BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ HẢI ĐOAN NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOME RESVERATROL KÍCH CỠ NANO BẰNG PHƢƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ HẢI ĐOAN NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOME RESVERATROL KÍCH CỠ NANO BẰNG PHƢƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Thị Lập Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Sinh Bộ môn bào chế HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc khoá luận tốt nghiệp này, đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến: TS. Nguyễn Thị Lập Ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các chị kỹ thuật viên trong bộ môn Hoá sinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Bào chế đã nhiệt tình giúp đỡ em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những ngƣời đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp này. Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2014 Sinh viên Đỗ Hải Đoan i MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về liposome 3 1.1.1. Khái niệm 3 1.1.2. Thành phần 3 1.1.3. Phân loại 4 1.1.4. Phƣơng pháp bào chế 4 1.2. Tổng quan về resveratrol 8 1.2.1. Công thức hóa học, tính chất lí hóa. 8 1.2.2. Nguồn chứa resveratrol 9 1.2.3. Tác dụng 9 1.2.4. Sinh khả dụng 10 1.2.5. Các biện pháp cải thiện sinh khả dụng của resveratrol 10 1.2.6. Tổng quan các nghiên cứu bào chế liposome resveratrol 11 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.1.1. Nguyên vật liệu 14 2.1.2. Thiết bị 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1. Khảo sát tỉ lệ mol các thành phần trong công thức bào chế liposome RES 15 ii 2.2.2. Đánh giá tiểu phân liposome RES tạo thành qua các thông số 15 2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm 15 2.3.1. Phƣơng pháp chế tạo liposome RES 15 2.3.2. Định lƣợng RES 17 2.3.3. Đánh giá tiểu phân liposome resveratrol tạo thành 18 2.3.3. Phƣơng pháp xử lí số liệu 19 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. KẾT QỦA 20 3.1.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng RES 20 3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ mol các thành phần trong công thức đến KTTP, PDI và hiệu suất liposome hóa 22 3.1.3. Đánh giá liposome tạo thành 27 3.2. NHẬN XÉT, BÀN LUẬN 28 3.2.1. Về phƣơng pháp bào chế 28 3.2.2. Về phƣơng pháp định lƣợng RES 29 3.2.3. Ảnh hƣởng của các yếu tố công thức và quy trình bào chế tới tính chất hệ liposome tạo thành 30 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 34 KẾT LUẬN 34 KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 40 iii DANH MỤC VIẾT TẮT Chol COX 1 COX 2 DMPC DPPC DQA-PEG 2000 - DSPE DSPC EE LDL LUV MLV PBS PDI PEG PL RES SPC SUV Tc VLDL Cholesterol Cyclooxygenase 1 Cyclooxygenase 2 Dimyrisitoyl phosphatidyl cholin Dipalmoyl phosphatidyl cholin Dequalinium polyethylen glycol- distearoylphosphatidylethanolamin Distearoyl phosphatidyl cholin Encapsulation efficiency (hiệu suất liposome hóa) Low-density lipoprotein (lipoprotein tỉ trọng thấp) Large unilamellar vesicle (liposome một lớp loại nhỏ) Multilamellar vesicle (liposome nhiều lớp) Phosphate buffered saline – đệm phosphate Polydispersity index (chỉ số đa phân tán) Polyethylen glycol Phospholipid Resveratrol Soy phosphatidylcholin Small unilamellar vesicle (liposome một lớp loại nhỏ) Nhiệt độ chuyển pha Very-low-density lipoprotein (lipoprotein tỉ trọng rất thấp) iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1 Độ tan của RES trong các dung môi khác nhau 8 2 Nguyên vật liệu 14 3 Độ hấp thụ của dung dịch RES trong môi trƣờng đệm PBS pH 7.4 và Triton 1% tại các thời điểm sau khi pha 20 4 Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ RES trong môi trƣờng đệm PBS pH 7.4 và Triton 1% 21 5 Thành phần công thức bào chế các mẫu khảo sát tỉ lệ mol RES/SPC 22 6 Ảnh hƣởng của tỉ lệ RES/SPC đến kích thƣớc, phân bố kích thƣớc tiểu phân liposome 23 7 Ảnh hƣởng của tỉ lệ RES/SPC đến hiệu suất liposome hóa 23 8 Thành phần CTBC các mẫu khảo sát tỉ lệ mol Chol/SPC 25 9 Ảnh hƣởng của tỉ lệ chol/SPC đến kích thƣớc, phân bố kích thƣớc tiểu phân liposome 25 10 Ảnh hƣởng của tỉ lệ chol:SPC đến hiệu suất liposome hóa 26 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1 Cấu tạo liposome 3 2 Cơ chế hình thành liposome trong phƣơng pháp bốc hơi pha đảo 5 3 Công thức hóa học của resveratrol 8 4 Một số chế phẩm liposome RES trên thị trƣờng 13 5 Quy trình bào chế liposome resveratrol 15 6 Đồ thị sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ RES trong môi trƣờng đệm PBS pH 7.4 và Triton 1% 21 7 Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa các mẫu liposome khảo sát tỉ lệ RES/SPC 24 8 Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa các mẫu liposome khảo sát tỉ lệ chol/SPC 26 9 Hình ảnh chụp TEM của liposome sau khi siêu âm 27 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Resveratrol (RES) là một polyphenol kháng độc tố tự nhiên đƣợc tổng hợp bởi nhiều loại cây nhƣ: nho (Vitis spp.), dâu (Vaccinium spp.), đậu tƣơng (Arachis spp.), cốt khí củ (Polygonum cuspidatum)…, có tác dụng nhƣ hàng rào chống lại nấm, virus, vi khuẩn và tác động của tia UV [32]. Đƣợc phát hiện từ năm 1939. Tuy nhiên, đến đầu những năm 90 của thế kỉ 20, RES mới đƣợc nghiên cứu về tác dụng bảo vệ tim mạch trong “nghịch lí của ngƣời Pháp” (French Paradox) [24]. Từ đó, RES đƣợc quan tâm sâu sắc hơn với các nghiên cứu về các tác dụng có lợi nhƣ bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thƣ, chống lão hóa… [9]. Mặc dù RES có nhiều tác dụng in vitro, tuy nhiên cũng nhƣ nhiều polyphenol tự nhiên khác, RES có sinh khả dụng bị hạn chế bởi hòa tan kém trong dịch sinh học, cũng nhƣ nhanh chóng bị chuyển hóa và thải trừ [38]. Do vậy, cần có chất mang thích hợp để có đƣợc hiệu quả điều trị với liều dùng thấp. Liposome là một chất mang ƣu việt cho mục đích đƣa thuốc vào cơ thể, vì tính thích ứng sinh học, phân hủy sinh học hoàn toàn và có thể mang cả dƣợc chất thân dầu và dƣợc chất thân nƣớc. Hiện nay, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu cũng nhƣ sản xuất chế phẩm liposome RES. Tuy nhiên, ở Việt Nam chƣa có công trình khoa học đƣợc công bố về ứng dụng liposome để làm chất mang RES, mà mới chỉ nghiên cứu tổng hợp RES bằng phƣơng pháp hóa học, hay phân lập từ cây cốt khí củ [3]. Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo liposome resveratrol kích cỡ nano bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo” nhằm mục đích bổ sung thêm thông tin về liposome RES, và bƣớc đầu bào chế đƣợc liposome RES trong điều kiện hóa chất cũng nhƣ thiết bị tại Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu: 2 - Khảo sát đƣợc tỉ lệ mol RES : SPC và chol : SPC trong công thức bào chế liposome resveratrol bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo. - Đánh giá đƣợc tiểu phân liposome RES tạo thành về một số thông số: Kích thƣớc tiểu phân, chỉ số đa phân tán và hiệu suất liposome hóa. [...]... Phƣơng pháp này cho hiệu suất tạo liposome cao, áp dụng đƣợc với nhiều loại PL, nhƣng tạo ra liposome kích thƣớc lớn, dƣợc chất chịu tác động của nhiệt và siêu âm, có thể ảnh hƣởng đến độ bền [1], [6] Hình 2 Cơ chế hình thành liposome trong phƣơng pháp bốc hơi pha đảo [6]  Ngoài ra còn nhiều phƣơng pháp khác nhƣ: Phƣơng pháp hòa tan và thẩm tách chất diện hoạt, phƣơng pháp pha loãng polyol, phƣơng pháp. .. dụng một phƣơng pháp tạo liposome RES khác là phƣơng pháp proliposome, dùng siêu âm để làm nhỏ kích thƣớc tiểu phân [10] Phƣơng pháp này cho hiệu suất liposome hóa không cao (55,88%), kích thƣớc và phân bố KTTP khá lớn (250 nm, PDI 0,25) Một trong những phƣơng pháp cho hiệu suất liposome hóa cao đƣợc ứng dụng để bào chế liposome RES đó là phƣơng pháp bốc hơi pha đảo, chẳng hạn, nghiên cứu của Lu X Y... pháp Batzri và Korn (phương pháp tiêm/ hòa tan ethanol) Hòa tan PL và các thành phần tạo màng vào ethanol Bơm nhanh dung dịch này vào dung dịch KCl 0,1 - 0,2 M (hoặc một dung dịch khác tƣơng đƣơng, ví 5 dụ MgSO4), do thay đổi dung môi sẽ tạo thành các liposome Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome Phƣơng pháp này tạo ra liposome có kích thƣớc không đều [1], [6], [31]  Phương pháp bốc hơi pha. .. giá tiểu phân liposome RES tạo thành qua các thông số - Hiệu suất liposome hóa - Kích thƣớc và phân bố kích thƣớc tiểu phân - Hình thái tiểu phân 2.3 Phƣơng pháp thực nghiệm 2.3.1 Phƣơng pháp chế tạo liposome RES Chế tạo liposome RES theo phƣơng pháp bốc hơi pha đảo [26] Quy trình: PL,chol, RES Hòa tan các thành phần trong dung môi hữu cơ (diethyl ether) Đệm PBS pH 7,4 Siêu âm tạo nhũ tƣơng N/D Cất quay... pháp đông khô, phƣơng pháp vi kênh…[27] 6 Để làm nhỏ kích thƣớc tiểu phân liposome tạo thành, ngƣời ta thƣờng sử dụng các phƣơng pháp nhƣ: Phƣơng pháp đẩy qua màng, phƣơng pháp siêu âm, phƣơng pháp đông chảy… [22]  Phƣơng pháp đẩy qua màng Đẩy qua màng là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất đƣợc dùng để tạo liposome một lớp và kiểm soát kích thƣớc của chúng Trong phƣơng pháp này, hỗn dịch liposome... hợp với một số nghiên cứu bào chế liposome bằng phƣơng pháp hydrat hóa màng film [10],[11],[15] Phƣơng pháp bào chế sử dụng trong nghiên cứu này cho hiệu suất liposome hóa cao hơn các nghiên cứu khác So với phƣơng pháp hydrat hóa, màng film đƣợc sử dụng trong nghiên cứu của Claudia Bonechi và cộng sự cho hiệu suất liposome hóa khoảng 50 % [11], hay nghiên cứu của Bojana D Isailovi´c và cộng sự chỉ... [10] Phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu này cho hiệu suất cao hơn hẳn, từ 80 đến 90%, mẫu cao nhất cho hiệu suất 95.66% (bảng 7), ngoài ra, cả KTTP và PDI của liposome tạo ra trong nghiên cứu cũng thấp hơn đáng kể so với nghiên cứu của Claudia Bonechi và cộng sự (250 nm so với 350 nm)[11] Nếu so sánh với nghiên cứu của Xin Y L và cộng sự [26], sử dụng cùng phƣơng pháp bào chế cũng nhƣ phƣơng pháp làm... màng polycarbonate tạo ra liposome có kích thƣớc gần với kích thƣớc lỗ lọc của màng Phƣơng pháp này hạn chế việc phải loại tạp chất trong sản phẩm tạo thành Ƣu điểm lớn nhất là kích thƣớc và phân bố kích thƣớc thủy phân (KTTP) có độ lặp lại cao giữa các lô mẻ sản xuất [28]  Phƣơng pháp siêu âm Siêu âm là một trong những phƣơng pháp phổ biến để bào chế liposome từ hệ phân tán PL trong pha nƣớc, đƣợc áp... cầu, phân bố kích thƣớc tiểu phân không đều, liposome ít bị phá vỡ, các tiểu phân liposome không bị kết tụ (hình 9) Hình 9 Hình ảnh chụp TEM của liposome sau khi siêu âm 28 3.2 NHẬN XÉT, BÀN LUẬN 3.2.1 Về phƣơng pháp bào chế Trong rất nhiều phƣơng pháp bào chế liposome, phƣơng pháp bốc hơi pha đảo là một trong những phƣơng pháp đơn giản và cho hiệu suất cao [26] Vì hạn chế của phƣơng pháp này là có... chế phẩm tạo thành, chúng tôi đã nghiên cứu và tham khảo nghiên cứu của Ngô Thị Bích Phƣợng [4] quyết định lựa chọn thời gian cất quay là 1,5 h để loại hết dung môi Chúng tôi đã thử bào chế liposome RES bằng phƣơng pháp hydrat hóa màng film sử dụng dung môi ethanol Tuy nhiên, phƣơng pháp này cho hiệu suất liposome hóa không cao, chỉ khoảng 50 – 60 %, kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu bào chế . bằng phƣơng pháp hóa học, hay phân lập từ cây cốt khí củ [3]. Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu tạo liposome resveratrol kích cỡ nano bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo . TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ HẢI ĐOAN NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOME RESVERATROL KÍCH CỠ NANO BẰNG PHƢƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn:. Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ HẢI ĐOAN NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOME RESVERATROL KÍCH CỠ NANO BẰNG PHƢƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI -