B Y T TRNG I HC DC HÀ NI PHM THU HÀ TNG QUAN V PHNG PHÁP ÁNH GIÁ TÁC DNG CA CÁC CHT MA TUÝ DA VÀO K THUT THM TÁCH MICRO KHÓA LUN TT NGHIP DC S HÀ NI – 2013 B Y T TRNG I HC DC HÀ NI PHM THU HÀ TNG QUAN V PHNG PHÁP ÁNH GIÁ TÁC DNG CA CÁC CHT MA TUÝ DA VÀO K THUT THM TÁCH MICRO KHÓA LUN TT NGHIP DC S Ngi hng dn: 1. PGS.TS. Thái Nguyn Hùng Thu 2. TS. Nguyn Thành Hi Ni thc hin 1. B môn Hoá phân tích và c cht – Trng i hc Dc Hà Ni 2. B môn Dc lâm sàng – Trng i hc Dc Hà Ni. HÀ NI - 2013 LI CM N Vi lòng bit n sâu sc, tôi xin gi li cm n chân thành nht n: PGS. TS. Thái Nguyn Hùng Thu TS. Nguyn Thành Hi là nhng ngi thy ã trc tip hng dn và ch bo tn tình  tôi hoàn thành khoá lun này. ng thi, hai thy cng ã dn dt và chia s cho tôi nhng kinh nghim vô cùng quý báu  hoàn thành các bài báo "Nghiên cu hiu qu tác dng ca morphin trên nng  dopamin và serotonin da vào k thm tách micro" và “Nghiên cu mô hình ánh giá hiu qu tác dng ca các cht ma túy thông qua nng  dopamin da vào k thut thm tách micro”. Tôi cng xin chân thành cm n nhng góp ý, chnh sa quý báu ca TS. Phm Hng Lân, Vin K thut Hoá sinh và Tài liu nghip v - B Công An,  hoàn chnh nghiên cu này có th ng dng vào thc t ti Vit Nam. Tôi xin cm n b môn Hoá phân tích và c cht và b môn Dc lâm sàng ã to iu kin cung cp cho tôi các tài liu cn thit  hoàn thành khoá lun này. Tôi xin cm n Ban giám hiu, các phòng ban, các thy cô giáo và cán b nhân viên trng i hc Dc Hà Ni – nhng ngi ã dy bo và trang b cho tôi nhng kin thc khoa hc nn tng sut 5 nm hc di mái trng này. Cui cùng, tôi xin gi nhng li thân thng nht n gia ình, bn bè, tp th lp A2K63 ã luôn  bên ng viên, giúp  tôi vt qua mi khó khn trong quá trình hc tp và hoàn thin khoá lun. Hà ni, ngày 21 tháng 5 nm 2013 Sinh viên Phm Thu Hà MC LC Danh mc các kí hiu vit tt Danh mc các bng Danh mc các hình và biu  T VN  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1  PHN 1. TNG QUAN V K THUT THM TÁCH MICRO VÀ NG DNG . 3 1.1. TÓM TT V LCH S PHÁT TRIN VÀ NG DNG CA K THUT THM TÁCH MICRO 3 1.2. KHÁI QUÁT V K THUT THM TÁCH MICRO 5 1.3. NGUYÊN LÝ VÀ CU TO CA K THUT THM TÁCH MICRO 6 1.3.1. Nguyên lý 6 1.3.2. Kim thm dò 7 1.3.3. Dch truyn 9 1.3.4. Phng pháp nh lng các phân t thuc 10 1.3.4.1. Sc ký lng hiu nng cao (HPLC) 10 1.3.4.2. Sc ký lng khi ph (LC-MS) 12 1.3.5. Hiu sut kim thm dò 18 1.3.5.1. Hiu sut tng i in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8  1.3.5.2. Hiu sut thc nghim in vivo 20 1.4. U NHC IM CA K THUT THM TÁCH MICRO 25 1.4.1. u im 25 1.4.2. Nhc im và mt s bin pháp khc phc 27 1.5. QUY TRÌNH NGHIÊN CU CHUNG KHI S DNG K THUT THM TÁCH MICRO TRONG NGHIÊN CU Y DC 28 PHN 2: TNG QUAN V MA TUÝ, DOPAMIN VÀ MI LIÊN H GIA DOPAMIN VI CÁC CHT MA TUÝ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9  2.1. TNG QUAN V CÁC CHT MA TUÝ 29 2.1.1. nh ngha “ma tuý” 29 2.1.2. Phân loi các cht ma tuý 30 2.2. DOPAMIN 31  2.2.1. nh ngha 31 2.2.2. Các con ng dn truyn dopamin trong não 31 2.2.3. Vai trò ca dopamin 33 2.3. MI LIÊN H GIA DOPAMIN VÀ S DNG CÁC CHT MA TUÝ 34 PHN 3: TNG QUAN PHNG PHÁP ÁNH GIÁ HIU QU TÁC DNG CA CÁC CHT MA TUÝ THÔNG QUA NH LNG DOPAMIN TRONG NÃO NG VT DA VÀO K THUT THM TÁCH MICRO 38  3.1. NGUYÊN VT LIU S DNG 38 3.1.1. ng vt thí nghim 38 3.1.2. Các thuc c s dng trong thí nghim 38 3.1.3. Ta  cy kim thm dò vào các vùng não ly DA 40 3.1.4. Chun b kim thm dò 41 3.1.5. Chun b các thit b m và nh lng 42 3.2. CÁC BC TIN HÀNH 43 3.2.1. Phu thut cy kim thm dò vào não chut 43 3.2.2. Tin hành ly mu thu c có cha DA 44 3.2.3. Ct b phn não  xác nh chính xác v trí cy kim thm dò 45 3.2.4. nh lng bng HPLC hoc LC-MS/MS và tính toán kt qu thng kê. 46 3.2.5. Báo cáo kt qu thu c 49 3.3. TNG HP KT QU T CÁC NGHIÊN CU Ã CÔNG B V ÁNH GIÁ HIU QU TÁC DNG CHT MA TUÝ TRÊN NÃO CHUT DA VÀO K THUT THM TÁCH MICRO 50 KT LUN VÀ  XUT 53 1. KT LUN 53 2.  XUT 54 TÀI LIU THAM KHO 55 PH LC: Các bài báo khoa hc ã c công b ca  tài 67 DANH MC CÁC KÍ HIU VIT TT aCSF Dung dch gi não tu (artificial cerebrospinal fluid) AMP Amphetamin C Nng  (concentration) CID Va chm phân ly (collision-induced disociation) CNS H thng thn kinh trung ng (central nervous system) CSF Dung dch não tu (cerebrospinal fluid) DA Dopamin Da Dalton DC Dòng in mt chiu (direct current) DRE Chng trình nhn bit ma tuý (drug recognition expert) ECF Dch ngoi bào (extracellular fluid) EF T l chit xut (extraction fraction) ESI Ion hoá bng tia in (electrospray ionisation) HPLC Sc ký lng hiu nng cao kDa Kilo Dalton LC Sc ký lng (liquid chromatography) LC-MS Sc ký lng khi ph LC-MS/MS Sc k lng khi ph ghép LSD Acid lysergic MDMA 3,4-methylenedioxy-N-methylamphetamin MS Khi ph (mass spectrometry) MRM Ch  a nhim (multiple reaction monitoring) NAc Nhân accumben (nucleus accumbens) NNF No-net flux PCP Phencyclidine PET Positron emission tomography QQQ T cc chp ba gm 3 t cc (quadrupole) RF Tn s (radio frequency) RR Hiu sut tng i (relative recovery) sNPC Substantia nigra par compacta THC Tetrahydrocannabinol TLTK Tài liu tham kho VTA Ventral tegmental area ZNF Zero-net-flux DANH MC CÁC BNG Bng 1.1. Thành phn nng  các dch truyn c s dng trong k thut thm tách micro 10 Bng 1.2. So sánh nh hng ca mt s yu t thc nghim n hiu sut in vitro và in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20  Bng 2.1. Mc  tng DA trong vùng não trên chut nht thc nghim khi nghiên cu trên các loi tác ng kích thích 33  Bng 2.2. So sánh v kh nng gii phóng DA  2 nhóm i tng: liu n – i tng không nghin, liu kéo dài – i tng nghin 37  Bng 3.1. c im ca chut thc nghim dùng trong nghiên cu thm tách micro 38 Bng 3.2. Mt s cht ma tuý ã c s dng trong các nghiên cu thm tách micro 39 Bng 3.3. Thành phn dch gi não tu 39 Bng 3.4. Ta  cy kim thm dò ti mt s vùng trong não 40 Bng 3.5. Cài t detector khi ph áp dng cho nh lng DA 47 Bng 3.6. Thành phn pha ng 48 Bng 3.7. Tng hp các kt qu v % tng DA trong não chut cng và chut nht ti mt s vùng trong não (nhân accumben, th vân, caudate) khi s dng morphin, amphetamin và cocain 51  DANH MC CÁC HÌNH VÀ BIU  Hình 1.1. Kt qu tìm kim trên medline vi t khoá “microdialysis” và “microdialysis dopamine” 4  Hình 1.2. Các mô ích tác dng ca thuc trên ngi ã c thc hin nghiên cu lâm sàng bi k thut thm tách micro 4  Hình 1.3. Khái quát v k thut thm tách micro 5 Hình 1.4. S khuch tán th ng ca các phân t có trng lng thp khi i qua các l ca màng bán thm ti mô ích tác dng 6  Hình 1.5. Cu to ca kim thm dò dng ng tâm 7 Hình 1.6. Quá trình cy kim thm dò vào mô s dng kim dn 9 Hình 1.7. S  ly mu bng k thut thm tách micro online 12 Hình 1.8. Nguyên tc và cu to ca máy MS 13 Hình 1.9. C ch to ion ca ESI gm 3 giai on chính 15 Hình 1.10. Cu to b phân tích t cc 16 Hình 1.11. Cu to b t cc chp ba 16  Hình 1.12. Cu to ca b phân tích by ion 17 Hình 1.13. Mô hình th nghim ánh giá hiu sut kim thm dò in vitro 18 Hình 1.14. Phng pháp tính toán NNF 21 Hình 1.15. Phng pháp ngoi suy tc  dòng chy 23 Hình 1.16. ng vt thc nghim có th di chuyn và sinh hot bình thng trong quá trình ly mu 25  Hình 1.17. Kim thm dò c cy vào mô c (trái) và mô não (phi) 26 Hình 1.18. B thu tín hiu thm tách micro online bên ging bnh 27 Hình 2.1. Các con ng dn truyn và c ch gii phóng DA trong não 32 Hình 2.2. Các con ng dn truyn “phn thng” trong não khi s dng mt s cht in hình nh: opioids, ethanol, barbiturat, AMP, cocain, cannabioids, PCP cho thy dn truyn DA tp trung ch yu v vùng nhân accumben 34  Hình 2.3. C ch làm tng gii phóng DA trong não ca amphetamin 35  Hình 2.4. C ch kích thích gii phóng DA ca opiat 36 Hình 2.5. C ch tng gii phóng DA ca cocain 36 Hình 2.6. So sánh v mt  th th DA  ngi bình thng và ngi nghin 37 Hình 3.1. Hp s ca chut nhìn t trên xung 40 Hình 3.2. Kim thm dò và kim dn 41 Hình 3.3. Máy c nh 3 chiu dùng  phu thut 42 Hình 3.4. Máy ct lát mô não 42 Hình 3.5. H thng sc ký LC-MS vi detector t cc chp ba (trái) và HPLC (phi) 42 Hình 3.6. Phu thut cy kim thm dò lên não chut 43 Hình 3.7. Chut c chm sóc sau phu thut 44 Hình 3.8. Biu  vt kim thm dò  nhân accumben 45  Hình 3.9. Mô hình thm tách micro offline trong thí nghim 46 Hình 3.10. Hiu qu ca morphin trên nng  DA ti vùng nhân accumben  chut nht thc nghim 50  -1- T VN  Ma tuý t lâu ã tr thành vn  nhc nhi ca xã hi và phòng chng t nn ma tuý luôn là mt trong nhng nhim v hàng u ca mi quc gia. Theo báo cáo nm 2012 ca Liên Hp Quc, trên th gii c tính có t 153 n 300 triu ngi s dng ma túy trái phép ít nht mt ln trong mt nm, trong ó có t 15,5 n 38,6 triu ngi nghin, và con s này có chiu hng gia tng theo tng nm [97] .  Vit Nam, theo thng kê t B Lao ng - Thng binh và Xã hi nm 2011 cho n nay c 63 tnh, thành ph u có ngi nghin ma túy, c nc có khong 149.900 ngi nghin có h s qun lý [1] . Hn na, vi din bin phc tp ca ti phm ma tuý, các loi ma tuý tng hp mi c ra i vi cu trúc và thành phn a dng, khin cho vic phát hin và qun lý ma tuý tr nên càng khó khn hn. Các loi phn ng test nhanh (screening test) nc tiu, máu hay dch sinh hc khác trên th trng tuy ph bin và tin dng, nhng có nhiu hn ch nh là ch phát hin c 5 nhóm ma tuý ph bin vi  nhy thp, rt d b cho kt qu nhm ln nh khi pha loãng hay tráo mu, d xy ra phn ng chéo gây kt qu dng tính gi [81] , do ó không th áp ng  trong công cuc phòng chng t nn ma tuý và m bo giá tr pháp lý cho các c quan thc thi pháp lut. K thut thm tách micro (Microdialysis - MD) là mt k thut vi nguyên tc n gin, ã c áp dng mt cách hiu qu trên th gii trong các nghiên cu tin lâm sàng và lâm sàng v ánh giá hiu qu tác dng ca các cht ma tuý. Thông qua vic o nng  ca mt cht trung gian trong não là dopamin (cht to nim vui) ti các vùng não gii phóng dopamin, hoàn toàn có th ánh giá c mt cht có phi là ma tuý hay không mà không cn xác nh cu trúc hoá hc c th ca cht ó. Hn th na, thm tách micro da trên nguyên tc khuch tán th ng ca cht cn phân tích qua màng bán thm  u kim thm dò (trung tâm ca k thut), cho phép thu c mu sch, không ln protein hay các enzym ti dch k mô, do ó khâu làm sch mu có th c b qua. ng dng vt tri ca k thut thm tách micro chính là mô hình thm tách micro online xác nh trc tip các bin i nng  ca cht cn phân tích ti mô ích khi i tng nghiên cu vn có th di chuyn và hot ng bình thng, cho kt qu khách quan vi  tin cy rt cao. [...]... th m tách micro và chu n cho ph hành th c hi n xây d ng m t mô hình ng pháp ánh giá hi u qu tác d ng c a các ch t ma túy, chúng tôi ti n tài “T ng quan v ph ng pháp ánh giá tác d ng c a các ch t ma tuý d a vào k thu t th m tách micro v i các m c tiêu: 1 T ng quan v k thu t th m tách micro và ng d ng 2 T ng quan v ma tuý, dopamin và m i liên h gi a dopamin v i vi c s d ng các ch t ma tuý 3 T ng quan. .. qua vi c xác micro ng pháp ánh giá hi u qu tác d ng c a các ch t ma tuý nh n ng dopamin trong não d a vào k thu t th m tách -31 PH N 1 T NG QUAN V K THU T TH M TÁCH MICRO VÀ 1.1 TÓM T T V L CH S NG D NG PHÁT TRI N VÀ NG D NG C A K THU T TH M TÁCH MICRO K thu t th m tách micro (Microdialysis - MD) nh vào các nghiên c u khi m t c bi t t tr c ti p các túi th m tách có m t u truy n d ch ra vào mô 1974,... lâm sàng b i k thu t th m tách micro [66] -5- 1.2 KHÁI QUÁT V K THU T TH M TÁCH MICRO Th m tách micro (Microdialysis) là k thu t cho phép xác nh n ng các ch t n i sinh (endogen) và ngo i sinh (exogen) t i mô ích tác d ng, d a vào s khu ch tán th ng c a các phân t có tr ng l ng th p qua m t màng bán th m [7, 84] Kim th m dò (probe) là trung tâm c a th m Quá trình x y ra tách micro, là m t que kim thi... m tách micro, ch t phân tích không b hao h t do quá trình làm s ch m u [44] • ng d ng k thu t th m tách ng c (retrodialysis) trong i u tr t i mô ích khi mà các phân t thu c không th phân b tác d ng , n các mô b nh; trong nghiên c u c hi u c a các ch t d n truy n th n kinh hoá c a các tác nhân gây ung th t i các u b [76] [74] ; trong so sánh s chuy n u v i các mô kho m nh [7, 60] -27• Th m tách micro. .. Hình 1.3 Khái quát v k thu t th m tách micro truy n r t -6- 1.3 NGUYÊN LÝ VÀ C U T O C A K THU T TH M TÁCH MICRO 1.3.1 Nguyên lý Th m tách micro là k thu t cho phép xác d n truy n th n kinh nh nh n ng các ch t n i sinh (các ch t dopamin, serotonin, noradrenalin … hay phân t glucose, glutamat, lactat…) và các ch t ngo i sinh (phân t thu c) t i mô ích tác d ng, d a vào s khu ch tán th m t màng bán th... th m dò Th m tách micro có th áp d ng d ng [71] , c g i là th m tách ng b ng 0 ho c th p h n n ng c a các phân t có tr ng l ng th p qua c c y vào mô ích (Hình 1.4) [7, 84, 106] a các phân t thu c n t n các mô ích tác c (retrodialysis) N u t i mô i u tr , n ng trong d ch truy n vào, các phân t thu c s thu c i qua màng bán th m và vào mô ích tác d ng [13, 80] Hình 1.4 S khu ch tán th ng c a các phân t... nghiên c u sinh hoá t chu t th c nghi m [96] Ban u, k thu t th m tách micro ch y u bào th n kinh trong não chu t ho t nhanh chóng ng tách micro ch c ng h c ti n lâm sàng và lâm n quá trình thay u vào n m 1987, th m tách micro glucose trong d ch k t bào c a ng h c ã ng, nh ng sau ó, th m tách micro ã c s d ng trong các nghiên c u d sàng c a các phân t thu c nh h Kh i ng bình th i sinh lý t bào th n kinh... µl/phút và RR ng pháp này có nh ng pháp ngo i [76, 91] , không v t quá 0,3 µl/phút c áp d ng nhi u trong các th nghi m d c [26] Do ó, ph ng h c lâm sàng [91] t c ng pháp -24(4) Ph ng pháp th m tách ng Th m tách ng gian và s l [3, 44] c th hi n tính v c (retrodialysis) t tr i h n so v i các ph ng v t thí nghi m [76], do ó hi n nay ây là ph Trong th m tách ng c, ng ng pháp trên v th i ng pháp thông d ng... n xu t CMA, Thu 1.3.4 Ph ng pháp Vì l ng m u thu òi h i các ph ph nh l ng pháp i n) ng các phân t thu c c trong k thu t th m tách micro là r t nh (c microlit) nên nh l ng ph i có nh y cao, ph bi n hay s d ng nh t là ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) và s c ký l ng k t h p kh i ph (LC - MS) [44, 80] 1.3.4.1 S c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) HPLC là m t k thu t tách (separation) trong ó các ch t... m tách micro và ng pháp HPLC (th m tách micro online) nh l ng tr c ti p b ng c th hi n trong Hình 1.7 -12- Hình 1.7 S l y m u b ng k thu t th m tách micro online 1 H th ng b m tiêm 2 B ph n ch nh dòng 3 Thi t b thu m u 4 Kim th m dò 5 D ng c ch a ng v t th c nghi m di chuy n t do bên trong 6 Bàn ng 10 Pha Ph 7 Van tiêm 8 C t HPLC 9 B m pha ng 11 Detector 12 Máy tính ng pháp HPLC thích h p phân tách . “Tng quan v phng pháp ánh giá tác dng ca các cht ma tuý da vào k thut thm tách micro vi các mc tiêu: 1. Tng quan v k thut thm tách micro và ng dng. 2. Tng quan v ma tuý,. S DNG CÁC CHT MA TUÝ 34 PHN 3: TNG QUAN PHNG PHÁP ÁNH GIÁ HIU QU TÁC DNG CA CÁC CHT MA TUÝ THÔNG QUA NH LNG DOPAMIN TRONG NÃO NG VT DA VÀO K THUT THM TÁCH MICRO 38  3.1 s dng các cht ma tuý. 3. Tng quan v phng pháp ánh giá hiu qu tác dng ca các cht ma tuý thông qua vic xác nh nng  dopamin trong não da vào k thut thm tách micro.