BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUẾ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUẾ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS .TS. Nguyễn Thị Kiều Anh 2. DS. Nguyễn Thị Kim Oanh Nơi thực hiện: Trung tâm tương đương sinh học -viện kiểm nghiệm thuốc trung ương HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh – người thầy đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ của Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Dược lực – Trường đại học Dược Hà Nội, đã nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới DS Nguyễn Thị Kim Oanh – người thầy, người chị đã giúp đỡ, hướng dẫn và truyền cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong thời để tôi hoàn thành khóa luận. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu và các thầy cô giáo của trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được trau dồi những kiến thức và hiểu biết vô cùng quý giá trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng , tôi cảm ơn toàn thể những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013. Lê Thị Quế MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1. Chương 1: TỔNG QUAN 2 1.1. HOẠT CHẤT LORATADINE VÀ PSEUDOEPHEDRIN. 2 1.1.1. Hoạt chất Loratadin 2 1.1.1.1. Công thức cấu tạo 2 1.1.1.2. Tính chất lý hóa 2 1.1.1.3. Dược động học. 2 1.1.1.4. Tác dụng 3 1.1.1.5 .Chỉ định, liều dùng 4 1.1.2.2. Tính chất lý hóa 4 1.1.2.2. Dược động học 5 1.1.2.3. Tác dụng. 5 1.1.2.4. Chỉ định ,liều dùng 6 1.1.3. Các nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin 6 1.2. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 8 1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ. 8 1.2.2. Các bộ phận của máy phân tích khối phổ 9 1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu (inlet) 9 1.2.2.2. Bộ nguồn ion ( Ion source) 9 1.2.2.3. Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube) 10 1.2.2.4. Bộ phận thấu kính hội tụ (tube lense) 10 1.2.2.5.Bộ phận phân tích khối (mass analyze) 10 1.2.2.6. Bộ phận phát hiện (detector). 11 1.2.2.7. Hệ thống bơm chân không (high vacuum system). 11 1.2.3. Ưu nhược điểm của hệ thống 11 1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) 11 1.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 12 1.3.1. Độ chọn lọc – độ đặc hiệu . 12 1.3.2. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ). 13 1.3.3. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính. 13 1.3.4. Độ đúng. 13 1.3.5.Độ chính xác. 13 1.3.6. Hiệu suất chiết. 13 1.3.7. Độ ổn định. 14 CHƯƠNG 2 . ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 14 2.1. NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ. 14 2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. 15 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. 15 2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 15 2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu 15 2.4.2. Xây dựng phương pháp phân tích 17 2.4.2.1. Xây dựng điều kiện khối phổ và chuẩn nội. 17 2.4.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 18 2.4.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu. 18 2.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích. 19 2.4.3.1. Độ chọn lọc – đặc hiệu 19 2.4.3.3. Xác định giới hạn định lượng dưới 19 2.4.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày. 19 2.4.3.5. Hiệu suất chiết 20 2.4.3.6. Độ ổn định. 20 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 . XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG. 20 3.1.1. Xác định điều kiện khối phổ và chuẩn nội 21 3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký. 24 3.1.3. Phương pháp xử lý mẫu. 26 3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG. 29 3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc. 29 3.2.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính. 30 3.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ). 31 3.2.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày. 32 3.2.5. Hiệu suất chiết. 36 3.2.6. Độ ổn định 38 3.2.7. Bước đầu ứng dụng vào định lượng Loratadin và Pseudoephedrin trên mẫu thực. 40 3.3. BÀN LUẬN. 42 3.3.1. Vấn đề lựa chọn phương pháp phân tích đồng thời LOR và PES trong huyết tương bằng LC – MS. 42 3.3.2. Về xây dựng phương pháp định lượng. 43 3.3.3. Về thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng. 45 3.3.4. Về tính khả thi của phương pháp khi ứng dụng trên phân tích mẫu thực. 45 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1. Kết luận 45 4.2. Kiến nghị. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CP Chất phân tích C thực C max DD DĐH Nồng độ thực Nồng độ đỉnh Dung dịch Dược động học EtOH FDA IS Ethanol Cơ quan quản lý thực dược phẩm Mỹ Chất chuẩn nội LOR LLOQ MeCN Loratadin Giới hạn định lượng dưới Acetonitril MeOH MQC m/z HESI Methanol Mẫu kiểm tra ở nồng độ trung bình Khối lượng/ điện tích Ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt HPLC HQC LC- MS/MS LQC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao Sắc ký lỏng khối phổ hai lần Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp PA Hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (Pure Analysis) PES Pseudoephedrin QC Mẫu kiểm tra r Hệ số tương quan RSD% Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ STT TB Số thứ tự Trung bình TLTK T max Tài liệu tham khảo Thời gian đạt nồng độ đỉnh t R Thời gian lưu DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN Tên Bảng Trang Bảng 2.1: Cách chuẩn bị mẫu chuẩn LOR,PES và IS trong MeOH………… 16 Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn LOR và PES… 16 Bảng 2.3:Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn…………………………… 17 Bảng 2.4. Cách chuẩn bị mẫu QC…………………………………… 17 Bảng 3.1: Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp………… 30 Bảng 3.2. Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính……………… 31 Bảng 3.3. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới………………… 33 Bảng 3.4:Kết quả thẩm định độ đúng , độ chính xác trong ngày của phương pháp với LOR……………………………………………………… 34 Bảng 3.5:Kết quả thẩm định độ đúng , độ chính xác trong ngày của phương pháp với PES……………………………………………………………… 34 Bảng 3.6 : Độ đúng, độ chính xác khác ngày với LOR………………… 35 Bảng 3.7 : Độ đúng, độ chính xác khác ngày với PES…………………… 36 Bảng3.8: Hiệu suất chiết của IS……………………………………………… 37 Bảng 3.9: Hiệu suất chiết của LOR………………………………………… 38 Bảng 3.10: Hiệu suất chiết của PES………………………………………… 38 Bảng 3.11: Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng………… 40 Bảng 3.12: Độ ổn định của mẫu sau xử lý……………………………… 41 Bảng 3.13. Nồng độ LOR và PES trong các mẫu thực………………… 42 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN Tên hình trang Hình 2.1.Các bộ phận của máy phân tích khối phổ……………………… 9 Hình 3.1: Tối ưu Cone Voltage ……………………………………… 23 Hình 3.2: Lựa chọn mảnh con và tối ưu hóa thế phân mảnh ……………… 24 Hình 3.3 : Sắc ký đồ mẫu chuẩn LOR,PES và IS với điều kiện sắc ký đã xây dựng……………………………………………………………………… 27 Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng khi chiết lỏng – lỏng bằng hỗn hợp dung môi Diethyl ether: Chloroforrm (8:2)…………………………… 28 Hình 3.5: Quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng với hệ dung môi Diethyl ether: Chloroform (8: 2)…………………………………………… 29 Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa LOR, PES và IS…………………. 30 Hình 3.7: Sắc ký đỗ mẫu huyết tương trắng………………………………… 30 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỉ số diện tích pic LOR/IS và nồng độ LOR trong huyết tương…………………………… 32 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỉ số diện tích pic PES/IS và nồng độ PES trong huyết tương……………………………………………………… 32 Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó tại thời điểm 1.5h sau khi uống thuốc…………………………………………………………………………… 42 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó tại thời điểm 7h sau khi uống thuốc……………………………………………………………………………. 43 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm mũi dị ứng là bệnh thường gặp trong các bệnh lý của đường hô hấp trên. Bệnh phổ biến ở các nước công nghiệp đang phát triển do tình trạng ô nhiễm môi trường, nhất là tại những nước có khí hậu cận nhiệt đới như Việt Nam. Đối với bệnh lý trên việc phối kết hợp các hoạt chất mà đặc biệt là việc phối hợp Loratadin – một thuốc kháng Histamin thế hệ hai có tác dụng làm giảm các triệu chứng của viêm mũi dị ứng và Pseudoephedrin – một thuốc có tác dụng làm giảm xung huyết đã ngày càng trở nên hữu ích và mang đến hiệu quả điều trị rõ rệt. Hiện nay trên thị trường dược phẩm đã có rất nhiều các sản phẩm bào chế kết hợp hai thành phần hoạt chất trên ở dạng đặc biệt : viên nén giải phóng chậm, viên giải phóng có kiểm soát. Việc kết hợp này đã giúp làm đơn giản hóa việc dùng thuốc của bệnh nhân do giảm được số lần dùng thuốc, giảm tác dụng bất lợi và do đó làm tăng sinh khả dụng của thuốc. Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu bào chế các dạng thuốc viên giải phóng có kiểm soát hay giải phóng kéo dài chứa đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin[5], [7]. Hiện tại, bộ môn bào chế – trường đại học dược Hà Nội cũng đang nghiên cứu bào chế viên giải phóng có kiểm soát với tên Clarinase - VN. Tuy nhiên cho đến nay, mới chỉ có các nghiên cứu định lượng đồng thời hai hoạt chất trên trong chế phẩm[6], [9], [10] mà vẫn chưa có nghiên cứu nào về phương pháp định lượng đ ồng thời hai hoạt chất trên trong dịch sinh học bằng cách sử dụng các phương pháp có độ nhậy và chính xác cao như LC, GC, LC-MS Để đóng góp một phương pháp phân tích có đủ độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác ứng dụng phục vụ cho công tác nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của các dạng thuốc chứa Loratadin và Pseudoephedrin, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời Loratdin và Pseudoephedrin trong huyết tương bằng LC-MS” với các mục tiêu sau: 1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích đồng thời Loratdin và Pseudoephedrin trong huyết tương bằng LC-MS. 2. Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng được theo quy định của FDA – Mỹ. [...]... nhanh và tiết kiệm thời gian có thể sử dụng định lượng nhanh hàm lượng PES và LOR trong các chế phẩm bào chế kết hợp bằng các máy đo quang thông dụng [9]  Các nghiên cứu nước ngoài  Các nghiên cứu định lượng đồng thời LOR và PES trong dịch sinh học:  Nghiên cứu “xác định đồng thời Loratadin và Pseudoephedrine sulfat trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ - kỹ thuật phun điện... loại 10- 100, 100- 1000µL – Eppendorf (Đức); - Bình định mức, pipet thủy tinh classA , Prolabo – Pháp 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU  Trong xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích  Mẫu trắng: là các mẫu huyết tương trắng của chó không có LOR và PES  Mẫu tự tạo: là các mẫu huyết tương trắng của chó có LOR và PES ở nồng độ thích hợp  Trong ứng dụng định lượng trên mẫu thực:  Viên Clarinase ® tablet (Shering... lại sắc đồ và tỷ lệ đáp ứng pic LOR/IS, PES/IS tại các nồng độ tương ứng, xác định tương quan giữa tỷ lệ đáp ứng pic và nồng độ LOR, PES có trong mẫu; xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r Từ phương trình hồi quy đã xây dựng tính lại nồng độ của từng mẫu, xác định độ đúng của mỗi nồng độ 2.4.3.4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày  Độ đúng, độ chính xác trong ngày... đúng của phương pháp cho LOR và PES lần lượt là 100,4% và 99,5% với giá trị RSD tương ứng là 0,72% và 0,77% [6]  Tác giả Nguyễn Minh Trí và Nguyễn Mã Huy Thanh đã định lượng đồng thời hai hoạt chất Loratadin và Pseudoephedrin sulfat trong chế phẩm viên nén bằng phương pháp quang phổ tử ngoại đạo hàm Kết quả cho khoảng tuyến tính 0,015 – 0,035 mg/mL với LOR và 0,025 – 0,84 mg/mL với PES, độ đúng và độ... độ tuyến tính : 5 - 1000 ng/mL với PES và 0,05 – 10 ng/mL với LOR Giới hạn định lượng : 10 pg/mL với LOR và 50 pg/mL với PES [16]  Các nghiên cứu định lượng đồng thời LOR và PES trong chế phẩm thuốc:  Một nghiên cứu taị đại học Dược hoàng gia Malaysia đã định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrine hydrochlorid trong chế phẩm viên nén bằng phương pháp HPLC detector UV- VIS Các điều kiện sắc... Cloroform và hỗn hợp dung môi Diethyl ether – Cloroform được kiềm hóa và không kiềm hóa bằng dd Amoniac 0,1M  Từ kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu đơn giản, tiến hành nhanh, kinh tế và vẫn đảm bảo chiết tách được LOR, PES và IS với tỷ lệ thu hồi đạt yêu cầu và ổn định 19 2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 2.4.3.1 Độ chọn lọc – đặc hiệu Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây. .. là các mẫu huyết tương chó sau khi cho uống viên Clarinase  Súc vật: Chó khỏe mạnh, giống đực, cân nặng 9-10kg, được chăm sóc và lấy máu tại bộ môn Dược lý – Đại học Dược Hà Nội 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR và PES bằng kỹ thuật LCMS/MS: Lựa chọn phương pháp chiết tách LOR và PES từ huyết tương chó, lựa chọn điều kiện sắc ký, lựa chọn chuẩn nội và điều kiện... cứu ở Việt Nam Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào định lượng đồng thời LOR và PES trong dịch sinh học, tuy nhiên đã có một số nghiên cứu định lượng hai hoạt chất trên trong chế phẩm:  Tác giả Lê Thị Thu Hiền, Bùi Thu Huê, Đoàn Cao Sơn đã nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin hydroclorid trong thuốc viên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy khoảng... với mẫu tương ứng được xử lý và phân tích sau khoảng thời gian nhất định (6h) ở nhiệt độ phòng  Độ ổn định của mẫu sau xử lý (độ ổn định trong auto sampler) Chuẩn bị các lô mẫu LQC và HQC trong huyết tương, mỗi lô mẫu gồm 06 mẫu độc lập, tiến hành chiết tách và bảo quản các mẫu sau khi chuẩn bị trong auto sampler trong khoảng thời gian nhất định Tiến hành phân tích và so sánh nồng độ LOR, PES trong. .. phổ  Thẩm định phương pháp phân tích : Thẩm định về các chỉ tiêu: độ đặc hiệu chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ đúng – độ chính xác,hiệu suất chiết, độ ổn định 2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu  Chuẩn bị các mẫu chuẩn 16  Chuẩn bị các mẫu chuẩn LOR, PES và IS trong MeOH theo bảng sau: Bảng 2.1: Cách chuẩn bị mẫu chuẩn LOR,PES và . lựa chọn phương pháp phân tích đồng thời LOR và PES trong huyết tương bằng LC – MS. 42 3.3.2. Về xây dựng phương pháp định lượng. 43 3.3.3. Về thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng. 45. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUẾ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUẾ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LORATADIN VÀ PSEUDOEPHEDRIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ