BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG THỊ MINH HẰNG XÁC ĐỊNH SIBUTRAMIN TRONG THỰC PHẨM GIẢM BÉO BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG THỊ MINH HẰNG XÁC ĐỊNH SIBUTRAMIN TRONG THỰC PHẨM GIẢM BÉO BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Đình Chi 2. TS. Lê Thị Hồng Hảo Nơi thực hiện: Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Lê Đình Chi TS. Lê Thị Hồng Hảo ThS. Cao Công Khánh là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa học và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, 48B Tăng Bạt Hổ - Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Xin chân thành cảm ơn các thành viên trong Nhóm Tải Báo đã hướng dẫn và giúp tôi tìm tài liệu để hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2014 Sinh viên Dương Thị Minh Hằng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Vài nét chung về chất giảm béo 2 1.2. Tổng quan về sibutramin 2 1.2.1. Cấu trúc- tính chất lý hóa 2 1.2.2. Tính chất dược động học, tác dụng dược lý 3 1.2.3. Một số phương pháp phân tích sibutramin 5 1.3. Tổng quan về HPLC 8 1.3.1. Khái niệm chung 8 1.3.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 8 1.3.3. Thiết bị sắc ký lỏng 10 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU) 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.2. Nguyên vật liệu - thiết bị 15 2.2.1. Nguyên vật liệu 15 2.2.2.Thiết bị 15 2.3. Nội dung nghiên cứu 16 2.4. Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích sibutramin bằng HPLC 16 2.4.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 18 2.4.3. Thẩm định quy trình 19 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 19 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Thực nghiệm và kết quả 20 3.1.1. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích sibutramin 20 3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu để chiết sibutramin trong thực phẩm giảm béo 24 3.1.3. Thẩm định phương pháp 28 3.1.4. Kết quả áp dụng phương pháp xác định sibutramin trong một số sản phẩm 36 3.2. Bàn luận 37 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1. Kết luận 38 4.2. Kiến nghị 39 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt AOAC Association of Official Analytical Community Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử FDA Food and Drug Adminstration Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ GC-MS Gas Chromatography Mass Spectrometry Sắc ký khí khối phổ HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao KN ATVSTP Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm LC-MS/MS Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tóm tắt các quy trình phân tích sibutramin đã được công bố 5 Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích 14 Bảng 2.2 Danh mục các pha động khảo sát 17 Bảng 3.1 Gradient hệ pha động 1 21 Bảng 3.2 Gradient hệ pha động 2, 3 và 4 22 Bảng 3.3 Kết quả định lượng sibutramin trong nang cứng NC07 theo dung môi dùng để chiết mẫu 25 Bảng 3.4 Kết quả định lượng sibutramin trong nang mềm NM07 theo dung môi dùng để chiết mẫu 27 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống 30 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ tuyến tính 30 Bảng 3.7 Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn 31 Bảng 3.8 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang mềm 32 Bảng 3.9 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang cứng 33 Bảng 3.10 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng 34 Bảng 3.11 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm 34 Bảng 3.12 Kết quả phân tích sibutramin trong các thực phẩm chức năng giảm béo. 36 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo của sibutramin 3 Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 10 Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin với pha động 1 21 Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch xác định độ phân giải với pha động 1 21 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch xác định độ phân giảivới hệ pha động 2 22 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin với hệ pha động 3 23 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch xác định độ phân giải với hệ pha động 3 23 Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin với hệ pha động 4 23 Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch xác định độ phân giải với hệ pha động 4 24 Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 100 µg/mL . 25 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang cứng chiết bằng methanol. 25 Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 100 µg/mL 26 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu nang mềm chiết bằng dung môi methanol 26 Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải. 28 Hình 3.13 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 200 µg/mL 29 Hình 3.14 Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không chứa sibutramin. 29 Hình 3.15 Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không chứa sibutramin được thêm chuẩn sibutramin. 29 Hình 3.16 Đường chuẩn của sibutramin 31 Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 0,5 µg/mL 35 Hình 3.18 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 0,2 µg/mL 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Béo phì là một vấn đề sức khỏe trên toàn thế giới, nó có thể tác động không tốt đến chất lượng cuộc sống. Báo cáo gần đây nhất của WHO đã chỉ ra rằng khoảng 1,5 tỉ người trưởng thành có độ tuổi trên 20 được xếp vào lớp thừa cân; trong số đó hơn 200 triệu nam giới và gần 300 triệu phụ nữ đã béo phì. Theo ước tính đến năm 2015 sẽ có khoảng 2,3 tỉ người thừa cân và trên 700 triệu người béo phì. Một số liệu khác cho thấy gần 43 triệu trẻ em dưới 5 tuổi đã bị thừa cân vào năm 2010 [25]. Chính vì thế nhu cầu giảm béo cũng theo đó mà tăng lên. Phương pháp điều trị giảm béo chính là ăn kiêng kết hợp hoạt động thể lực, và thuốc điều trị béo phì cũng được sử dụng để tăng cường tác dụng. Thực phẩm chức năng giảm béo tự nhiên ra đời như một lựa chọn thay thế cho thuốc giảm béo tổng hợp và trở thành biện pháp tốt hơn bởi lẽ theo một cách tổng quát thì chúng an toàn hơn. Song tác dụng của những sản phẩm đó lại thấp hơn những tác nhân giảm béo tổng hợp, do vậy để tăng hiệu quả, chúng thường được cho thêm những chất hóa học giảm béo hiệu quả khác một cách bất hợp pháp, trong đó có sibutramin là chất đã bị cấm sử dụng [4], [12], [16]. Do đó việc phát hiện được sibutramin có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng giúp giảm béo là một yêu cầu thực tiễn trong kiểm soát tính an toàn của loại sản phẩm này. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn kể trên, đề tài “Xác định sibutramin trong thực phẩm giảm béo bằng HPLC” được tiến hành nhằm: - Xây dựng phương pháp phát hiện sibutramin có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng giúp giảm béo. - Ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào kiểm tra sibutramin trong một số mẫu thực phẩm giảm béo thiên nhiên. [...]... -Detector: Sử dụng kỹ thuật ESI (ion LC- bằng HPLC- [10] ESI/MS/MS Trong các kỹ thuật phân tích đã được ứng dụng để phân tích sibutramin, HPLC là kỹ thuật phổ biến nhất, dễ áp dụng do điều kiện thiết bị sẵn có Vì 8 vậy, trong nghiên cứu này, HPLC được lựa chọn làm kỹ thuật để xây dựng quy trình phân tích sibutramin trong thực phẩm chức năng giảm béo 1.3 Tổng quan về HPLC 1.3.1 Khái niệm chung Sắc ký lỏng... mẫu để chiết sibutramin trong thực phẩm giảm béo Năm dung môi khác nhau, gồm nước, methanol (MeOH), ethanol (EtOH), aceton và acetonitril (ACN) đã được khảo sát để lựa chọn ra dung môi phù hợp nhất cho việc chiết sibutramin từ nền mẫu là thực phẩm giảm béo dạng nang cứng và nang mềm Với mỗi dạng bào chế, một mẫu sản phẩm qua khảo sát sơ bộ đã biết có chứa sibutramin trái phép được xử lý bằng cách chiết... có tác dụng làm giảm cân có mặt trái phép vào thực phẩm chức năng Trong số các chất này có phenolphthalein (do tác dụng nhuận tràng) và furosemid (do tác dụng lợi tiểu) là hai đối tượng cũng từng bị phát hiện có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng, đồng thời lại rất khó tách khỏi sibutramin bằng HPLC nếu có mặt trong cùng nền mẫu (từ các kết quả nghiên cứu sơ bộ) Chính vì vậy, trong khi xây dựng... máy HPLC để phân tích sibutramin - Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết sibutramin trong thực phẩm chức năng - Đánh giá quy trình phân tích và xử lý mẫu - Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu với một số sản phẩm trên thị trường 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Khảo sát các điều kiện phân tích sibutramin bằng HPLC Nghiên cứu phân tích sibutramin chúng tôi tiến hành là một nhánh trong. .. vòng/phút - Gạn lấy phần dịch, định mức 25 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm - Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần) 2.4.3 Thẩm định quy trình Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích sibutramin bằng HPLC được thẩm định về các tiêu chí: - Độ đặc hiệu - Độ thích hợp của hệ thống - Khoảng tuyến tính - Độ chính xác - Độ đúng - Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 2.5 Phương... kháng acetylcholin thế đứng [21] - Sibutramin là một chất ức chế tái thu hồi serotonin - noradrenalin, thúc đẩy giảm cân ở người béo phì Nó làm giảm cảm giác thèm ăn, cho cảm giác no và gây ra sự sinh nhiệt [21] - Trong cơ thể, sibutramin chuyển hóa nhanh chóng thành các chất chuyển hóa desmethyl: M1 (mono-desmethyl sibutramin) và M2 (di-desmethyl sibutramin) và sibutramin tác động dược lý chủ yếu... thiên, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp 20 Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thực nghiệm và kết quả 3.1.1 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích sibutramin Để xây dựng quy trình phân tích sibutramin bằng HPLC, chúng tôi sử dụng các điều kiện sắc ký thông dụng dưới đây cố định trong toàn bộ nghiên cứu: - Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm;... tháng 2 năm 1998, sau đó nó đã được sử dụng cho điều trị béo phì trong khoảng 40 quốc gia trên thế giới Sibutramin đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị béo phì Các dữ liệu lâm sàng trong một và hai năm đã chứng minh rằng sibutramin, cùng với một chế độ ăn uống ít calo, đã gây ra tác dụng giảm cân ban đầu và bền vững [21] Tuy nhiên sibutramin lại có những tác dụng phụ trầm trọng liên quan... phân tích bằng các điều kiện HPLC thiết lập ở mục 3.1.1 Các bước của quá trình chiết tuân theo trình tự ở mục 2.4.2 25 a.Khảo sát dung môi chiết với viên nang cứng Sử dụng từng dung môi để chiết sibutramin từ mẫu nang cứng NC07 đã xác định sơ bộ có chứa sibutramin Dung dịch thử được phân tích sắc ký và so sánh với dung dịch chuẩn sibutramin 100 µg/mL pha trong methanol Kết quả hàm lượng sibutramin. .. độ : bắt đầu ở hòa trong nước, kiềm hóa bằng Natri 110oC, tăng 10 oC/phút đến 280 oC và carbonat đến duy trì trong 3 phút pH 10 Chiết -Khí mang: Heli với tốc độ 0,6 bằng methyl ml/phút chlorid, sau -Phổ được thu thập trong khoảng m/z khi tách các từ 40 - 400 lớp, làm khô bằng natri sulphat khan rồi phân tích bằng GCMS -Cột Waters Xterra MS C18 (50×2,1 Mẫu được mm, 3,5 µm) chiết bằng -Pha động: acetonitril . đề tài Xác định sibutramin trong thực phẩm giảm béo bằng HPLC được tiến hành nhằm: - Xây dựng phương pháp phát hiện sibutramin có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng giúp giảm béo. -. XÁC ĐỊNH SIBUTRAMIN TRONG THỰC PHẨM GIẢM BÉO BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG THỊ MINH HẰNG XÁC ĐỊNH SIBUTRAMIN. tích sibutramin 20 3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu để chiết sibutramin trong thực phẩm giảm béo 24 3.1.3. Thẩm định phương pháp 28 3.1.4. Kết quả áp dụng phương pháp xác định sibutramin trong