BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN TIẾN HIỆP TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5-(4’BROMOBEZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN TIẾN HIỆP TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5-(4’BROMOBEZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS Vũ Trần Anh PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa hữu HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS.Vũ Trần Anh, PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải, PGS TS Nguyễn Quang Đạt người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi động viên tơi hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình : Ths Đặng Vũ Lƣơng (phịng NMR-Viện Hóa Học Cơng Nghệ Việt Nam), Nguyễn Thị Sơn (bộ mơn Hóa vật liệu- Khoa Hóa –Trường Đại học Khoa học Tự nhiên), TS Trần Thị Nhƣ Hằng (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên) tồn thể thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa hữu cơ, thầy giáo trường, phòng ban, thư viện-Trường Đại học Dược Hà Nội Cuối tơi, xin cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, Ngày 13 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Tiến Hiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDANTOIN 1.1.1 Tác dụng chống co giật 1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 1.1.3 Tác dụng chống ung thư 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP 5-(4'- BROMOBENZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ CÁC BASE MANNICH ….9 1.2.1 Phản ứng tổng hợp 5-arylidenhydantoin 10 1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất base Mannich…………………………….13 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUN VẬT LIỆU, HĨA CHẤT, DUNG MƠI 15 2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 16 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Phương pháp tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin dẫn chất base Mannich 16 2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc 17 2.2.3 Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thư 17 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 20 3.1.1 Tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin (H0) 21 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất base Mannich 5-(4’bromobenzyliden)hydantoin (H1-H 6) 22 3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƢỢC 27 3.2.1 Phổ hồng ngoại 27 3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 27 3.2.3 Phổ khối lượng 27 3.3 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ 27 CHƢƠNG BÀN LUẬN 4.1 VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC 36 4.2 VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƢỢC 4.2.1 Về phổ hồng ngoại (IR) 36 4.2.2 Về phổ cộng hưởng tử hạt nhân 1H-NMR 37 4.2.3 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13 C- NMR H- NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton A549 : Tế bào ung thư phổi người Ac2O : Anhydrid acetic AcOH : Acid acetic DMF : Dimethylformamid EGFR : Epidermal growth factor receptor (thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô) EtOH : Ethanol ESI : Phương pháp phun mù điện tử Hep- G2 : Tế bào ung thư gan người HMBC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) HSQC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single-Quantum coherence) IC50 : Nồng độ ức chế 50% IR : Phổ hồng ngoại MCF7 : Tế bào ung thư biểu mô vú người MeOH : Methanol MS : Khối phổ (Mass spectrometry) PC3 : Tế bào ung thư tuyến tiền liệt DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU BẢNG TRANG Bảng 3.1 kết tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin dẫn 29 chất base Mannich (H1-H6) Bảng 3.2 Số liệu phổ IR phổ 1H-NMR chất tổng hợp 30 (H0-H6) Bảng 3.3 Số liệu phổ 13C-NMR chất tổng hợp (H0-H6) 31 Bảng 3.4 Số liệu phổ ESI_MS chất H0 dẫn chất base Mannich 32 (H1-H6) Bảng 3.5 Kết thử tác dụng chất tổng hợp số 34 dòng tế bào ung thư người (theo phương pháp SRB) Bảng 3.6 Kết xác định giá trị IC50 (µg/ml) số chất tổng hợp 35 dòng tế bào Hep G2 (theo phương pháp SRB) Bảng 4.1 Các tương tác 1H-13C 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin 42 Bảng 4.2 Các tương tác 1H-13C 5-(4’-bromobenzylden)-3- 45 pyrrolidinomethylhydantoin (H6) DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ HÌNH TRANG Hình 4.1.1 Phổ tương tác HSQC chất H0 40 Hình 4.2.1.Phổ tương tác HMBC chất H0 41 Hình 4.6.1 Phổ HSQC hợp chất H6 43 Hình 4.6.2 Phổ HMBC hợp chất H6 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chiến chống lại bệnh tật, người khơng ngừng tìm tịi, nghiên cứu để phát ngày nhiều loại thuốc có hiệu phịng điều trị bệnh Thuốc tìm có nhiều nguồn gốc khác nhau, thuốc tạo phương pháp tổng hợp bán tổng hợp đóng vai trị quan trọng Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tao thuốc mới, nhà nghiên cứu thường dựa cấu trúc chất dùng làm thuốc chất có hoạt tính sinh học có triển vọng để tạo chất dự đóan có tác dụng tốt hơn, độc tính có hiệu điều trị Các dẫn chất hydantoin dãy chất quan tâm nghiên cứu tổng hợp hóa học, tác dụng sinh học ứng dụng rộng rãi làm thuốc Một số dẫn chất hydantoin dùng rộng rãi lâm sàng phenytoin (thuốc chống động kinh), nitrofurantoin (thuốc kháng khuẩn), dantrium (thuốc giãn vân), nilutamid (thuốc điều trị ung thư tuyến tiền liệt di căn) [19] Trong năm qua, tìm thấy nhiều dẫn chất 5-arylidenhydantoin thiên nhiên tổng hợp có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, có tác dụng chống ung thư đáng quan tâm [1], [5], [7], [8], [15], [20] Để tiếp tục góp phần nghiên cứu, tìm kiếm dẫn chất 5-arylidenhydantoin có tiềm hoạt tính chống ung thư, chúng tơi thực khóa luận với mục tiêu sau Tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin số dẫn chất base Mannich Thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào số dòng tế bào ung thư người chất tổng hợp CHƢƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDANTOIN Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) hợp chất hữu A.Bayer phát năm 1861[29] phản ứng hydro phân (hydrogenolysis) allantoin ( chất phát túi dịch niệu (the allantoin fluid) bị cái), nguồn gốc tên hydantoin Sau đó, năm 1864, A.Bayer [30] tổng hơp hydantoin với nguyên liệu đầu bromoacetylure Tuy nhiên cấu trúc vòng hydantoin xác dịnh Strecker vào năm 1873 [31] O NH N H O Hydantoin Bản thân hydantoin tác dụng sinh học, nhiên nhiều cơng trình nghiên cứu tổng hợp thử tác dụng sinh học cho thấy dẫn chất hydantoin có tác dụng phong phú đa dạng thuốc chống động kinh, kháng khuẩn, chống ung thư [1], [3], [4], [8], [11], Các dẫn xuất vị trí N1, N3, đặc biệt lần vị trí C5 nghiên cứu cho thấy tác dụng sinh học đáng ý 1.1.1 Tác dụng chống co giật Dẫn chất hydantoin dùng nhiều điều trị 5,5diphenylhydantoin (phenytoin) (1), biệt dược Dilantin (biệt dược Parke-Davis), Epanutin (biệt dược Pfizer) [3],[9] H N O NH O O Br N CH2 NH H C N H CH3 O Phụ lục 6.6: Phổ MS chất H5 BO MON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Nguoi do: Nguyen Thi Son Resolution: 4c m-1 Mail: sonhuco@yahoo.com Date: 4/21/2014 DT: 0912140352 MAU H6 100.0 95 90 85 1585 2971 2821 2940 80 1072 3280 3214 75 1489 1384 1364 1257 1307 70 1154 1006 993 834 730 877 785 704 815 765 666 65 60 1435 55 1333 1416 50 1767 %T 45 1660 40 35 30 O 25 20 N H C Br N H 15 10 CH2 N 1713 O 0.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 Phụ lục 7.1: Phổ IR hợp chất H6 1200 1000 800 600.0 O Br N CH2 N H C N H O Phụ lục 7.2: Phổ 1H-NMR chất H6 O Br N CH2 N H C N H O Phụ lục 7.3: Phổ 13C-NMR chất H6 O Br N CH2 N H C N H O Phụ lục 7.4: Phổ HSQC chất H6 O Br N CH2 N H C N H O Phụ lục 7.5: Phổ HMBC chất H6 O Br N CH2 N H C N H Phụ lục 7.6: Phổ MS chất H6 O VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HỐ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN Phịng Sinh học thực nghiệm Vietnamese Academy of Science and Technology, Hanoi, Vietnam (VAST) Institute of Natural Products Chemistry (INPC) The Bioassay Lab 18 Hoàng quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội- Việt Nam Tel: 844-8361899; Fax: 844-7564390; Email: sinhocthucnghiem@yahoo.com Số: /TLKQ PHIẾU TRẢ LỜI KẾT QUẢ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO (CYTOTOXICITY ASSAY) Người gửi mẫu: Trần Anh Địa chỉ: Bộ môn Hóa Hữu – Đại học Dược Hà Nội Số lượng mẫu: 35 Loại mẫu: Mẫu tinh Ngày nhận mẫu: 17/04/2014 Ngày trả lời kết quả: 06/05/2014 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Theo phƣơng pháp Skehan & CS (1990) Likhiwitayawuid & CS (1993) đƣợc áp dụng Viện nghiên cứu ung thƣ Quốc gia Mỹ (NCI) trƣờng đại học Dƣợc, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ Dòng tế bào - MCF 7: Human Breast adenocarcinoma (Ung thƣ biểu mô vú) PC 3: Prostate cancer (Ung thƣ tuyến tiền liệt) Hep G2: Human Hepatocellular carcinoma (Ung thƣ gan ngƣời) Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (PenixillinStreptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum) Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic Các dụng cụ dùng lần: Bình ni cấy tế bào, phiến vi lƣợng 96 giếng, pipet pasteur, đầu tuýp cho micropipet… Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine Taxol pha DMSO - Đọc máy ELISA bƣớc sóng 495-515nm Tính kết quả: Giá trị CS (Cell Survival): khả sống sót tế bào nồng độ chất thử tính theo % so với đối chứng Dựa kết đo đƣợc chúng OD (ngày 0), DMSO 10% so sánh với giá trị OD trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo cơng thức: OD (mẫu) – OD (ngày 0) CS% = x 100 OD (DMSO) – OD (ngày 0) Giá trị CS% sau tính theo cơng thức trên, đựơc đƣa vào tính tốn Excel để tìm % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn phép thử đƣợc lặp lại lần theo công thức Ducan nhƣ sau: Độ lệch tiêu chuẩn   (xi - x )2  = n-1 Các mẫu có biểu hoạt tính (CS < 50%) đƣợc chọn để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50 Giá trị IC50 : dùng giá trị CS 10 thang nồng độ, dựa vào chƣơng trình Table curve theo thang gía trị logarit đƣờng cong phát triển tế bào nồng độ chất thử để tính giá trị IC50 Cơng thức: 1/y=a+blnX Trong Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%) KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM STT Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu (g/ml) Dòng tế bào Hep-G2 MCF7 100,00,0 DMSO Kết luận Cell survival (%) 100,00,0 PC3 100,00,0 Dương tính Chứng (+) 0,20,03 1,50,2 AN1 77,630,7 82,30,4 84,70,6 Âm tính AN2 60,10,5 78,41,2 79,51,4 Âm tính AN3 49,30,9 69,30,7 85,31,2 Dương tính với dòng Hep G2 AN4 83,71,2 73,21,3 91,50,4 Âm tính AN5 52,80,4 82,30,4 82,60,7 Âm tính H0 62,31,1 78,50,7 86,30,5 Âm tính H1 44,20,5 73,70,9 81,71,2 Dương tính với dịng Hep G2 H2 25,30,6 78,91,4 96,81,1 Dương tính với dịng Hep G2 H3 34,81,4 88,10,7 92,50,8 Dương tính với dòng Hep G2 10 H4 24,80,7 86,80,5 91,21,3 Dương tính với dịng Hep G2 11 H5 54,70,9 85,21,5 91,40,5 Âm tính 12 H6 9,81,2 71,70,5 92,31,4 Dương tính với 2,50,08 dịng Hep G2 13 T1 90,10,7 92,40,9 86,30,7 Âm tính 14 T2 47,10,7 81,61,3 84,21,1 Dương tính với dịng Hep G2 15 T3 62,10,4 94,31,2 96,51,6 Âm tính 16 T4 83,30,9 80,40,6 99,20,8 Âm tính 17 T5 99,21,5 82,61,1 65,30,6 Âm tính 18 T6 71,50,8 80,20,9 71,20,9 Âm tính 19 T7 20,50,6 73,10,6 90,51,3 Dương tính với dịng Hep G2 20 T8 65,30,9 71,21,1 95,61,1 Âm tính 21 T9 71,21,2 86,30,4 91,20,7 Âm tính 22 T10 93,20,5 82,51,3 64,20,4 Âm tính 23 T11 64,60,0 76,50,9 92,50,9 Âm tính 24 T12 48,30,6 75,80,9 85,71,2 Dương tính với dòng Hep G2 25 T13 81,90,8 86,40,5 93,81,6 Âm tính STT Dịng tế bào Giá trị IC50 (g/ml) Ký hiệu mẫu Kết luận Hep-G2 MCF7 PC3 Chứng (+) 0,24 0,31 0,26 AN3 4,95 >5 >5 Dương tính với dòng Hep G2 H1 4,54 >5 >5 Dương tính với dịng Hep G2 Dương tính H2 2,89 >5 >5 Dương tính với dịng Hep G2 H3 3,73 >5 >5 Dương tính với dịng Hep G2 H4 2,84 >5 >5 Dương tính với dịng Hep G2 H6 1,59 >5 >5 Dương tính với dịng Hep G2 T2 4,66 >5 >5 Dương tính với dịng Hep G2 T7 3,22 >5 >5 Dương tính với dịng Hep G2 T12 4,72 >5 >5 Dương tính với dòng Hep G2 Ký hiệu STT Nồng độ mẫu mẫu (g/ml) Kết luận DMSO Chứng (+) Dòng tế bào PC Cell survival (%) 100,00,0 2,50,08 Dƣơng tính II 90,61,6 Âm tính IIa 84,70,9 Âm tính IIb 95,31,2 Âm tính IIc 91,70,6 Âm tính IId 78,30,7 Âm tính III 96,40,9 Âm tính IIIa 94,71,2 Âm tính IIIb 98,30,6 Âm tính IIIc 75,11,1 Âm tính 10 IIId 82,60,4 Âm tính Xác nhận Viện Phụ trách phòng TS Đỗ Hữu Nghị Ngƣời đọc kết Trần Thị Hồng Hà ... hai dịng tế bào ung thư người (tế bào ung thư biểu mô (KB) tế bào ung thư màng tử cung (FL)) dãy chất 5- (5? ??-nitro-2’-furfurliden )hydantoin dẫn chất base Mannich Kết tìm hai chất 5- (5- nitro-2’furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion... (s;1H;N3-H); 6,377 17 35 Giá trị khác 10 ,58 6 (s;1H;N1H); 7 ,56 7 (m;4H;H2’,3’ ,5? ??,6’) N CH2 N O 1768 1713 2 950 6 ,51 1 4, 355 2940 6,487 4,344 7 ,59 7 (m;4H;H2’,3’ ,5? ??,6’); 3 ,54 1 (m,4H;H3’’ ,5? ??’); 2 ,50 (m;4H;H2’’,6’’)... (C3’’ ,5? ??’); 113,7 75 (C2’’,6’’); 55 ,2 05 (OCH3); 48 ,54 7 (NCH2N) 106,43 1 65, 369 155 ,693 1 35, 139(C1’); 133,648(C4’); 129,017(C5); 128, 25( C2’,6’); 61,469(NCH2N); 54 ,2 05 (C3’’ ,5? ??’); 49,970 (C2’’,6’’); 40,090