BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN QUỐC LONG XÁC ĐỊNH BUFALIN TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM HỖ TRỢ SỨC KHỎE LIÊN QUAN ĐẾN CÓC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN QUỐC LONG XÁC ĐỊNH BUFALIN TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM HỖ TRỢ SỨC KHỎE LIÊN QUAN ĐẾN CÓC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Đình Chi 2. TS. Lê Thị Hồng Hảo Nơi thực hiện: Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho em gửi lời chân thành cảm ơn tới thầy TS. Lê Đình Chi đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết khóa luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đặc biệt là TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tạo mọi điều kiện cho em được thực hiện đề tài tại đây. Em xin chân thành cảm ơn Ths. Trần Cao Sơn, CN. Đỗ Thị Thu Hằng cùng toàn thể các anh chị trong labo Hóa đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng em. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Trần Quốc Long MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Các bufotoxin và bufalin. 2 1.1.1. Giới thiệu chung về họ cóc và các bufotoxin. 2 1.1.2. Bufalin. 3 1.1.3. Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc 4 1.1.4. Các chế phẩm và bài thuốc dân gian có nguồn gốc từ cóc 4 1.2 Một số phương pháp xác định bufalin 5 1.2.2. Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) 5 1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector PDA (HPLC-PDA). 6 1.2.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 7 1.2.4. Phương pháp LC-MS/MS 7 1.3. Kỹ thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ (LC-MS). 9 1.3.1. Sắc ký lỏng. 9 1.3.2. Khối phổ (Mass Spectrometry). 11 2.1. Đối tượng nghiên cứu. 15 2.2. Nguyên vật liệu- trang thiết bị. 15 2.2.1. Nguyên vật liệu 15 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 16 2.3. Nội dung, phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Nội dung nghiên cứu 17 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 17 3.1. Thiết lập điều kiện phân tích bufalin bằng LC-MS/MS 22 3.1.1. Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS) 22 3.1.2. Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 24 3.1.2.1. Pha tĩnh. 24 3.1.2.2. Pha động 25 3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 30 3.2.1. Chọn quy trình xử lý mẫu. 30 3.2.3. Khảo sát thể tích chiết 32 3.2.4. Khảo sát cột chiết 33 3.2.5. Khảo sát dung dịch rửa giải. 33 3.2.6. Khảo sát thể tích dung dịch rửa giải. 34 3.3. Thẩm định phương pháp. 36 3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc. 36 3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ). 38 3.3.3. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn. 38 3.3.4. Độ lặp lại 39 3.3.5. Độ đúng 40 3.3.6. Bàn luận 41 3.4. Phân tích mẫu thực tế 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận 43 Kiến nghị 44 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt AOAC Association of Official Analytical Community Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức APCI Atmospheric pressure chemical ionization Chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử GC-MS Gas chromatography mass spectrometry Sắc ký khí khối phổ HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSCCC High speed countercurrent chromatography Sắc kí phân bố ngược dòng tốc độ cao. LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MS Mass spectrometry Khối phổ PDA Photodiode Array Dãy diod quang TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng SPE Dispersive solid phase extraction Chiết pha rắn R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các nghiên cứu dùng phương pháp HPLC-PDA để phân tích bufalin. 6 Bảng 1.2: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đề phân tích bufalin 8 Bảng 2.1: Sản phẩm có thành phần làm từ cóc được nghiên cứu trong đề tài 15 Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 22 Bảng 3.2: Các thông số tối ưu MS/MS 24 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích pic bufalin 26 Bảng 3.4: Khảo sát các chương trình chạy gradient 27 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát chương trình chạy gradient 28 Bảng 3.6: Khảo sát tốc độ dòng pha động 29 Bảng 3.7: Chương trình gradient tối ưu 29 Bảng 3.8: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 31 Bảng 3.9: Khảo sát dung môi chiết 32 Bảng 3.10: Khảo sát thể tích dung môi chiết 32 Bảng 3.11: Khảo sát cột chiết pha rắn 33 Bảng 3.12: Khảo sát dung dịch rửa giải 34 Bảng 3.13: Kết quả khảo sát thể tích dung dịch rửa giải 35 Bảng 3.14: Ion mẹ và 2 ion con của bufalin 37 Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của bufalin 39 Bảng 3.16: Kết quả đánh giá độ lặp lại 40 Bảng 3.17: Kết quả đánh giá độ đúng 41 Bảng 3.18: Kết quả phân tích bufalin trong mẫu sản phẩm dinh dưỡng có thành phần từ cóc 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Sắc ký lớp mỏng phát hiện bufalin 7 Hình 1.2: Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS 9 Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS 11 Hình 1.4: Bộ nguồn ion hóa 12 Hình 1.5: Mô hình bộ phân tích tứ cực chặp ba 14 Hình 2.1:Các bước của quá trình chiết pha rắn 18 Hình 3.1: Sắc ký đồ của dung dịch bufalin chuẩn với pha động ACN - HCOOH 0,1% 26 Hình 3.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 31 Hình 3.3: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 36 Hình 3.4: Sắc đồ mẫu trắng 37 Hình 3.5: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn 50 ng/ml 37 Hình 3.6: Sắc đồ mẫu bột đạm cóc phát hiện có bufalin 38 Hình 3.7: Sắc đồ bufalin tại LOD 38 Hình 3.8: Đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chuẩn bufalin 39 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cóc nhà (Bufo melanostictus) thuộc họ Cóc-Bufonidae, được dùng trong đông y và dân gian như một loại thực phẩm bổ dưỡng cho người già, một loại thuốc quý để hỗ trợ, tăng cường dinh dưỡng sau ốm dậy, dùng để chữa bệnh trẻ em suy dinh dưỡng, chán ăn, chậm lớn, gầy còm, còi xương, cam tích, lở ngứa trẻ em [2]. Trong thịt cóc, có rất nhiều acid amin có giá trị (asparagin, histidin, tyrosin, methionin, leucin, isoleucin, phenylamin, tryptophan, cystein), hàm lượng một số nguyên tố vi lượng có ích như kẽm, mangan cao hơn rất nhiều so với các loài động vật khác [2]. Như vậy giá trị dinh dưỡng của thịt cóc rất cao. Bên cạnh giá trị dinh dưỡng đã được chứng minh của thịt cóc, đã có nhiều trường hợp tử vong do ăn thịt cóc có nhiễm độc tố cóc, tính tới ngày 8/9/2010, toàn quốc ghi nhận 06 vụ ngộ độc do độc tố trong cóc (bufotoxin) xảy ra trên địa bàn 6 tỉnh/thành phố làm 17 người mắc, 13 người đi viện và 05 người chết [1]. Các nghiên cứu đã công bố xác định trong nhựa cóc Việt Nam – Bufo melanostictus có bufalin, resibufogenin, bufotalin và nhiều bufadienolides khác, trong đó bufalin là thành phần chính. Đây là điểm khác biệt so với cóc Trung Quốc - Bufo gargarizans (trong nhựa có chứa cinobufagin là thành phần chính) [21]. Hiện nay ở Việt Nam chưa có một phương pháp chính thức để phân tích phát hiện độc tố cóc trong các sản phẩm dinh dưỡng có thành phần từ cóc. Vì vậy, để góp phần kiểm soát các nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc độc tố cóc, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xác định bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc” với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp xác định bufalin trong các sản phẩm dinh dưỡng chế biến từ cóc bằng kỹ thuật LC – MS/MS. - Ứng dụng phương pháp xây dựng được để phân tích bufalin trong một số loại sản phẩm dinh dưỡng chế biến từ cóc. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Các bufotoxin và bufalin. 1.1.1. Giới thiệu chung về họ cóc và các bufotoxin. Họ Cóc (Bufonidae) có 529 loài [11], trong đó 16 loài có các chất độc nhóm bufotoxin (trong nội tạng (gan, trứng) và nhựa ở da, tuyến mang tai), bao gồm loài cóc nhà Việt Nam B. melanostictus. Trong thịt cóc không có chất độc. “Nhựa cóc” còn gọi là thiềm tô (secretio bufonis) là nhựa tiết ở tuyến sau mang tai, tuyến trên mắt và các tuyến trên da của cóc. Chất độc trong nhựa cóc, trong gan và buồng trứng cóc có độc tính rất cao [7]. Hợp chất bufotoxin là nhóm các chất độc thường thấy ở tuyến nhựa sau tai, da và nội tạng của nhiều loài cóc, một số loài lưỡng cư khác và ở một số loài cây và nấm [12]. Đây là một hỗn hợp gồm hơn 36 hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau: 5- MeO-DMT, bufalin, resibufogenin, cinobufagin, bufagin, bufotalin, bufogenin, bufothionin, epinephrin, norepinephrin và serotonin… trong đó có những chất được xếp vào nhóm không gây độc bao gồm cholesterol, provitamin D, ergosterol và gamma sitosteral. Những chất gây độc được xếp thành 3 nhóm: - Nhóm 1: Các glycosis có tác dụng lên tim (hay bufadienolides) chủ yếu gồm bufalin, cinobufagin và resibufogenin có tác động trên hệ tim mạch của động vật và con người. - Nhóm 2: Phenethylamines và dẫn xuất. Bao gồm các catecholamines như: dopamine, norepinephrine và epinephrine. - Nhóm 3: Tryptamines và dẫn xuất: serotonin, bufotenin, 5-methoxy-N,N- dimethyltryptamin (5-MeO-DMT) chúng có tác dụng tăng huyết áp và gây ảo giác và/hoặc hưng thần (psychoactive). [...]... cứu Bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc hiện có trên thị trường: Bảng 2.1: Sản phẩm có thành phần làm từ cóc được nghiên cứu trong đề tài Tên mẫu Số kiểm soát Thành phần Bột cóc royal baby-Công ty CP Dược và Hạn dùng 15/07/2013 15/7/2016 02/08/2013 02/08/2014 Bột cóc, lyzin, vitamin B1, 4777/2012/ATTP- kẽm gluconat, XNCB CN Hóa sinh canxi lactat, bột đậu Hà Nội Bột đạm cóc- ... MS/MS) để xác định bufalin trong sản phẩm dinh dưỡng có thành phần làm từ cóc Cơ sở lý thuyết đã được nêu trong phần tổng quan c Phương pháp thẩm định [5] 20  Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện LOD: là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được Giới hạn định lượng LOQ: là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử... kiện xác định bufalin bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)  Khảo sát quy trình chiết bufalin từ nền mẫu  Thầm định phương pháp:  Độ đặc hiệu của phương pháp  Khoảng tuyến tính và đường chuẩn  Độ lặp lại của phương pháp  Độ thu hồi của phương pháp  Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng  Ứng dụng phương pháp: Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định bufalin trong một số sản phẩm. .. dưỡng, Hiện nay có khá nhiều sản phẩm hỗ trợ sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc làm từ cóc như: bột đạm cóc (Viện Dinh Dưỡng), bột cóc baby (Công ty CP Dược Hải Phòng), bột cóc royal baby (Công ty CP Công nghệ và Hóa sinh Hà Nội),… - Tại Trung Quốc thuốc Chansu (được biết đến với tên Senso tại Nhật Bản, tên Somsa tại Hàn Quốc) chế từ chất tiết trên da và tuyến mang tai cóc hiện được sử dụng khá rộng... định bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe có chứa thành phần làm từ cóc hiện đang lưu hành 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu a Phương pháp tách chiết mẫu Đối tượng mẫu phân tích trong luận văn này là sản phẩm dinh dưỡng có nền mẫu phức tạp Do đó cần có phương pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện Trong đề tài này, chúng tôi đã sử... 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF) Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được... telocinobufagin > gamabufotalin > cinobufotalin > cinobufagin > g-strophanthin > digitoxingenin > resibufogenin [29] 1.1.3 Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc Trong thời gian qua trong thực tế có rất nhiều vụ ngộ độc do độc tố cóc gây ra Triệu chứng ngộ độc độc tố cóc biểu hiện cấp tính, xuất hiện từ 1 - 2 giờ sau khi ăn (có thể sớm hơn nếu uống rượu, bia) với các biểu hiện sau: + Rối loạn tiêu... nhân xuất hiện bỏng rát, phù nề niêm mạc, mắt nếu bị nhựa cóc bắn dính vào trực tiếp niêm mạc 1.1.4 Các chế phẩm và bài thuốc dân gian có nguồn gốc từ cóc - Dân gian [2]: Nhựa cóc là 1 trong 6 vị của đơn thuốc “Lục thần hoàn” Trong nhân dân dùng nhựa cóc chữa giảm đau, tán thuỷ, dùng chữa phát bối, đinh độc, yết 5 hầu sưng đau, đau răng Thịt cóc khô dùng với liều 2 – 3 g tán bột uống hoặc làm thành... hạn điều trị hẹp nên khá thận trọng khi sử dụng [11] 1.2 Một số phương pháp xác định bufalin 1.2.2 Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp sắc ký trong đó cả pha tĩnh và pha động ở trạng thái lỏng Do không sử dụng giá mang rắn nên sắc ký phân bố ngược dòng loại trừ được những khó khăn thường gặp trong các phương pháp sắc ký trên pha tĩnh rắn như mất mẫu... phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một diod tạo ra dòng các electron Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phospho và giải phóng ra các photon Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không . đề tài: Xác định bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp xác định bufalin trong các sản phẩm dinh dưỡng chế biến từ cóc bằng. ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN QUỐC LONG XÁC ĐỊNH BUFALIN TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM HỖ TRỢ SỨC KHỎE LIÊN QUAN ĐẾN CÓC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: . TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN QUỐC LONG XÁC ĐỊNH BUFALIN TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM HỖ TRỢ SỨC KHỎE LIÊN QUAN ĐẾN CÓC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ