BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRƢƠNG MINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG GIẢM LO LẮNG, CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA MẠN KINH TỬ ( VITEX TRIFOLIA L ) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS Phạm Nguyệt Hằng ThS Phạm Thái Hà Văn Nơi thực hiện: Viện dược liệu – Việt Nam Bộ môn Dược học cổ truyền – trường đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: Tổng quan 1.1 Thông tin chung 1.1.1 Vị trí phân loại chi Vitex 1.1.2 Đặc điểm chung chi Vitex 1.1.3 Đặc điểm loài Vitex trifolia L 1.1.4 Hội chứng mãn kinh 1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dƣợc lý Mạn kinh ( Vitex trifolia L.) 1.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 1.2.2 Nghiên cứu tác dụng dược lý 10 1.3 Công dụng theo y học cổ truyền 13 Chƣơng 2: Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.1 Đối tƣợng 16 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Nguyên vật liệu trang thiết bị nghiên cứu 16 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.2.1.Vi học 17 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 17 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng dược lý 18 2.2.4 Xử lý số liệu 20 Chƣơng 3: Kết bàn luận 21 3.1 Đặc điểm vi học mạn kinh tử 21 3.1.1 Đặc điểm vi phẫu 21 3.1.2 Đặc điểm bột dược liệu 21 3.2 Thành phần hóa học mạn kinh tử 23 3.2.1 Tinh dầu 23 3.2.2 Định tính nhóm chất hữu khác mạn kinh tử 23 3.2.3 Định tính phương pháp sắc kí lớp mỏng 29 3.3 Tác dụng cao chiết cồn 90 ° mạn kinh tử hành vi lo lắng cải thiện trí nhớ/nhận thức 31 3.3.1 Tác dụng cao chiết cồn mạn kinh tử hành vi lo lắng 31 3.3.2 Tác dụng cải thiện trí nhớ / nhận thức cao chiết cồn mạn kinh tử 32 3.3.3 Trọng lượng tử cung – vòi trứng 34 3.4 Bàn luận 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .37 LỜI CẢM ƠN Để có thành cơng khóa luận này, lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Nguyệt Hằng – Viện Dược liệu, người thầy, người chị bên cạnh bảo, hướng dẫn giúp đỡ em tận tình thời gian thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn ThS Phạm Thái Hà Văn – Bộ môn Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội – người thầy ln hết lịng giúp đỡ, tạo điều kiện đóng góp ý kiến quý báu để em hồn thành tốt khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị Bộ môn Dược học cổ truyền – trường đại học Dược Hà Nội Khoa Khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu động viên giúp đỡ em vật chất lẫn tinh thần để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Đảng ủy nhà trường toàn thể thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội trang bị đầy đủ kiến thức động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè chỗ dựa tinh thần, nguồn động viên to lớn em sống học tập Hà Nội, tháng năm 2014 Sinh viên Trương Minh Phương DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DĐVN: Dược điển Việt Nam Dl: Dược liệu EtOH: Ethanol EtOAc: Ethyl acetat IC50: Nồng độ ức chế mức 50% LC50: Nồng độ gây chết mức 50% MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu Sham: Nhóm chứng sinh lý SKLM: Sắc kí lớp mỏng TT: Thuốc thử UV: Ultra Violet spectroscopy ( Phổ hồng ngoại ) OVX: Mơ hình chuột nhắt phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng bên VT: Cao chiết cồn Vitex trifolia ( mạn kinh tử ) XLC: Xanh XD: Xanh dương XĐ: Xanh đen DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây mạn kinh Vitex trifolia L Hình 1.2 Quả khơ Mạn kinh Vitex trifolia L ( Mạn kinh tử ) Hình 3.1 Đặc điểm vi phẫu Hình 3.2 Đặc điểm bột mạn kinh tử Hình 3.3 Sắc kí đồ tinh dầu mạn kinh tử quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng  = 254nm (a),  = 366nm (b) sau phun TT vanillin (c) Hình 3.4 Sắc kí đồ flavonoid mạn kinh tử quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng  = 254nm (a),  = 366nm (b) Hình 3.5 Biều đồ cột biểu diễn tỷ lệ thời gian chuột cung phần tư đích (%) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số thành phần hóa học Mạn kinh Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất mạn kinh tử phương pháp hóa học Bảng 3.2 Kết định tính SKLM tinh dầu mạn kinh tử Bảng 3.3 Kết định tính SKLM flavonoid từ mạn kinh tử Bảng 3.4 Tác dụng cao chiết cồn mạn kinh tử thử nghiệm đánh giá hoạt động tự nhiên chuột Bảng 3.5 Thời gian tiềm ẩn tìm thấy platform Bảng 3.6 Tác dụng cao chiết cồn mạn kinh tử trọng lượng tử cung – vòi trứng chuột OVX ĐẶT VẤN ĐỀ Mạn kinh tử vị thuốc thuộc danh mục vị thuốc thiết yếu thuốc y học cổ truyền Theo kinh nghiệm dân gian, mạn kinh tử có tác dụng phát tán phong nhiệt, sử dụng điều trị cảm cúm, đau đầu, đau mắt… Ở số nước Châu Á Thái Lan, Ấn Độ, Indonexia, Trung Quốc, mạn kinh tử sử dụng phổ biến điều trị số bệnh đau đầu, chóng mặt, tối tăm mặt mũi, hen suyễn… Sự phát triển khoa học kĩ thuật tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển y học đại Những kinh nghiệm sử dụng vị thuốc, thuốc Mạn kinh tử dân gian làm sáng tỏ y học đại qua cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng dược lý chúng Mạn kinh tử vị thuốc sử dụng phổ biến theo kinh nghiệm dân gian nhiều nước, đặc biệt nước Châu Á Do có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng dược lý Mạn kinh tử phần chứng minh kinh nghiệm sử dụng điều trị bệnh theo kinh nghiệm dân gian Theo y học đại, Mạn kinh tử có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng số dòng tế bào ung thư, làm lành vết thương, có hoạt tính chống viêm, giảm đau, kháng Histamin… Tuy nhiên chưa thấy có nghiên cứu chứng minh tác dụng phụ nữ giai đoạn mãn kinh Để góp phần nâng cao giá trị sử dụng Mạn kinh tử, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng giảm lo lắng, tăng trí nhớ Mạn kinh tử ( Vitex trifolia L )” theo mục tiêu sau: Xác định nhóm chất hóa học Mạn kinh tử Thử nghiệm tác dụng giảm lo lắng , tăng trí nhớ Mạn kinh tử mơ hình OVX Chƣơng 1: Tổng quan 1.1 Thơng tin chung 1.1.1 Vị trí phân loại chi Vitex Cây Mạn kinh thuộc chi Vitex, chi thuộc họ Cỏ roi ngựa Verbenaceae Vị trí chi Vitex hệ thống phân loại thực vật tóm tắt sau [5]: Giới: Plante Ngành: Mangnoliophyta Lớp: Magnoliapsida Phân lớp: Lamiidae Bộ: Lamiales Họ: Verbenaceae Chi: Vitex L Mạn kinh cịn có tên gọi Quan âm, Đẹn ba lá, Từ bi biển, Vạn kim tử, Mác nim (Tày), Indian wild pepper (Anh)… 1.1.2 Đặc điểm chung chi Vitex Chi Vitex có khoảng 150 lồi phân bố khắp vùng nhiệt đới nhiệt đới châu Á, châu Phi châu Mỹ; có số lồi vùng ơn đới ấm châu Âu châu Á Ở Malyasia có khoảng 30 lồi, Ấn Độ có 30 lồi Ở Việt Nam có 14 lồi, có – loài dùng làm thuốc [11] Những loài thuộc chi Vitex gỗ hay bụi Cành non vuông hay trịn, nhẵn hay có lơng Lá mọc đối, kép, chân vịt, thướng 1- - - chét, có mép nguyên hay xẻ cưa Cuống thường trịn, có rãnh phía hay có cánh Cụm hoa đỉnh cành hay nách phía đỉnh cành; gồm xim ngả ngả hợp thành hình chùy, hình tháp hay hình ngù Lá bắc nhỏ tồn hay sớm rụng Đài hình chng, hình chén hay hình ống, có thùy ngắn, cụt Tràng có ống ngắn, thẳng hay hình phễu, môi: môi thùy, môi thùy với thùy lớn Nhị 4, thường dài, ngắn thụt vào hay thò khỏi ống tràng; nhị nhẵn hay có lơng phía dưới, đỉnh ống tràng; bao phấn ô thường dăng Bầu – ơ, – nỗn, vịi nhụy nhỏ, đỉnh xẻ thùy Quả hạch gần hình cầu hay hình trứng, nang đài tồn tại, vỏ hóa gỗ cứng, vỏ nạc, thường chứa 1– hạt [10] Một số loài thuộc chi Vitex : Vitex trifolia L., Vitex rotundifolia L., Vitex negundo L., Vitex agnus – catus L.,… 1.1.3 Đặc điểm loài Vitex trifolia L Hình 1.1 Cây Mạn kinh Vitex trifolia L 1.1.3.1 Đặc điểm thực vật - Cây nhỏ hay bụi, mùi thơm, cao tới 3m Cành non có cạnh, có lơng mềm, mầu xám nhạt; cành già tròn, nhẵn, màu nâu - Lá kép mọc đối, chét (lá có hoa thường đơn), phiến chét hình trứng, gốc trịn, đầu tù nhọn, mép nguyên, mặt nhẵn đen lại khô, mặt phủ đầy lông trắng, chét lớn chét hai bên, gân không rõ; vị có mùi thơm; cuống gầy, trịn, có lơng, dài 13cm, chét khơng có cuống Hoa màu lơ nhạt dài 13 – 14 mm - Cụm hoa chùy tận cùng, có gốc, có lơng dày; mang nhiều xim mọc đối, xim có 2-3 hoa màu tím nhạt lam nhạt; bắc nhỏ, 29 Chú thích: (-) phản ứng âm tính, (+) phản ứng dương tính Nhận xét: Ngồi tinh dầu, mạn kinh tử cịn chứa flavonoid, alkaloid, acid hữu 3.2.3 Định tính phương pháp sắc kí lớp mỏng 3.2.3.1 Tinh dầu  Chuẩn bị dịch chấm sắc kí: 1giọt tinh dầu pha lỗng 1ml ether dầu hỏa ( 60 – 90 )  Bản mỏng: Silicagel G hoạt hóa 100ºC khoảng  Dung môi khai triển: ether dầu hỏa – EtOAc ( 9/1 ) [8]  Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng  = 366 nm  Hiện màu: dung dịch vanilin 1% acid sulfuric ( TT ), sấy mỏng 110ºC 10 phút Kết quả: Theo Bảng 3.2 c b a  Khi chưa phun thuốc thử: - Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng  =254nm : có 10 vết ( Rf = 1, 5, 7,21,23, 27, 33, 39, 55, 60 ) - Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng  =366nm : có vết ( Rf = 1, 5, 7,21,23, 27, 33, 39 )  Sau phun TT vanillin 1% quan sát ánh sáng thường: có 10 vết ( Rf = 1, 5, 7,21,23, 27, 33, 39, 55, 60 ) Hình 3.3 Sắc kí đồ tinh dầu mạn kinh tử quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng  = 254nm (a),  = 366nm (b) sau phun TT vanillin (c) 30  Trong vết, nhận thấy số vết đáng ý: - Vết ( Rf×100 = 55) vết 10 ( Rf×100 = 60) quan sát UV254nm mà không quan sát UV 366nm, màu vàng nâu nâu sau phun TT vanilin 1% ( quan sát ánh sáng thường ) - Vết ( Rf×100 = 27) màu rõ nhất, UV254nm UV366nm, màu xanh đen sau phun TT vanillin 1% ( quan sát ánh sáng thường ) Bảng 3.2 Kết định tính SKLM tinh dầu mạn mạn kinh tử STT Rf ×100 Màu sắc UV254nm UV366nm Hiện màu Xanh +++ XD +++ Nâu XĐ ++++ XD +++ Nâu Xanh ++ XD +++ Nâu 21 Xanh + XD +++ Xanh đen 23 XD ++ Nâu 27 XD ++++ XD ++++ Xanh đen 33 XĐ +++ XĐ + Vàng nâu 39 XĐ ++ XĐ ++ Tím 55 XĐ +++ Vàng nâu 10 60 XĐ ++++ Nâu Xanh đậm ++++ Ghi chú: +: mờ; ++: mờ; +++: rõ; ++++: rõ 3.2.3.2 Flavonoid  Chuẩn bị dịch chấm sắc kí: dịch chiết cồn 90º mạn kinh tử  Bản mỏng: Silicagel G hoạt hóa 100ºC khoảng  Dung môi khai triển: Toluen : EtOAc : acid formic ( / 4,5 /1)  Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng  = 254nm,  = 366 nm 31 Kết quả: Bảng 3.3 Kết định tính SKLM flavonoid b a từ mạn kinh tử Màu STT Rf×100 1 30 41 XĐ ++ XLC ++++ 48 XĐ +++ XD ++++ UV254nm UV366nm XĐ +++ XD +++ Đen + Ghi chú: +: mờ; ++: mờ; +++: rõ; ++++: rõ - Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng  =254nm: có vết ( Rf = 1, 41, 48 ) - Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng Hình 3.4 Sắc kí đồ flavonoid từ mạn kinh tử quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng  = 254nm (a),  =366nm (b)  =366nm : có vết ( Rf = 1, 30, 41, 48) 3.3 Tác dụng cao chiết cồn 90º mạn kinh tử hành vi lo lắng cải thiện trí nhớ/nhận thức 3.3.1 Tác dụng cao chiết cồn mạn kinh tử hành vi lo lắng Đánh giá tác dụng giảm lo lắng phương pháp theo dõi khả vận động chuột máy đếm hồng ngoại Kết bảng 3.4 cho thấy khơng có khác biệt khả vận động đạt ý nghĩa thống kê nhóm OVX so với nhóm Sham OVX + VT (1,6 g/kg ) OVX + progynova Tuy nhiên, giảm khả vận động nhóm OVX + VT ( 3,2 g/kg ) so với nhóm OVX, đạt ý nghĩa thống kê ( p < 0,05 ) 32 Bảng 3.4 Tác dụng cao chiết cồn mạn kinh tử thử nghiệm đánh giá hoạt động tự nhiên chuột Lơ thí nghiệm N Liều (g/kg) Thời gian vận động (s) Sham 10 - 119,25 ± 7,15 OVX 11 - 120,01 ± 6,39 OVX + VT 11 1,6 111,48 ± 8,14 OVX + VT 11 3,2 104,29 ± 8,45* OVX + Progynova 11 0,0005 117,71 ± 11,61 *: p < 0,05 so với nhóm OVX 3.3.2 Tác dụng cải thiện trí nhớ/nhận thức cao chiết cồn mạn kinh tử  Đánh giá thời gian tiềm ẩn tìm thấy platform: Bảng 3.5 Thời gian tiềm ẩn tìm thấy platform Thời gian tiềm ẩn tìm thấy platform (s) Lơ thí nghiệm Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Sham 33,1±2,6 27,4±4,4 23,7±4,1 17,7±3,9* 15,0±2,5** 15,8±3,0** 14,3±2,5** OVX 35,7±3,2 35,5±5,3 32,4±5,3 32,6±5,6 27,3±7,0 28,8±7,9 23,7±4,7* 31,8±4,8 24,3±2,9 33,4±4,7 28,3±1,6 25,8±2,4 20,7±9,0* 21,0±3,4 37,6±3,6 23,2±3,1 25,0±4,6 26,4±4,4 20,6±4,2 18,6±3,2 18,8±3,7* 30,9±3,6 26,9±3,2 28,2±3,0 25,4±4,1 23,6±4,9* 23,2±4,9 19,2±5,8* OVX + VT 1,6 g/kg OVX + VT 3,2 g/kg OVX + Progynova Thời gian tiềm ẩn (giây) *: p < 0,05; **: p < 0,01 so với ngày nhóm 50.0 Sham OVX OVX + Progynova OVX + VT 1,6 g/kg OVX + VT 3,2 g/kg 40.0 30.0 20.0 10.0 Ngày 0.0 33 Ở tập khơng có platform: chuột nhóm khác có khả tìm thấy platform nằm mặt nước cm, với thời gian tiềm ẩn ngắn dần ngày luyện tập Ở nhóm Sham, giảm thời gian tiềm ẩn có ý nghĩa thống kê từ ngày thứ đến ngày thứ ( p < 0,01; p < 0,05 ) Thời gian tiềm ẩn nhóm OVX giảm qua tập, nhiên cần thời gian dài để tìm thấy platform so với nhóm Sham (p < 0,05 ngày thứ 7) Thời gian tiềm ẩn nhóm OVX + VT OVX + Progynova rút ngắn từ ngày thứ qua ngày tập (p < 0,05 ngày thứ 7) Nếu so sánh thời gian tiềm ẩn để tìm thấy platform nhóm ngày thứ 7, kết cho thấy nhóm Sham, OVX + VT OVX + Progynova có thời gian tiềm ẩn để tìm thấy platform ngắn nhóm OVX  Tỷ lệ thời gian chuột cung phần tư đích ( % ) Sau ngày luyện tập, đến ngày thứ 8, chuột đánh giá khả củng cố lại trí nhớ Tỷ lệ thời gian chuột cung phần tƣ đích (%) 50 40 Sham a â * * 30 * * 20 10 0 Sham OVX 1,6 3,2 VT (g/kg) 0,005 Progynova (mg/kg) *p