BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG VIÊN NÉN GPKD BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG VIÊN NÉN GPKD BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh Nơi thực hiện: 1. Phòng phân tích, kiểm nghiệm và tương đương sinh học – Viện công nghệ Dược phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi may mắn nhận được yêu thương, sự giúp đỡ tận tình của gia đình, thầy cô và bè bạn. Vì vậy, những trang đầu của khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người đã nhiệt tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi những kỹ năng cần thiết, cách tư duy và hỗ trợ giúp tôi giải quyết những khó khăn khi thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị ở Phòng phân tích, kiểm nghiệm và tương đương sinh học - Viện công nghệ Dược phẩm quốc gia đã giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận. Đồng thời, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo, các cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã giảng dạy, chỉ bảo, dìu dắt tôi trong suốt năm năm học tập tại trường. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, bạn bè, những người thân yêu đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thời gian tôi thực hiện đề tài này. Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do còn nhiều hạn chế về mặt lý luận và thực tiễn nên khóa luận có thể còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong được sự góp ý của thầy cô giáo và các bạn để khóa luận này được hoàn thiện hơn. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Huyề n MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cương về felodipin 3 1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa 3 1.1.2. Dược động học 4 1.1.3. Tác dụng dược lý 4 1.1.4. Chỉ định 5 1.1.5. Chống chỉ định 5 1.1.6. Thận trọng 5 1.1.7. Tác dụng không mong muốn (ADR) 6 1.1.8. Liều lượng và cách dùng 6 1.1.9. Quá liều và xử trí 7 1.1.10. Tương tác thuốc 7 1.1.11. Một số chế phẩm felodipin trên thị trường 8 1.2. Một số nghiên cứu định lượng felodipin 9 1.3. Tổng quan về HPLC 11 1.3.1. Khái niệm và các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký . 11 1.3.2. Cấu tạo máy HPLC 14 1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật của HPLC 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 16 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 18 2.3.2. Thẩm định phương pháp 18 2.3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích định tính, định lượng felodipin trong viên nén felodipin giải phóng có kiểm soát 20 2.3.4. Phương pháp xử lý kết quả 20 PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Xây dựng điều kiện phân tích Felodipin bằng HPLC 21 3.1.1. Lựa chọn cột sắc ký 21 3.1.2. Lựa chọn bước sóng thích hợp 22 3.1.3. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng và pha động 23 3.1.4. Lựa chọn thể tích tiêm mẫu 25 3.2. Chuẩn bị mẫu 26 3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn 26 3.2.2. Chuẩn bị dung dịch thử: 27 3.2.3. Chuẩn bị mẫu trắng: 27 3.3. Thẩm định phương pháp HPLC định lượng Felodipin 27 3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống 27 3.3.2. Tính đặc hiệu 28 3.3.3. Độ tuyến tính 29 3.3.4. Độ chính xác 31 3.3.5. Độ đúng: 32 3.4. Ứng dụng định tính và định lượng Felodipin trong chế phẩm 33 3.5. BÀN LUẬN 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATC (Anatomical Therapeutic Chemical): Hệ thống phân loại thuốc HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao HIV (Human Immuno-deficiency Virus): Virus gây suy giảm miễn dịch ở người MS (Mass spectrometry): Khối phổ UV- VIS (Ultraviolet - Visible): Tử ngoại - khả kiến PA (Pure for analysis): Độ tinh khiết phân tích PVP: Polyvinyl pyrrolidone ACN : Acetonitril MetOH: Methanol RSD (Relative standard deviation): Độ lệch chuẩn tương đối r: Hệ số tương quan SD (Standard deviation): Độ lệch chuẩn SKD: Sinh khả dụng t 1/2 : Thời gian bán thải USP (The United States Pharmacopeia): Dược điển Mỹ v/v: Thể tích/thể tích v/v/v: Thể tích/thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các chế phẩm felodipin trên thị trường 8 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn cột 21 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động 24 Bảng 3.3. Cách pha các dung dịch chuẩn 27 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính 30 Bảng 3.6. Kết quả xác định độ chính xác 31 Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ đúng 33 Bảng 3.8. Kết quả định lượng Felodipin trong viên giải phóng có kiểm soát 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo felodipin 3 Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống HPLC 14 Hình 3.1. Sắc ký đồ của Felodipin phân tích bằng cột Zorbax SB 21 Hình 3.2. Sắc ký đồ của Felodipin phân tích bằng cột Eclipase XDB 22 Hình 3.3. Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch Felodipin chuẩn 23 Hình 3.4. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 1 24 Hình 3.5. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 2 24 Hình 3.6. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 3 25 Hình 3.7. Sắc ký đồ của Felodipin (khảo sát điều kiện sắc ký) 26 Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu trắng 29 Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nồng độ 20µg/ml 29 Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ 30 và diện tích pic 30 Hình 3.11. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn 35 Hình 3.12. Sắc ký đồ của mẫu định lượng 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch là bệnh khá phổ biến, là gánh nặng sức khỏe chính yếu, để lại nhiều tàn phế và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Trong đó, tăng huyết áp (hay còn gọi là cao huyết áp) là bệnh rất tiêu biểu và thường gặp nhất. Nếu không được chẩn đoán và điều trị có thể gây ra các biến chứng và di chứng nặng nề như tai biến mạch não, suy thận… ảnh hưởng xấu đến chất lượng cuộc sống người bệnh, trở thành gánh nặng cho gia đình và cho xã hội. Do vậy, thuốc điều trị bệnh tim mạch cũng như tăng huyết áp ngày càng chiếm tỷ trọng lớn, có vai trò quan trọng trong công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp dược phẩm trong và ngoài nước trong nhiều năm gần đây, dạng bào chế viên tác dụng kéo dài đã ra đời để phù hợp với đặc thù điều trị các bệnh tim mạch là phải sử dụng thường xuyên, lâu dài mà giảm được số lần dùng thuốc, giảm tác dụng bất lợi nhiều nhất như: viên nén giải phóng chậm, viên nén bao film giải phóng chậm, viên nén giải phóng kéo dài, viên nén giải phóng có kiểm soát… Dược điển của Anh, Mỹ chỉ có một số ít chuyên luận về viên tác dụng kéo dài, trong khi đó Dược điển Việt Nam chưa có một chuyên luận riêng về dạng bào chế này. Nhiều dược chất được dùng trong các dạng bào chế này như: diltiazem, nicardipin, nifedipin, verapamil, …Trong đó, felodipin là một trong những thuốc đang được sử dụng khá phổ biến ở Việt Nam trong mấy năm gần đây. Chế phẩm viên nén felodipin 5 mg đang được nghiên cứu bào chế. Do đó, để đánh giá đúng và kịp thời chất lượng chế phẩm nghiên cứu là yêu cầu bắt buộc. Để góp phần phát triển một chế phẩm thuốc mới chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng felodipin trong viên nén giải phóng kéo dài bằng HPLC” với các mục tiêu sau: [...]...2  Xây dựng quy trình định tính và định lượng Felodipin trong viên nén bằng HPLC  Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng nhằm định tính và định lượng Felodipin trong viên nén Felodipin 5 mg giải phóng kéo dài bằng phương pháp HPLC 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về felodipin 1.1.1 Công thức và tính chất lý hóa Công thức cấu tạo: Hình 1.1 Công thức cấu tạo Felodipin Công thức... Felodipin chuẩn thêm vào − Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 98,0-102,0%, RSD ≤ 2% [6] 2.3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích định tính, định lượng felodipin trong viên nén felodipin giải phóng có kiểm soát − Phân tích định tính dựa trên thời gian lưu của pic felodipin trong mẫu thử trùng thời gian lưu của pic felodipin trong mẫu chuẩn đáp ứng − Định lượng felodipin của chế phẩm thử bằng phương pháp định lượng. .. 5mg, Viên nén giải AstraZeneca 10mg phóng kéo dài AB Viên nén giải AstraZeneca phóng kéo dài AB Felodipin 5mg Plendil Plus Metoprolol 50mg Thụy Điển Thụy Điển 9 1.2 Một số nghiên cứu định lượng felodipin • Fusun Gedil, Osman Ustun, Okan Atay nghiên cứu định lượng Felodipin trong chế phẩm (cụ thể thử trên viên Plendil® của hãng AstraZeneca - Thụy Điển) bằng phương pháp quang phổ UV-VIS và phương pháp HPLC. .. nó Có 4 phương pháp định lượng sử dụng trong sắc ký: − Phương pháp chuẩn ngoại − Phương pháp thêm chuẩn − Phương pháp chuẩn hóa diện tích − Phương pháp chuẩn nội Trong khuôn khổ của khóa luận, tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại - chuẩn hóa nhiều 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm 15 − Chuẩn hóa 1 điểm: chọn nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ chất phân tích trong của... thời gian phân tích 5 phút Felodipin và chuẩn nội được phát hiện bằng detector MS/MS theo kỹ thuật ghi phổ MRM (Multiple Reaction Monitoring), chế độ ion hóa bằng phun điện tử ion dương nghiên cứu cho thấy phương pháp đảm bảo độ đúng và chính xác để định lượng felodipin trong huyết tương người [14] Định lượng felodipin trong chế phẩm viên nén felodipin giải phóng kéo − dài bằng HPLC detector UV phát hiện... bằng phương pháp định lượng đã xây dựng ở trên theo phương pháp chuẩn hóa diện tích 1 điểm Yêu cầu: hàm lượng felodipin nằm trong khoảng 90,0%-110,0% [1] 2.3.4 Phương pháp xử lý kết quả Kết quả thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê trên Microsolf Office Excel 2007 21 PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng điều kiện phân tích Felodipin bằng HPLC 3.1.1 Lựa chọn cột sắc ký Qua... kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2% và gộp kết quả của 2 ngày RSD ≤3% [6] e Độ đúng 20 − Độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn felodipin vào mẫu placebo, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% lượng felodipin có trong mẫu thử (đảm bảo nồng độ ở trong khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng) Ở mỗi nồng độ, tiến hành sắc... (40 nmol/l) Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp đảm bảo độ chính xác, độ ổn định và đặc hiệu cao, có thể xác định felodipin trong mẫu huyết tương có nồng độ 1 nmol/l trở lên mà không cần làm sạch trong quá trình chiết đồng thời quá trình oxy hóa felodipin trong bộ phận tiêm và cột được giảm thiểu [9] • Phương pháp dùng nhiều nhất định lượng Felodipin là bằng HPLC Một số nghiên cứu: 10 − Năm 2012,... Thẩm định phương pháp phân tích Theo hướng dẫn chung thẩm định quy trình phân tích HPLC đối với chế phẩm định lượng [6], chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp phân tích felodipin trong chế phẩm đã được lựa chọn với các chỉ tiêu: − Độ phù hợp của hệ thống − Tính chọn lọc của phương pháp − Độ tuyến tính và khoảng nồng độ 18 − Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) − Độ đúng của phương pháp. .. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS được tiến hành đo quang ở hai bước sóng 234 nm và 360 nm, xây dựng khoảng nồng độ tuyến tính của felodipin tương ứng lần lượt là 4-24 µg/ml và 8-60 µg/ml Phương pháp được thẩm định về độ đúng cho lượng tìm lại lần lượt là 100,2 ± 0,71%, 99,6 ± 0,98% và RSD% tương ứng là 0,73% và 1,01% bằng cách thêm chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính [12] • Định lượng felodipin trong . dài bằng HPLC với các mục tiêu sau: 2  Xây dựng quy trình định tính và định lượng Felodipin trong viên nén bằng HPLC  Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng nhằm định tính và định lượng. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 18 2.3.2. Thẩm định phương pháp 18 2.3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích định tính, định lượng felodipin trong viên nén felodipin. Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG VIÊN NÉN GPKD BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013