BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN ANH XÁC ĐỊNH ADENOSINE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CÓ CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN ANH XÁC ĐỊNH ADENOSINE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CÓ CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Bùi Đình S ơn Nơi thực hiện: Viện KNVSATTP Quố c gia HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Đình Sơn đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện kiểm nghiệm Vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, cùng các giảng viên, nhân viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất và các bộ môn khác trong Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 09 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Vân Anh MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………… 1 Chương 1. TỔNG QUAN ……………………………………………………. 2 1.1. Giới thiệu chung về Đông trùng hạ thảo 2 1.1.1. Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo 2 1.1.2. Phân loại Đông trùng hạ thảo 2 1.1.3. Thành phần của Đông trùng hạ thảo…………………………… 3 1.1.4. Tác dụng của Đông trùng hạ thảo……………………………… 4 1. 2. Giới thiệu về adenosine………………….………………………………. 6 1.2.1. Cấu tạo của adenosine…………………………………………… 6 1.2.2. Chuyển hóa và tác dụng của adenosine…………………… 7 1.3. Phương pháp xác định adenosine………………………………………… 8 1.3.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC…………………………… 8 1.3.2. Phương pháp điện di mao quản (CE)…………… 9 1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng……………………………………… 9 1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)………… 11 1.4.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng……………………………… 11 1.4.2. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC………………… 13 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng 15 2.2. Hóa chất và dụng cụ 15 2.2.1. Thiết bị 15 2.2.2. Dụng cụ 15 2.2.3. Hóa chất 14 2.3. Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu………………………………………… 16 2.3.2. Phương pháp phân tích……………………………………… 16 2.4. Thẩm định phương pháp phân tích………………………………… 17 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1. Lựa chọn phương pháp phân tích 19 3.2. Tối ưu điều kiện xác định adenosine trên hệ thống HPLC………… 19 3.2.1. Lựa chọn cột tách sắc ký………………………………………… … 3.2.2. Khảo sát thành phần pha động………………………………… 3.2.3. Khảo sát chương trình rửa giải gradient 3.2.4. Điều kiện tối ưu của quá trình sắc ký 19 21 23 26 3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 27 3.3.1. Khảo sát dung môi chiết ………………………………………… … 3.3.2. Khảo sát dung môi loại béo…………………………………… 3.3.3. Khảo sát nhiệt độ chiết………………………………………… 3.3.4. Khảo sát thời gian chiết … …………………………………… … 3.3.5. Khảo sát số lần chiết…………………………………………… 27 28 29 30 30 3.4. Đánh giá phương pháp phân tích…………………………………… 32 3.4.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn……………… 3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp …………………………………………………………… … 3.4.3. Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 3.4.4. Đánh giá độ lặp lại của hệ thống 3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 32 33 35 36 37 3.5. Đánh giá chất lượng của TPCN có chứa ĐTHT 40 3.6. Bàn luậ n 41 3.6.1. Đối tượng nghiên cứu 41 3.6.2. Xây dự ng quy trình phân tích 41 3.6.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 41 3.6.4. Thẩm đị nh phương pháp 42 3.6.5. Kết quả phân tích mẫu thự c 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà Hóa phân tích AMP Adenosine monophosphat CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản CMC Carboxyl methyl cellulose ĐTHT Đông trùng hạ thảo EtOH Ethanol HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MeOH Methanol MS Mass spectrometry Khối phổ PDA Photo diode array Dãy diod quang RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn TB Trung bình TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TPCN Thực phẩm chức năng USFDA The united states food and drug administration Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ USP The united states pharmacopeia Dược điển Mỹ UV Ultra violet Tử ngoại Vis Visible Khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Khảo sát thành phần pha động…………… ………………… Trang 22 Bảng 3.2. Khảo sát số lần chiết mẫu…………………………… 30 Bảng 3.3 . Khảo sát khoảng tuyến tính……………………………………. 32 Bảng 3.4. LOD và LOQ của adenosine 34 Bảng 3.5. Khảo sát độ lặp lại của hệ thống 36 Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dạng viên nang mềm 38 Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dạng viên nang cứng 38 Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dạng lỏng 39 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Hình ảnh của Cordyceps sinensis……………………………… ……. 3 Hình 1.2. Hình ảnh của Cordyceps militaris……………………………… …… 3 Hình 1.3. Cấu tạo của một số nucleoside trong Đông trùng hạ thảo………… 4 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của adenosine………………………………… … 7 Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC……………………………………… 13 Hình 1.6. Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký…………………………………… 13 Hình 2.1. Quy trình phân tích mẫu dự kiến……………………………… ……. 17 Hình 3.1. Phổ hấp thụ của adenosine…………………………………… 19 Hình 3.2. Sắc đồ phân tích trên cột X-Brigde C 18………………………………………… …… 20 Hình 3.3. Sắc đồ phân tích trên cột Symmetry C 18……………………………………… ……. 20 Hình 3.4. Sắc đồ phân tích trên cột IntertSustain C 18………………………………… ……… 21 Hình 3.5. Sắc đồ phân tích sử dụng pha động H 2 O và ACN……………… … 22 Hình 3.6. Sắc đồ phân tích sử dụng pha động H 2 O và MeOH………… 22 Hình 3.7. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 1………………… ……. 23 Hình 3.8. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 2………………… ……. 24 Hình 3.9. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 3………………… ……. 24 Hình 3.10. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 4………………… … 25 Hình 3.11. Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 5………………… … 26 Hình 3.12. Sắc đồ phân tích với điều kiện tối ưu……………………… 27 Hình 3.13. Khảo sát dung môi chiết …….………………………… …… …… 27 Hình 3.14: Khảo sát nhiệt độ chiết……………………………………… …… 29 Hình 3.15: Khảo sát thời gian chiết ……………………………………… …… 30 Hình 3.16. Quy trình phân tích mẫu thực ……………………………… ……. 31 Hình 3.17. Khảo sát khoảng tuyến tính …………………………………… …. 32 Hình 3.18. Đường chuẩn của adenosine…………………………………… …. 33 Hình 3.19. Sắc đồ nền mẫu TPCN dạng viên nang tại LOD 34 Hình 3.20. Sắc đồ nền mẫu TPCN dạng lỏng tại LOD 34 Hình 3.21. Độ đặc hiệu của chuẩn adenosine 35 Hình 3.22. Độ đặc hiệu của phương pháp trên nền mẫu dạng nang cứng 35 Hình 3.23: Độ đặc hiệu của phương pháp trên nền mẫ dạng nang mềm 36 Hình 3.24: Độ đặc hiệu của phương pháp trên nền mẫu dạng lỏng 36 Hình 3.25: Đánh giá chất lượng mẫu TPCN có chứa ĐTHT 40 [...]... hành nghiên cứu đề tài: "Xác định adenosine trong thực phẩm chức năng có chứa Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC" với các mục tiêu sau: + Xây dựng phương pháp xác định adenosine trong TPCN có chứa ĐTHT bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC + Ứng dụng phương pháp để phân tích sản phẩm TPCN có chứa ĐTHT trên thị trường Từ đó, đánh giá chất lượng sản phẩm TPCN có chứa ĐTHT -2- Chương 1... Việt nam chưa có phương pháp chuẩn để xác định hàm lượng hoạt chất chính trong Đông trùng hạ thảo nên việc phát triển phương pháp phân tích các hoạt chất chính nói chung và adenosine nói riêng trong nguyên liệu hay các sản phẩm có chứa Đông trùng hạ thảo là vô cùng cần thiết Nó là công cụ giúp cho các nhà quản lý kiểm soát tốt chất lượng và giúp cho người tiêu dùng được sử dụng các sản phẩm đảm bảo... Tác dụng trên tóc Adenosine được chứng mính có khả năng kích thích sự phát triển của tóc ở những người có tóc thưa 1.3 Phương pháp xác định adenosine 1.3.1 Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC [8], [15] Ma Yan và cộng sự [15] đã tiến hành xác định các nucleoside trong Cordyceps sinensis bằng phương pháp TLC Dịch chiết được phân tích trên bản mỏng silica GF254 có chứa 1% CMC-Na, dung môi gồm cloroform-ethylacetate-isopropanolnước-amoniac... đại đều xác định Đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người và động vật Liều uống ĐTHT an toàn đối với chuột thí nghiệm là trên 45g/1kg thể trọng Với những tác dụng như trên, Đông trùng hạ thảo được coi là một thần dược được sử dụng rộng rãi trong y học Trong đó, adenosine là thành phần hoạt chất chính để đánh giá chất lượng của Đông trùng hạ thảo 1 2 Giới thiệu về adenosine. .. của Đông trùng hạ thảo [7], [14], [18], [19], [21], [23] Trong Đông trùng hạ thảo chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý: các hợp chất nucleoside, các polysaccharide, protein và các hợp chất nitragenous, sterol, vitamin, khoáng chất * Các nucleoside Đây là thành phần chính có giá trị đặc biệt trong Đông trùng hạ thảo, gồm một số hợp chất như: deoxyuridine, 2’-3’-dideoxyadenosine, hydroxyethyladenosine,... bước sóng 260nm Phương pháp có độ thu hồi trong khoảng từ 93,8 - 102,9%, với độ lệch chuẩn tương đối nhỏ hơn 3,62% Giới hạn định lượng của adenosine và cordycepin là 0,21 và 0,083mg/lít Phương pháp đơn giản, nhanh, độ chính xác cao và giá thành thấp Hemanth Kumar, M.Spandana [17] phân tích đồng thời adenosine, cordycepin và sản phẩm chuyển hóa của cordyceps sinensis bằng phương pháp HPLC Điều kiện phân... ergosterol peroxide, có tác dụng chống rối loạn tình dục Các vitamin cần thiết cho cơ thể: trong 100g Đông trùng hạ thảo có 0,12mg vitamin B12; 29,19mg vitamin A; 116,03mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2, vitamin E, vitamin K… Ngoài ra còn có hợp chất hydrocarbon, alcohol và aldehyde,… 1.1.4 Tác dụng của Đông trùng hạ thảo [7], [14], [16], [23] Đông trùng hạ thảo được sử dụng khá phổ biến trong khoảng... thiệu chung về Đông trùng hạ thảo 1.1.1 Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo [10], [14], [21], [22], [23] Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) là một loại nấm thuộc ngành Ascomycotina, lớp Asiomycetes, được coi là một thần dược có giá trị cao trong y học Trung Quốc trong nhiều thế kỷ Đó là một dạng cộng sinh giữa một loài nấm túi có tên khoa học là Cordyceps sinensis với ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi... phần hóa học của Đông trùng hạ thảo, adenosine là một trong những hoạt chất chính có tác dụng Adenosine có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá năng lượng của cơ thể Nó giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lực cơ bắp, giảm sinh trưởng của tế bào xấu, tăng lượng oxy trong máu… Vì vậy, việc bổ sung adenosine hàm lượng cao giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt... được bơm vào hệ thống HPLC với cột sắc ký C18 và dung môi gồm 2 kênh: kênh A là acid phosphoric 0,4% và kênh B là MeOH Detector UV bước sóng 257nm Độ thu hồi của phương pháp trong khoảng 91,6 - 98,3% với độ lệch chuẩn nhỏ hơn 5,3% Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương ứng là 0,017 và 0,048μg/mL Li chen và cộng sự [11] xác định adenosine và cordycepin trong Đông trùng hạ thảo Mẫu được chiết . " ;Xác định adenosine trong thực phẩm chức năng có chứa Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC& quot; với các mục tiêu sau: + Xây dựng phương pháp xác định adenosine trong TPCN có chứa. ANH XÁC ĐỊNH ADENOSINE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CÓ CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Bùi Đình S ơn Nơi thực hiện:. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN ANH XÁC ĐỊNH ADENOSINE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CÓ CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ