BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ MINH TẤN TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ MINH TẤN TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Xuân Bắc Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Sinh HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên cho tôi xin được gửi tới Ths. Nguyễn Xuân Bắc lời biết ơn chân thành và sâu sắc. Thầy là người đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa Sinh Trường Đại học Dược Hà Nội, các dược sỹ và bác sỹ trong bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin dành những lời tri ân tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn luôn động viên, cổ vũ tôi vượt qua những khó khăn mà có lúc tưởng chừng như muốn bỏ cuộc, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình. Hà Nội, ngày 21/5/2013 Hồ Minh Tấn MỤC LỤC Trang Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CYP2D6 2 1.1. CYTOCHROM − P450 2 1.1.1. Phân bố 3 1.1.2. Phân loại và danh pháp 3 1.1.3. Cơ chế xúc tác của CYP 4 1.2. CYP2D6 6 1.2.1. Cấu trúc của CYP2D6 7 1.2.2. Cơ chế tác dụng của CYP2D6 8 1.2.3. Cơ chất của CYP2D6 9 1.3. GEN MÃ HÓA CYP2D6 15 CHƯƠNG 2. ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6 16 2.1. KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ĐỘT BIẾN GEN 16 2.1.1. Các loại đột biến 17 2.1.2. Nguyên nhân đột biến 20 2.2. NHỮNG ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 25 2.2.1. Những allen của gen CYP2D6 25 2.2.2.Kiểu hình và kiểu gen CYP2D6 của các chủng tộc trên thế giới 37 2.3. HẬU QUẢ LÂM SÀNG CỦA TƯƠNG TÁC KIỂU GEN – KIỂU HÌNH CỦA CYP2D6 38 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 43 3.1. KỸ THUẬT ADN CHIP 43 3.1.1. Nguyên tắc: 43 3.1.2. Ưu điểm: 44 3.1.3. Nhược điểm: 45 3.2. KỸ THUẬT LONG-PCR 45 3.2.1. Nguyên tắc 45 3.2.2. Ưu điểm 45 3.3.3. Nhược điểm 45 3.3.4. Áp dụng xác định sự nhân đôi gen CYP2D6 46 3.3. KỸ THUẬT REAL-TIME PCR 47 3.3.1. Nguyên tắc: 47 3.3.2. Ưu điểm 48 3.3.3. Nhược điểm 48 3.3.4. Áp dụng xác định đột biến CYP2D6 48 3.4. KỸ THUẬT PCR-RFLP 49 3.4.1. Nguyên tắc 49 3.4.2. Ưu điểm 51 3.4.3. Nhược điểm: 51 3.4.4. Áp dụng trên CYP2D6 51 3.5. KỸ THUẬT PCR PHỨC HỢP 52 3.5.1. Nguyên tắc: 52 3.5.2. Ưu điểm 53 3.5.3. Nhược điểm 53 3.5.4. Áp dụng trên CYP2D6 giúp chẩn đoán allen *5 và allen*10 53 3.6. MỘT SỐ KỸ THUẬT KHÁC GIÚP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN CYP2D6 56 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 56 4.1. HIỆN TƯỢNG ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 56 4.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH CYP2D6 TRÊN THẾ GIỚI 57 4.3. ĐỀ XUẤT HƯỚNG NGHIÊN CỨU CYP2D6 Ở VIỆT NAM 58 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN 59 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU/CHỮ TÊN TIẾNG ANH TÊN TIẾNG VIỆT (nếu có) ADN Deoxyribonucleic Acid ADR Adverse Drug Reaction Phản ứng bất lợi của thuốc ARN Ribonucleotic Acid CL int Clearance instrict Độ thanh thải nội tại gan CYP Cytochrom P450 EM Extensive metabolism Chuyển hóa nhanh FADH 2 Flavin Adenine Dinucleotide FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ IM Intermediate metabolism Chuyển hóa chậm kb Kilo base MR Metabolic ratio Tỷ lệ chuyển hóa NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen PM Poor metabolizer Chuyển hóa rất chậm SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotid UM Ultra metabolism Chuyển hóa siêu nhanh DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Ảnh hưởng của đa hình di truyền CYP2D6 lên một số thuốc điều trị 38 Bảng 3.1. Các mồi và enzym cắt tương ứng từng allen [79] 50 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Tỷ lệ chuyển hóa thuốc bởi các CYP [65] 4 Hình 2: Cơ chế xúc tác của CYP [1] 5 Hình 3. Mô hình phân tử CY2D6 [100] 7 Hình 4. Cấu trúc vùng hoạt động của CYP2D6 [100] 7 Hình 5. Cơ chế xúc tác của CYP2D6 [68] 9 Hình 6. Chuyển hóa của dextromethorphan bởi CYP2D6 [105] 12 Hình 7. Vị trí CYP2D6 trên nhiễm sắc thể [37] 15 Hình 8 Mô tả các loại đột biến điểm [2] 19 Hình 9 Gen EGFR trong ung thư phổi: p.T751_I759>N [2] 20 Hình 10. Hình thành gen lai [33] 29 Hình 11. Sự lặp lại một hay nhiều lần và xóa toàn bộ gen CYP2D6 [43] 36 Hình 12. Kiểu gen CYP2D6 ở các vùng địa lý khác nhau [109] 37 Hình 13. Kiểu hình của CYP2D6 ở các vùng địa lý khác nhau [109] 38 Hình 14. Phân loại kiểu hình dựa trên kiểu gen và hậu quả lâm sàng dựa vào kiểu xúc tác bởi hiện tượng đa hình enzym [109] 39 Hình 15. Sơ đồ minh họa một AND chip [118] 44 Hình 16. Sản phẩm Long-PCR [95] 46 Hình 17. Phổ điện di [95] 47 Hình 18. Mồi và trình tự mồi [82] 49 Hình 19. PCR-RFLP chẩn đoán đột biến 360C>G trên gen mã hóa enzym deoxycytidin kinase [144] 50 Hình 20. Các allen CYP2D6 [84] 53 Hình 21. Chẩn đoán kiểu gen bằng kỹ thuật PCR truyền thống và PCR phức hợp [84] 55 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vào cuối những năm 50 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã phát hiện và tập trung nghiên cứu một hệ thống enzym có vai trò vô cùng quan trọng đối với con người, đó là hệ thống cytochrom P450 hay còn được gọi là CYP450. Hệ thống enzym này là tác nhân xúc tác chuyển hóa cho các chất nội sinh như các steroid, cholesterol, các acid mật…cũng như các chất ngoại sinh có cấu trúc khác nhau trong đó có các chất độc, chất gây ung thư và đặc biệt là chuyển hóa thuốc. Hiện nay người ta đã phát hiện được 57 isozym trên hệ thống CYP450 ở người và chia nó thành các họ và phân họ khác nhau. Trong số những isozym này, CYP2D6 giành được sự quan tâm đặc biệt. Bởi lẽ, dù chỉ đứng thứ hai về mặt số lượng các thuốc chuyển hóa nhưng CYP2D6 lại là một trong những enzym có hiện tượng đa hình phổ biến nhất. Và những hậu quả của hiện tượng này nhiều khi rất nghiêm trọng. Hơn thế nữa các nhóm thuốc điều trị được enzym này chuyển hóa như tim mạch, giảm đau, thần kinh, ung thư là những nhóm thuốc rất phổ biến hiện nay và có cửa sổ điều trị hẹp. Do đó, việc hiểu biết về CYP2D6 trên các phương diện: các đột biến gen, những biến đổi ở kiểu hình, hậu quả lâm sàng kèm theo và các phương pháp phát hiện đột biến là cần thiết, góp phần vào việc “tối ưu hóa điều trị”. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Tổng quan về các đột biến gen mã hóa CYP2D6” với những mục tiêu sau: 1. Tìm hiểu các đột biến gen mã hóa CYP2D6 đã được phát hiện. 2. Tìm hiểu về các phương pháp phát hiện đột biến gen CYP2D6. [...]... mã hóa cho 497 acid amin Nằm cùng trên nhiễm sắc thể 22 còn có 2 pseudogen là CYP2D8P và CYP2D7P [37] Hình 7 Vị trí CYP2D6 trên nhiễm sắc thể [37] 16 CHƯƠNG 2 ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6 2.1 KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ĐỘT BIẾN GEN Đột biến theo nghĩa rộng chỉ các biến đổi di truyền xảy ra đột ngột Một đột biến gen là một sự thay đổi trong trình tự nucleotid trên gen, dẫn đến kết quả là tạo ra một protein đột. .. cứu các đột biến giao tử và đo tỷ lệ đột biến ở sinh vật đa bào nói chung và người nói riêng cần xét đến tính lưỡng bội Hầu hết các đột biến gen là đột biến lặn và sẽ không được phát hiện nếu hợp tử không có hai bản của allen đột biến Do đó việc phát hiện và đo tần số đột biến phải dựa vào quan sát các đột biến trội đang xảy ra trên nhiễm sắc thể thường, các đột biến lặn và trội trên nhiễm sắc thể X... sai mà thôi Như vậy đột biến âm đã tác động như một đột biến kìm hãm ngoài gen đối với đột biến dương hoặc ngược lại b Đột biến đa điểm Các đột biến đa điểm là những thay đổi tác động đến hơn một base, thay đổi từ hai đến hàng ngàn base, nhưng thường nhất là chỉ vài base Hậu quả thường là xóa bỏ một phần của trình tự mã hóa Đột biến đa điểm không có tính hồi biến, nghĩa là đột biến được ổn định Sự... sinh vật có thể có tần số đột biến khác nhau nhưng tần số đột biến tự nhiên đối với mỗi gen là ổn định 17 Tần số đột biến được đánh giá căn cứ trên một lần sao chép, một lần phân bào hay trên một giao tử và trên một tế bào trong một thế hệ Tuy tần số đột biến của từng gen rất thấp nhưng tổng các đột biến của nhiều gen lại là một số đáng kể, có ý nghĩa quan trọng trong tiến hóa Các kết quả nghiên cứu... khoảng 10 -6 /gen/ thế hệ Ước tính các thay đổi xảy ra trong mỗi thế hệ dựa vào tỷ lệ đột biến ở người như sau: 10 -6 đột biến/ gen* 5.104 gen/ bộ gen đơn bội bằng 5.10-2 đột biến /giao tử (1/20) Mỗi hợp tử có (1/20) 2=1/10 cơ hội xảy ra đột biến gen Con số này có vẻ rất cao nhưng cần nhớ rằng hầu hết các đột biến là lặn và như vậy sẽ không được biểu hiện trong điều kiện dị hợp tử Sự thay đổi các base có... rác là bởi các đột biến mới trong gen của thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi Trong 1 năm có 7 trẻ sơ sinh bị loạn sản sụn trên tổng số 242257 trẻ sơ sinh , tỷ lệ là 7/242257 × 1/2 ( 2allen/ hợp tử) =1,4 × 10^-5 Trong tự nhiên, dù trong điều kiện nào tất cả các gen đều có đột biến được gọi là đột biến tự nhiên hay đột biến tự phát Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít Các gen khác nhau... chuyển hóa oxy hóa (và cũng được tạo bởi các tác nhân vật lý như tia phóng xạ ) Sản phầm oxy hóa quan trọng là 8 – hydroxy guanin bắt cặp sai với A, tạo đảo chuyển G – C thành T – A b Đột biến cảm ứng Các tác nhân là tăng tần số đột biến cao hơn mức tự nhiên được gọi là tác nhân gây đột biến Các tác nhân này có thể làm thay đổi trình tự ADN Các tác nhân đột biến cảm ứng được chia thành các tác nhân hóa. .. [4] Đột biến xảy ra ở các tế bào không sinh sản được gọi là đột biến sinh dưỡng và tạo ra các thay đổi có tính cục bộ, không di truyền được như các u sắc tố ngoài da người tạo ra nốt ruồi Những đột biến sinh dưỡng có thể là nguyên nhân gây ra ung thư và có thể là nguyên nhân của sự lão hóa Đột biến xảy ra trong giao tử được gọi là đột biến dòng mầm và được truyền cho đời sau Khi nghiên cứu các đột biến. .. thể sống 2.1.2 Nguyên nhân đột biến Có hai loại đột biến là đột biến tự nhiên ( xảy ra một cách tự phát )và đột biến cảm ứng( gây ra bởi các tác nhân đột biến) a Đột biến tự nhiên Xảy ra trong tự nhiên một cách ngẫu nhiên với tần số nhất định và không xác định được nguồn gốc Bất kì một tiến trình nào dẫn đến sự gắn sai base trong quá trình sao chép ADN sẽ tạo ra một đột biến điểm Tấn suất sai sót tự... (nonesense)) Đột biến lệch khung Các đột biến này do chèn hoặc mất một hoặc nhiều nucleotid trong vùng mã hóa của gen Điều này làm thay đổi khung đọc, vì các codon là các nhóm ba nucleotid nên có thể có ba khung đọc nhưng chỉ một cái được dùng Đột biến loại này thay đổi tất cả các acid amin phía sau đột biến và rất dễ tạo sản phẩm không chức năng vì khác hẳn với các protein thường Ngoài ra, các khung . tác dụng của CYP2D6 8 1.2.3. Cơ chất của CYP2D6 9 1.3. GEN MÃ HÓA CYP2D6 15 CHƯƠNG 2. ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6 16 2.1. KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ĐỘT BIẾN GEN 16 2.1.1. Các loại đột biến 17 2.1.2 TẤN TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ MINH TẤN TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỘT BIẾN. sau: 1. Tìm hiểu các đột biến gen mã hóa CYP2D6 đã được phát hiện. 2. Tìm hiểu về các phương pháp phát hiện đột biến gen CYP2D6. 2 CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CYP2D6 1.1. CYTOCHROM