BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM ĐỨC VỊNH TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY SỎI TIẾT NIỆU TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM ĐỨC VỊNH TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY SỎI TIẾT NIỆU TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thùy Dương Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: - TS. Nguyễn Thùy Dương, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận tốt ngiệp. - TS. Nguyễn Hoàng Anh, người thầy đã định hướng, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Lòng nhiệt huyết và say mê nghiên cứu của thầy cô là nguồn động viên, khích lệ lớn lao đối với tôi trong công việc. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới: - Các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn Dược lực đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại Bộ môn. - Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, rèn luyện và tiếp thu những kiến thức bổ ích trong suốt 5 năm học vừa qua. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè tôi, những người thân yêu đã luôn quan tâm, chăm sóc, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn trong học tập và cuộc sống. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Phạm Đức Vịnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ iii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Sinh lí bệnh sỏi tiết niệu 2 1.1.1. Định nghĩa 2 1.1.2. Đặc điểm dịch tễ bệnh sỏi tiết niệu 2 1.1.3. Phân loại sỏi tiết niệu 3 1.1.4. Nguyên nhân và cơ chế hình thành sỏi tiết niệu 4 1.1.5. Diễn tiến của bệnh sỏi tiết niệu 7 1.1.6. Điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu 7 1.2. Các phương pháp và mô hình nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu 9 1.2.1. Các phương pháp in vitro trong nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu 9 1.2.2. Các mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo và đánh giá tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của thuốc 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Nguyên liệu và thiết bị 17 2.1.1. Hóa chất 17 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ 17 2.1.3. Động vật thí nghiệm 18 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.3. Phương pháp gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng 19 2.3.1. Khảo sát nồng độ ethylen glycol, amoni clorid để gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng 19 2.3.2. Triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng bằng ethylen glycol, amoni clorid với nồng độ và thời gian đã chọn 22 2.4. Xử lí số liệu 24 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 25 3.1. Kết quả thực nghiệm khảo sát nồng độ của hóa chất và thời gian gây sỏi 25 3.1.1. Thể trạng của chuột thí nghệm khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác nhau 25 3.1.2. Khối lượng cơ thể chuột thí nghiệm khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác nhau 25 3.1.3. Tinh thể calci oxalat trong nước tiểu khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác nhau 27 3.1.4. Sự kết tập tinh thể trong thận khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác nhau. 29 3.2. Kết quả triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu bằng EG 1% và AC 0,5% 32 3.2.1. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến khối lượng cơ thể chuột thí nghiệm 33 3.2.2. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến thể tích nước tiểu của các nhóm 34 3.2.3. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến pH nước tiểu của các nhóm 34 3.2.4. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến sự hình thành tinh thể calci oxalat trong nước tiểu 35 3.1.4. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến các thông số hóa sinh nước tiểu 39 3.1.5. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến các thông số liên quan tới thận 39 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 43 4.1. Bàn luận về liều của hóa chất gây sỏi và thời gian gây sỏi 43 4.2. Bàn luận về việc triển khai mô hình gây sỏi bằng EG 1% và AC 0,5%. 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 52 i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT COM Calci oxalat monohydrat COD Calci oxalat dihydrat EG Ethylen glycol AC Amoni clorid Ca Calci Mg Magnesi P Phospho V Thể tích KLCT Khối lượng cơ thể ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 3.1 Khối lượng cơ thể chuột ở 5 nhóm nghiên cứu trước và sau khi tiến hành thí nghiệm 10 ngày 25 3.2 Số lượng tinh thể calci oxalat niệu của các nhóm trong 4 tuần thí nghiệm 26 3.3 Mức độ và tỉ lệ kết tập sỏi trong thận của các nhóm 28 3.4 Thể tích nước tiểu của các nhóm trong quá trình thí nghiệm 33 3.5 pH nước tiểu của các nhóm trong quá trình thí nghiệm 34 3.6 Số lượng tinh thể calci oxalat của các nhóm trong quá trình thí nghiệm 35 3.7 Các thông số hóa sinh nước tiểu của các nhóm 38 3.8 Tỉ lệ khối lượng thận so với khối lượng cở thể của các nhóm 39 3.9 Nồng độ Ca, P trong dịch nghiền đồng thể thận của các nhóm 39 3.10 Mức độ và tỉ lệ kết tập sỏi tại thận của các nhóm 40 iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Hình dạng tinh thể COD và COM dưới kính hiển vi quang học 3 2.1 Sơ đồ quy trình thực nghiệm thăm dò liều của hóa chất và thời gian gây sỏi 19 2.2 Sơ đồ quy trình triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu 22 3.1 Khối lượng cơ thể chuột của 3 nhóm nghiên cứu trong 4 tuần thí nghiệm 25 3.2 Hình ảnh tinh thể calci oxalat niệu dưới kính hiển vi quang học (X 400) 27 3.3 Hình ảnh tiêu bản mô bệnh học thận dưới kính hiển vi phân cực (x 100 ) 29 3.4 Hình ảnh tiêu bản mô bệnh học thận dưới kính hiển vi phân cực (x 400) 30 3.5 Khối lượng cơ thể chuột của các nhóm trong thời gian thí nghiệm 32 3.6 Số lượng tinh thể COD và COM trong nước tiểu của các nhóm trong quá trình thí nghiệm 36 3.7 Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nước tiểu của các nhóm 37 3.8 Hình ảnh vùng nhu mô thận dưới kính hiển vi phân cực (x100) 40 3.9 Hình ảnh vi thể vùng nhú thận dưới kính hiển vi phân cực ( x100) 41 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sỏi tiết niệu là một trong những bệnh được biết đến sớm nhất trên thế giới, ước tính ảnh hưởng đến khoảng 12% dân số toàn cầu [32]. Cùng với sự phát triển của y học hiện đại, nhiều phương pháp trị liệu mới đã được nghiên cứu và ứng dụng trong quá trình điều trị sỏi tiết niệu. Các phương pháp ngoại khoa mới được áp dụng trong thời gian gần đây như tán sỏi ngoài cơ thể (ESWL), tán sỏi qua da, tán sỏi qua nội soi … là những phương pháp hiệu quả để loại bỏ sỏi khỏi đường tiết niệu. Tuy nhiên, khi bệnh nhân sử dụng các phương pháp này có thể gặp phải những tai biến trong quá trình điều trị [23]. Các thuốc tân dược điều trị sỏi tiết niệu hiện nay vẫn rất hạn chế về hiệu quả, đặc biệt là ở khả năng phòng sỏi tái phát [18]. Trước thực trạng đó, xu hướng sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu trong điều trị sỏi tiết niệu đang ngày càng được quan tâm. Các thuốc từ dược liệu thường bao gồm nhiều thành phần, tác dụng thông qua nhiều cơ chế. Do đó, để sử dụng các thuốc này một cách hiệu quả cần làm sáng tỏ tác dụng, cơ chế tác dụng của chúng. Để đánh giá tác dụng điều trị sỏi của thuốc cần tiến hành nghiên cứu trên động vật đã được gây sỏi tiết niệu. Các mô hình gây sỏi trên động vật đã được nghiên cứu khá phổ biến trên thế giới, tuy nhiên vẫn còn tồn tại nhiều điểm chưa thống nhất giữa các tác giả. Ở Việt Nam, đã có một số phương pháp nghiên cứu sỏi in vitro nhưng chưa có tác giả nào tiến hành gây sỏi trên động vật thí nghiệm. Với mong muốn tìm ra một mô hình gây sỏi tiết niệu chính xác, ổn định và phù hợp với điều kiện Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật thực nghiệm” với mục tiêu: Triển khai được mô hình gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Sinh lí bệnh sỏi tiết niệu 1.1.1. Định nghĩa Sỏi tiết niệu là sự hình thành và hiện diện sỏi trong đường tiết niệu. Khi sỏi ở vị trí nào thì tên gọi theo vị trí giải phẫu (sỏi thận, sỏi niệu quản, sỏi bàng quang) [2]. 1.1.2. Đặc điểm dịch tễ bệnh sỏi tiết niệu Bệnh sỏi tiết niệu là bệnh phổ biến thứ ba trong các bệnh thuộc hệ thống đường tiết niệu, ảnh hưởng đến 10 - 12% dân số thế giới [51]. Tỉ lệ mắc bệnh khác nhau theo vùng phụ thuộc vào khí hậu, chế độ ăn, lối sống: 2 - 5% ở châu Á, 8-15% ở châu Âu và châu Mĩ, khoảng 20% ở Trung Đông [42], [43]. Bệnh gặp ở nam nhiều gấp hai đến ba lần ở nữ bởi vì khả năng thúc đẩy của testosteron và khả năng ức chế của oestrogen lên quá trình hình thành sỏi tiết niệu [28], [42]. Sỏi tiết niệu là bệnh có tỉ lệ tái phát rất cao, khoảng 40% trong vòng 3 năm đầu tiên, 75% trong vòng 10 năm tiếp theo và trong vòng 25 năm, hầu hết bệnh nhân sẽ tái phát sỏi tiết niệu ít nhất một lần nếu không áp dụng các liệu pháp phòng bệnh thích hợp [42], [51]. Tỉ lệ tái phát sỏi ở nam giới cũng cao hơn nữ giới: 70 - 81% ở nam so với 47 - 60% ở nữ [38]. Tuổi mắc bệnh phổ biến là từ 35 - 55 tuổi, thời điểm mắc bệnh khác nhau tùy theo loại sỏi, tuổi mắc bệnh trung bình đối với sỏi calci là 48,7 tuổi, sỏi struvit là 46,7 tuổi, sỏi urat là 59,4 tuổi, sỏi cystein là 27,9 tuổi. Ở Việt Nam sỏi thận chiếm 40 %, sỏi niệu quản chiếm 28,27%, sỏi bàng quang chiếm 28,3%, sỏi niệu đạo chiếm 5,4% trong tổng số bệnh nhân bị sỏi thận nói chung, sỏi tiết niệu gặp ở nam nhiều gấp 2 lần ở nữ, gặp nhiều ở người trên 30 tuổi. Sỏi struvit chiếm tỉ lệ cao kèm theo nhiễm khuẩn [1]. [...]... 13  Áp dụng mô hình Phương pháp trên đã được áp dụng trong nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi in vitro của dịch chiết rễ chuối hột [36] và bài thuốc ngũ linh tán [5] 1.2.2 Các mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo và đánh giá tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của thuốc Do sỏi calci oxalat là loại sỏi phổ biến nhất (chiếm 80% các trường hợp sỏi tiết niệu) nên hầu hết các mô hình gây sỏi tiết niệu hiện nay... cứu Thí nghiệm gây sỏi được tiến hành trong vòng 12 tuần Tiến hành lấy mẫu nước tiểu và mẫu thận ở cuối thí nghiệm để xét nghiệm các chỉ số hóa sinh nước tiểu, đánh giá sự kết tập sỏi calci oxalat trong thận  Áp dụng của mô hình Mô hình gây sỏi tiết niệu bằng chế độ ăn thiếu vitamin B6 đã được áp dụng trong nghiên cứu tác dụng dự phòng sỏi tiết niệu của pentosan polysulfat [53] 1.2.2.3 Mô hình gây sỏi. .. thận để làm xét nghiệm mô bệnh học nhằm đánh giá sự kết tập sỏi calci oxalat tại thận  Áp dụng của mô hình Mô hình gây sỏi tiết niệu trên chuột tăng bài tiết calci do di truyền rất thích hợp để nghiên cứu bệnh lý tăng calci niệu, một rối loạn phổ biến ở những người mắc bệnh sỏi tiết niệu [17] Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng của một số thuốc điều trị bệnh sỏi tiết niệu như cinacalcet... hình bầu dục, hình tạ đôi, có khả năng kết tập cao, dễ gắn với tế bào biểu mô ống thận nên dễ gây sỏi thận hơn dạng COD [23] 4 (a) (b) (c) Hình 1.1 Hình dạng tinh thể COD (a) và COM (b, c) dưới kính hiển vi quang học 1.1.3.2 Phân loại theo vị trí của sỏi trong đường tiết niệu Dựa vào vị trí của sỏi trong đường tiết niệu, sỏi tiết niệu được chia thành: sỏi thận, sỏi niệu quản, sỏi bàng quang, sỏi niệu. .. nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của thuốc, lô điều trị được sử dụng hóa chất gây sỏi để gây sỏi tiết niệu trước, sau đó mới cho sử dụng thuốc cần 15 nghiên cứu trong thời gian thích hợp Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của dịch chiết các dược liệu Cynodon dactylon [19], Origanum vulgare [10] 1.2.2.2 Mô hình gây sỏi tiết niệu thông qua điều chỉnh chế... thích nghi trong điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 7 ngày 2.2 Nội dung nghiên cứu - Thực hiện nghiên cứu thăm dò nhằm lựa chọn nồng độ của ethylen glycol, amoni clorid và thời gian gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng - Triên khai mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol và amoni clorid với nồng độ và thời gian đã chọn 19 2.3 Phương pháp gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng Tiến hành gây. .. 25% với lượng 1ml/100g cân nặng Thời gian của thí nghiệm gây sỏi là 28 ngày Quá trình thực nghiệm được mô tả ở hình 2.2 Bắt đầu Giai đoạn thích nghi Kết thúc Uống hóa chất gây sỏi và natri citrat hàng ngày 23 tuần -1 0 1 2 3 4 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu 2.3.2.1 Các thông số đánh giá  Khối lượng cơ thể chuột Tiến hành như mô tả ở mục 2.3.1  Thể tích, pH và các chỉ... tế bào biểu mô ống thận hoặc tại cấu trúc nằm trên bề mặt của nhú thận [9] Các nghiên cứu gần đây xác nhận vai trò quan trọng của sự tổn thương tế bào biểu mô thận đối với cơ chế hình thành sỏi thận, các tổn 7 thương này đã được phát hiện khi gây sỏi tiết niệu bằng mô hình gây tăng bài tiết oxalat niệu [49] 1.1.5 Diễn tiến của bệnh sỏi tiết niệu Sau khi đã hình thành, nếu kích thước nhỏ, sỏi có thể... [14], thiosulfat [35] 1.2.2.4 Mô hình gây sỏi tiết niệu bằng cách cấy trực tiếp sỏi vào bàng quang của động vật thí nghiệm  Nguyên tắc Tạo hạt sỏi calci oxalat rồi đưa vào bàng quang của chuột thông qua phẫu thuật để gây sỏi bàng quang [41]  Tiến hành thí nghiệm Tạo hạt sỏi calci oxalat in vitro bằng phản ứng kết tủa giữa dung dịch natri oxalat và calci clorid ở nồng độ thích hợp Những tinh thể nhỏ... từ bàng quang để phân tích kích thước, hình thái, thành phần cấu tạo So sánh lô điều trị với lô chứng bệnh để đánh giá tác dụng hòa tan sỏi tiết nệu của thuốc  Áp dụng mô hình trong nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu Mô hình gây sỏi tiết niệu bằng cách cấy sỏi trực tiệp vào bàng quang của chuột cống trắng được áp dụng để nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của dịch chiết dược liệu Phyllanthus . chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật thực nghiệm với mục tiêu: Triển khai được mô hình gây sỏi tiết niệu trên chuột cống trắng. 2 . giá tác dụng điều trị sỏi của thuốc cần tiến hành nghiên cứu trên động vật đã được gây sỏi tiết niệu. Các mô hình gây sỏi trên động vật đã được nghiên cứu khá phổ biến trên thế giới, tuy nhiên. chế hình thành sỏi tiết niệu 4 1.1.5. Diễn tiến của bệnh sỏi tiết niệu 7 1.1.6. Điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu 7 1.2. Các phương pháp và mô hình nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu