGUYỄN THÚY HƢƠNG SVTH: LÊ THỊ THANH NGỌC 3 Luận văn tốt nghiệp CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Định danh bằng phƣơng pháp truyền thống Trƣớc đây vi c phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình thái, sinh. .. phức hệ hoạt động Phƣơng pháp này khá nhạy nhƣng hạn chế lớn nhất của nó là cần thiết bị kích hoạt và đo bức xạ huỳnh quang 2.3.2 Quá trình lai: Nói chung quá trình lai (Hybridization) đƣợc tiến hành theo một trong 3 cách sau để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai trong dịch thể và lai với chất mang (solid support) a Kỹ thuật lai với vi sinh vật GVHD: PGS TS NGUYỄN... THANH NGỌC 9 Luận văn tốt nghiệp 2.2.3 Phân tích ADN nhiễm sắc thể Phƣơng pháp phân tích ở đây bao gồm vi c tách ADN của nhiễm sắc thể và cắt bằng enzyme cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh vật với nhau Một chú ý khi tách ADN nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do nguyên nhân cơ học Các mảnh cắt nên có kích thƣớc nhỏ hơn hoặc bằng 50 kb Vi c tách các mảnh cắt đó đƣợc thực hiện... vi khuẩn Vi c này là hết sức cần thiết nhằm tránh sự lây lan đặc biệt khi ngƣời bệnh sinh hoạt trong môi trƣờng tập thể Bên cạnh đó, vi c định danh vi sinh vật còn đóng góp cho vi c xây dựng cơ sở dữ liệu quan trọng, giúp các nhà nghiên cứu vacxin, các nhà sản xuất thực phẩm đánh giá chất lƣợng sản phẩm với chi phí hợp lý mà vẫn đạt yêu cầu an toàn vi sinh ngày một khắc khe của các tổ chức vệ sinh an... màng nitrocellulose hoạt hoá hay có độ bền cho các phép lai Đối với công vi c định loại vi sinh vật với kỹ thuật cố định trên màng cho phép lai ADN thì cần chấm mẫu (là ADN sạch, hay tế bào vi sinh vật hoặc sinh phẩm có vi sinh vật nghiên cứu) lên màng thích hợp Mẫu đƣợc ly giải và ADN bị biến tính, sau đó ADN đƣợc cố định trên màng khi đƣa vào tủ sấy tại 80oC trong 2 giờ hoặc đƣa vào xử lý với tia UV... thành công trong vi c nhận dạng con ngƣời Vì vậy, vi c nhận dạng – định danh vi sinh vật đƣợc đƣợc nhắc đến nhƣ kỹ thuật xác định dấu vân tay vi sinh vật Vi c định danh vi sinh vật trên cơ bản là sử dụng phƣơng pháp so sánh Để xác định một vi sinh vật chƣa biết, ta so sanh một chuỗi của nó tƣơng ứng với chuỗi đã đƣợc xác đinh Sự tƣơng đồng giữa hai chuỗi sẽ cho chúng ta kết quả dƣơng tính Các cá thể